解郁化痰法對慢性不可預知溫和刺激法誘導抑郁模型大鼠的治療作用及對海馬區炎性反應、氧化應激損傷的影響※

李瑞芳 牛燕運 劉建平

(1.河北省邯鄲市中醫院藥劑科，河北 邯鄲 056001；2. 河北省邯鄲市中醫院心血管科，河北 邯鄲 056001)

冠心病是指因冠狀動脈血管發生動脈粥樣硬化導致血管腔狹窄而誘發的心臟病，經皮冠狀動脈介入治療術(PCI)是臨床上治療冠心病的主要方法之一，但由于受患者對PCI的不了解及對術后病情恢復情況的擔憂等因素影響，導致部分患者PCI術后常出現焦慮抑郁的情緒，甚至發展為PCI術后抑郁癥，已經成為臨床上亟待解決的問題[1]。目前，西醫臨床對于PCI術后抑郁仍以對癥治療為主，其中氟西汀是臨床上的常用抗抑郁藥，但其藥物不良反應多，臨床應用受到一定限制[2]。近年來，中醫藥以多靶點、多效應、副作用小的特點，在抗抑郁治療方面取得了顯著效果[3-4]。中醫學認為，抑郁的發生與氣郁、痰凝有關，解郁化痰法在治療中風后抑郁癥[5]、失眠抑郁[6]等方面均有很好的臨床療效。為進一步深入探討解郁化痰法治療抑郁的作用機制，我們擬通過慢性不可預知溫和刺激法(CUMS)建立大鼠抑郁模型，觀察解郁化痰丸對抑郁模型大鼠海馬區炎性反應及氧化應激損傷影響，以期為臨床上PCI術后抑郁癥的治療提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)級雌性SD大鼠40只，體質量(200±20)g，飼養于屏障環境，溫度(25±2)℃，濕度(55±10)%，光照周期(12 h/12 h)，購于浙江省實驗動物中心，實驗動物使用許可證編號:SYXK(浙) 2021-0040。

1.2 實驗藥物 解郁化痰丸(藥物組成：夏枯草、白芍各9 g，白芷、羌活、秦艽、茯苓、半夏、葛根、煅牡蠣、菊花各6 g，天麻4.5 g。將上述中藥材按量稱取，在研缽中研磨成粉末狀，并用醋調勻成糊狀，制備成丸劑，所有藥物均購于同仁堂藥房)；氟西汀鹽酸鹽及二甲基亞砜(美國Sigma公司)。

1.3 主要實驗試劑與儀器

1.3.1 試劑 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)試劑盒、反轉錄試劑盒、總RNA抽提的試劑Trizol(日本Takara公司)；白細胞介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8及腫瘤壞死因子α(TNF-α)大鼠酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測試劑盒(美國賽默飛世爾公司)；活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 儀器 FA2004電子天平(北京六一儀器儀表有限公司)；H2050R冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；高溫干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；水浴鍋(上海赫田科學儀器有限公司)；低速離心機及ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾公司)；iMarker全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；ENV-250型曠場測試裝置(武漢一鴻科技有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組及造模[7]將40只SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、氟西汀治療組、解郁化痰丸治療組。除空白對照組外，其余3組均采用CUMS建立抑郁癥模型：依次采用夾尾(使用夾尾鉗夾尾大鼠尾尖1 min)、禁食禁水(禁止飲食和飲水24 h)、潮濕墊料(墊料用水泡濕24 h)、籠具傾斜(在鼠籠下放木塊，使鼠籠傾斜24 h)、異物(在鼠籠中放石磚24 h)及異味(在鼠籠中噴灑30%冰醋酸，保持24 h)方式對大鼠進行刺激，每日進行1項，輪流進行，共連續刺激6周，大鼠出現明顯的活動量下降、攝食量下降、睡眠時間減少、呆滯等行為改變表示造模成功。

1.4.2 給藥 造模結束后，給藥劑量按照人與大鼠的比表面積進行劑量比換算，氟西汀治療組大鼠予氟西汀藥液20 mg/kg灌胃，解郁化痰丸治療組予解郁化痰丸藥液16 mg/kg灌胃，空白對照組和模型組分別予等容積0.9%氯化鈉注射液4 mL/kg灌胃，每日1次，連續灌胃21 d。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 體質量 各組大鼠在灌胃期間每7 d測量1次體質量，評估大鼠體質量變化情況。計算3次平均值。

1.5.2 糖水偏愛實驗[8]各組大鼠在灌胃期間每7 d進行1次糖水偏愛實驗，評估大鼠興趣變化情況。每只大鼠給予1瓶1%的蔗糖水和1瓶飲用水，記錄大鼠在1 h內蔗糖水和飲用水的飲用量，然后依據計算公式計算大鼠對糖水的偏愛程度。大鼠糖水偏愛百分比(%)=蔗糖水消耗體積/(蔗糖水消耗體積+飲用水消耗體積)×100%。計算3次平均值。

