VEGF在高成瘤MDCK、Hela細胞裸鼠模型腫瘤中的表達情況

許 瑾，張 蘭，鐘璧歡，黃 婕，楊映雪，喬自林,2,3，楊 琨,2*

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；

2.西北民族大學 生物醫學研究中心 甘肅省動物細胞技術創新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生物醫學研究中心 生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030）

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF），是一種高度特異性促進血管內皮細胞生長的因子，可以有效促進腫瘤細胞的生長以及腫瘤血管的生成[1]?？茖W研究表明，腫瘤血管比正常血管對VEGF敏感[2]。VEGF與血管內皮細胞表面受體結合后通過自分泌及旁分泌調節機制，促進血管內皮細胞分裂增殖，血管內皮通透性增加，使血漿蛋白滲出，為腫瘤生長提供合適的微環境。也有相關研究顯示[3-4]，VEGF在低氧或缺氧條件下，有利于其與腫瘤相關巨噬細胞（TAM）表面受體結合，促進VEGF-A的分泌，進而促進腫瘤血管形成、侵襲及轉移。此外，腫瘤的惡性程度以及不同分化程度也會影響VEGF的作用水平[5]。

MDCK細胞是Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織分離出的呈貼壁生長的上皮樣細胞。MDCK細胞增殖迅速、易培養，對流感病毒敏感且不易發生突變[6]。Hela細胞系是一種常用于腫瘤研究的細胞系，采用人工體外培養方式可以無限繁殖。試驗選取裸鼠為研究對象，裸鼠先天性胸腺依賴性免疫功能缺乏或T、B淋巴細胞功能完全喪失，異種移植不產生排斥反應，并且皮下注射腫瘤細胞系的基因將導致裸鼠成瘤[7]。本次試驗通過HE染色法觀察腫瘤形態學特征；免疫組織SP法化學染色檢測血管內皮生長因子（VEGF）在腫瘤中的分布情況，為探究腫瘤形成機制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

免疫功能缺陷小鼠：每組1 0只，雌性BALB/c裸小鼠4～7周大，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 試劑與儀器

試驗材料：Hela細胞懸液，購自國家實驗細胞資源共享服務平臺；MDCK細胞，購自ATCC細胞庫；VEGF多克隆抗體和免疫組織化學檢測試劑盒（SP-0023），均購自北京博奧森生物技術有限公司；DAB濃縮型顯色試劑盒（DA1010），購自北京索萊寶科技有限公司。

試驗儀器：病理組織切片機和YD-AB2生物組織攤-烤片機，均購自金華市益迪醫療設備有限公司；電熱鼓風干燥箱，購自天津市泰斯特儀器有限公司；顯微鏡拍照系統等。

1.3 方法

1.3.1樣本采集 前期通過注射等量的不同細胞懸液構建裸鼠模型。

高成瘤MDCK細胞裸鼠模型：裸鼠肩胛部位皮下注射200 μl前期項目組經單細胞克隆實驗，克隆出具有高度成瘤性的MDCK細胞懸液。

Hela細胞裸鼠模型：裸鼠肩胛部位皮下注射200 μl Hela細胞懸液。

飼養4個月后，頸椎脫臼法處死后采集其腫瘤等新鮮組織立即置于4%多聚甲醛中固定，長期室溫保存，每隔12小時更換1次固定液。

1.3.2組織包埋 采集組織于4%多聚甲醛中固定1～2個月后，將腫瘤切至體積約1 cm3進行石蠟包埋。包埋好的組織蠟塊低溫儲存。病理組織切片機切片，先進行厚度為20 μm的粗切，待觀察組織完全暴露轉為厚度為5 μm的細切。取細切的組織于組織攤-烤片機中，攤片（溫度45 ℃），后烤片（溫度45 ℃），待組織周圍石蠟與載玻片緊密粘附無水滴（約2 h）即可收片于切片盒中儲存。

1.3.3 HE染色 首先選取組織切片進行烤片45 ℃（15 min），其次依次進行脫蠟至水—蘇木精核染（約2 min）—流水沖洗（10 min）—酸水分化（約2～3 s）—流水沖洗（10 min）—伊紅染色（約4 min）—酒精分化—脫水—透明等一系列步驟，最后使用中性樹脂封片，并觀察。

1.3.4免疫組織SP法化學染色 組織切片經15 min4 5 ℃烤片，再依次進行脫蠟至水、抗原修復（檸檬酸鹽緩沖液-微波熱修復法）、阻斷、滴加A液（封閉用正常山羊血清工作液）、滴加一抗、二抗、濕盒37 ℃孵育、滴加三抗（辣根酶標記鏈霉卵白素工作液）、孵育、DAB顯色、蘇木精復染等一系列操作，最后用中性樹脂封片。其中，阻斷液、A液、二抗、三抗工作液均來自免疫組化SP試劑盒；一抗為兔的多克隆抗體。