1.5.3 曠場實驗[9]各組大鼠在灌胃期間每7 d進行1次曠場實驗，評估大鼠活動量變化情況。使用100 cm×100 cm×40 cm的曠場測試裝置，用白線將地面分成25個方格，每格20 cm×20 cm，四周涂黑，在安靜條件下將大鼠放置于實驗箱中央格內，并觀察5 min內大鼠在中央格的停留時間。計算3次平均值。

1.5.4 強迫游泳實驗[10]各組大鼠在灌胃期間每7 d進行1次強迫游泳實驗，評估大鼠行為絕望狀態。將大鼠放入水浴鍋中進行強迫游泳6 min，記錄大鼠在后4 min內靜止不動的總時間，即為行為絕望狀態時間。計算3次平均值。

1.5.5 海馬區炎癥因子及氧化應激指標 灌胃結束后各組取5只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，分離大鼠大腦海馬區組織，使用勻漿儀勻漿，隨后在4 ℃、12 000 r/min條件下離心，吸取上清液，檢測大鼠海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化應激指標ROS、MAD、SOD及GSH-Px水平，相關操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5.6 海馬區損傷情況 通過檢測海馬區神經元蛋白激酶C(PKC)及肌醇三磷酸(IP3)基因表達情況評估海馬區損傷情況。灌胃結束后各組取5只大鼠，采用頸椎脫臼法處死，分離大鼠大腦海馬區組織，各組取100 mg海馬區組織于液氮中，在研缽中充分粉碎，加入Trizol 1 mL，4 ℃裂解15 min，按照說明書操作提取組織總RNA。用1000 ng的總RNA于PCR儀中進行反轉錄得到互補DNA(cDNA)，反轉錄體系見表1，設置PCR儀參數25 ℃，5 min，42 ℃，1 h，70 ℃，5 min。結束后將cDNA樣品取出，放入多功能酶標儀中檢測cDNA濃度。然后使用ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀進行擴增反應，以β-actin作內參照，采用2-△△CT法分析樣品的相對表達量。PCR引物由美國Invitrogen公司合成，引物序列見表2。

表1 反轉錄體系

表2 引物序列

2 結果

2.1 各組大鼠體質量、糖水偏愛百分比、中央格停留時間及行為絕望狀態時間比較 與空白對照組比較，模型組大鼠體質量降低(P<0.05)，糖水偏愛百分比減小(P<0.05)，中央格停留時間和行為絕望狀態時間均增加(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠體質量均增加(P<0.05)，糖水偏愛百分比均增大(P<0.05)，中央格停留時間和行為絕望狀態時間均減少(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠體質量高于氟西汀治療組(P<0.05)，糖水偏愛百分比大于氟西汀治療組(P<0.05)，中央格停留時間和行為絕望狀態時間均少于氟西汀治療組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠體質量、糖水偏愛百分比、中央格停留時間及行為絕望狀態時間比較

2.2 各組大鼠海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠海馬區IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠海馬區IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α水平比較

2.3 各組大鼠海馬區氧化應激指標ROS、MAD、SOD及GSH-Px水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠海馬區ROS及MAD水平均升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均降低(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠海馬區ROS及MAD水平均降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均升高(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠ROS及MAD水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均高于氟西汀治療組(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠海馬區氧化應激指標ROS、MAD、SOD及GSH-px水平表達情況比較

2.4 各組大鼠海馬區PKC及IP3基因相對表達比較 與空白對照組比較，模型組大鼠海馬區PKC及IP3基因相對表達水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠海馬區PKC及IP3基因相對表達水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠PKC及IP3基因相對表達水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)。見表6。

表6 各組大鼠海馬區PKC及IP3基因相對表達水平情況比較

3 討論

PCI術后抑郁癥發生的原因十分復雜，有研究報道認為PCI術后焦慮抑郁的發生與患者的年齡、學歷、不良生活嗜好、基礎病情況、既往PCI史、手術時長、支架置入數量及醫保報銷情況等有關[14]。PCI術后抑郁癥的發病機制至今也沒有明確的定論，除了單胺假說、受體假說、神經內分泌假說和神經可塑性假說以外，Maes M等[15]還提出了抑郁癥的細胞因子假說，其通過論證發現抑郁癥的發生往往伴隨著中樞神經系統的炎性反應和氧化應激損傷，炎癥因子分泌增多和氧化應激指標平衡失調導致大腦組織持續的慢性損傷，從而引起抑郁癥相關的行為改變。CUMS建立的大鼠抑郁模型就是通過模擬人類生活中的一些不良事件，通過改變大鼠的生活環境、飲食條件及疼痛刺激等方式，給大鼠大腦產生持續的應激，促炎癥細胞因子的釋放，降低腦源性神經營養因子(BDNF)水平，從而導致大鼠出現焦慮抑郁的行為[16]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠體質量降低(P<0.05)，糖水偏愛百分比減小(P<0.05)，中央格停留時間和行為絕望狀態時間均增加(P<0.05)，提示模型組大鼠在飲食、興趣、活動量及行為絕望狀態上均出現了明顯的變化。