2 結果與分析

2.1 腫瘤的形態學觀察

Hela細胞、高成瘤MDCK細胞裸鼠模型中，兩種異源移植瘤的結構相同。選取Hela裸鼠模型中的腫瘤組織進行分析。HE染色后對腫瘤組織學結構觀察，染色結果如圖1所示。圖1A觀察到：裸鼠皮下注射部位形成的腫瘤呈現結節狀，腫瘤邊緣處細胞分布密集，成巢狀，細胞體積較大，胞核大小不一。異源移植瘤中心位置可見壞死情況，大多為崩解碎裂的腫瘤細胞。圖1B觀察到，異源移植細胞形成的腫瘤周圍組織中有較為豐富的血管分布。

圖1 腫瘤HE染色結果觀察

2.2 VEGF在腫瘤中的表達及分布情況

如圖2所示，在異源移植細胞形成的腫瘤中，VEGF在腫瘤生長的周圍組織中陽性表達顯著，腫瘤邊緣細胞次之，腫瘤中心位置的細胞陽性表達最弱。VEGF在腫瘤生長周圍組織以及細胞胞質中表達，細胞核中不表達。注射高成瘤MDCK細胞形成的腫瘤中有淋巴濾泡樣結構的腫瘤細胞灶（如圖2D）；通過圖2C、圖2D對比可知，VEGF在腫瘤生長的周圍組織中含量：圖2C＞圖2D，腫瘤中心部位VEGF在圖2C上呈現強而少的分布，圖2D上表達呈現弱而廣的分布。VEGF分別在Hela細胞、高成瘤MDCK細胞裸鼠模型腫瘤中都存在表達，表達位置相同，但每個結構表達的含量存在差異。

圖2 VEGF蛋白免疫組化染色結果

3 討論

VEGF具有促進血管生成，增強血管細胞壁通透性的功能[8]，腫瘤微環境中VEGF含量的增加有利于腫瘤血管的形成。腫瘤形成后，由于腫瘤細胞周圍沒有新血管，氧氣以及營養物質供給不足，此時腫瘤細胞需要通過擴散的方式獲取營養，因而生長緩慢。當周圍新血管生成后，腫瘤生長所需要的營養物質由血管供給，腫瘤細胞迅速生長繁殖[2]。腫瘤周圍組織以及腫瘤邊緣細胞處VEGF含量的增多，促進腫瘤血管生成，這也就說明了本次試驗中發現VEGF在腫瘤周圍近皮膚側的組織以及腫瘤邊緣均呈現陽性表達的原因。同時，在近皮膚側的組織有血管分布，可能是腫瘤形成并已經進入迅速生長狀態的重要標志，阻斷腫瘤血管的生成可能是抑制腫瘤生長的途徑之一。研究發現，大部分腫瘤細胞也可以分泌VEGF，加快血管內皮細胞增殖速度，為腫瘤細胞的生長提供物質基礎，促進腫瘤進一步形成[9-10]。腫瘤的形成速率以及分化程度都會影響微環境中VEGF的水平[5]，試驗中也發現，高成瘤MDCK細胞裸鼠模型的腫瘤組織中有淋巴濾泡樣結構的腫瘤細胞灶形成，腫瘤內部VEGF的分布廣而弱；Hela細胞裸鼠模型中腫瘤內部的VEGF呈現強而少的分布狀態。VEGF在皮下注射Hela細胞形成的腫瘤近皮膚側的組織含量較高，且血管分布較多，說明皮下注射Hela細胞形成的腫瘤可能主要通過促進微環境中的VEGF以及內部腫瘤細胞分泌的VEGF含量增多來共同促進血管的生成，有利于腫瘤的生長。而注射高成瘤MDCK細胞形成的腫瘤則是通過腫瘤內部細胞分泌的VEGF含量增多以促進血管形成，同時更易形成腫瘤細胞灶，促進腫瘤細胞發生遷移。由此推測出，注射高成瘤MDCK細胞與注射Hela細胞可能具有同等強度的成瘤性，形成腫瘤的惡性程度可能相同，但腫瘤的形成機制可能不同。

4 結論

本實驗通過研究VEGF在MDCK、Hela細胞裸鼠模型腫瘤中的分布情況，以及對腫瘤結構進行分析，發現裸鼠皮下注射部位形成的腫瘤呈現結節狀，高成瘤MDCK細胞裸鼠模型的腫瘤組織中有淋巴濾泡樣結構的腫瘤細胞灶形成，VEGF在腫瘤靠近皮膚側的組織陽性表達顯著，腫瘤邊緣細胞次之，腫瘤中心位置的細胞陽性表達最弱。由此推測，高成瘤MDCK細胞與Hela細胞可能有相同的致瘤性，但兩者成瘤機制可能不同。同時結合VEGF具有促進腫瘤細胞生成、侵襲、轉移等生理學功能，說明該蛋白可能通過改變腫瘤微環境促進腫瘤血管生成，對腫瘤的形成具有一定促進作用，也為研究通過抑制腫瘤新血管的生成阻止腫瘤發生提供理論參考。