海馬區是機體大腦的一個重要區域，能幫助機體進行學習、記憶等，處理日常生活中的短期記憶。在許多結構影像學和病理解剖學中發現，抑郁癥患者會出現以海馬區為主的邊緣結構神經減退等現象，在抑郁癥發病的過程中海馬區的功能嚴重減退，重病者可出現體積明顯減小[17]。炎性反應本是機體對外界環境刺激的一種防御反應，但過度的炎性反應往往會導致機體組織產生損傷，IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α都是臨床上常見的炎癥因子，也是引起大腦海馬區產生損傷的重要誘導因子[18]。氧化應激是體內氧化與抗氧化作用失衡的狀態，氧化應激損傷與機體的衰老及許多病理過程相關，當機體受到有害刺激時會導致體內高活性的自由基如 ROS、MAD等產生過多，一旦超出SOD、GSH-Px等抗氧化酶系統的清除能力，就會導致組織發生氧化應激損傷[19]。PKC廣泛存在于細胞和組織內，正常狀態下無表達，當細胞受到刺激后PKC被激活，并可伴隨Ca2+釋放到細胞膜上，而IP3可以促進細胞內Ca2+的釋放，在激活PKC過程中起重要作用，兩者可作為神經元損傷的定量生化指標[20]。本研究結果顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化應激指標ROS、MAD水平均升高(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均降低(P<0.05)，PKC及IP3基因相對表達水平均升高(P<0.05)，提示模型組大鼠海馬區出現了明顯的炎性反應和氧化應激損傷，并導致海馬區神經細胞出現明顯損傷。

抑郁癥屬中醫學郁證的范疇，認為其發病主要與氣機不暢有關[21]。中醫學認為，肝主疏泄，調情志，情志不遂，導致肝失條達，疏泄失司，肝郁氣滯，又橫逆克犯脾胃，脾失升清，胃失和降，氣機升降失常，水濕津液失于運化敷布，則聚濕成痰，氣郁痰凝，蘊結中焦，導致心神受損，清竅失養，臟腑氣血陰陽失調而成郁證。解郁化痰丸出自清·梁希曾的《疬科全書》，具有解郁化痰的功效，方中半夏枯草清肝散結解郁；白芍養血柔肝斂陰；白芷祛風燥濕活血；羌活、秦艽解表散寒祛風；茯苓滲濕利水寧心；半夏燥濕化痰消痞；葛根升陽解肌除煩；煅牡蠣斂陰潛陽化痰；菊花疏風清熱平肝；天麻行氣活血熄風。上述藥物配伍使用，共奏疏肝理氣解郁、化痰散結安神的功效。氟西汀屬于選擇性5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑，可以阻斷突觸前膜對5-HT的再攝取，延長和增加5-HT的作用時間，從而產生抗抑郁作用[22]。本研究結果顯示，與模型組比較，氟西汀治療組和解郁化痰丸治療組大鼠體質量均增加(P<0.05)，糖水偏愛百分比均增大(P<0.05)，中央格停留時間和行為絕望狀態時間均減少(P<0.05)，海馬區炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平及氧化應激指標ROS、MAD水平均降低(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均升高(P<0.05)，PKC及IP3基因相對表達水平均降低(P<0.05)，且解郁化痰丸治療組大鼠體質量、糖水偏愛百分比、中央格停留時間及行為絕望狀態時間改善均優于氟西汀治療組(P<0.05)，海馬區IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、ROS、MAD水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)，SOD及GSH-Px水平均高于氟西汀治療組(P<0.05)，PKC及IP3基因相對表達水平均低于氟西汀治療組(P<0.05)。提示氟西汀和解郁化痰丸兩者對抑郁模型大鼠均有確切的治療作用，可明顯改善大鼠的飲食、興趣、活動量及行為絕望狀態，抑制海馬區炎性反應和氧化應激損傷，減輕海馬區神經細胞損傷，其中解郁化痰丸的治療效果更佳。

綜上所述，解郁化痰法可以有效緩解抑郁模型大鼠的抑郁行為，增加體質量，其作用機制可能與抑制大鼠海馬區炎性反應，提高抗氧化能力，減輕氧化應激損傷有關，從而起到保護神經細胞，改善抑郁癥狀的作用，為臨床上PCI術后抑郁癥的治療提供了新思路。