利膽排石糖漿質量標準研究

李旎，陳撫州

南昌結石病專科醫院，江西 南昌 330001

醫療機構制劑，是我國衛生產業的特色之一，是醫院藥學和藥學服務的重要組成部分［1］。醫療機構中藥制劑是中醫臨床經驗積累的特殊產物,加強中藥制劑質量管理，為醫療機構制劑臨床療效、風險評估、制劑安全使用等研究提供了有效的技術支撐［2］。

利膽排石糖漿為純中藥制劑，是由茵陳、虎杖、人工牛黃、枳殼等制成的糖漿劑，為南昌結石病專科醫院制劑（贛藥制字Z20090054）。具清熱除濕、消炎利膽的功效，用于肝膽管結石、膽囊結石、甲肝黃疸等，經過幾十年的臨床應用，安全穩定，療效確切。制劑原標準以虎杖藥材中大黃素的薄層色譜鑒別及制劑通則中糖漿劑要求為主，為更好地控制制劑質量，現增加對人工牛黃、枳殼藥材的薄層色譜鑒別及制劑中綠原酸的含量測定。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 型液相色譜儀；島津ODS-3 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；超聲波清洗器；分析天平；三用紫外線分析儀；臺式高速離心機。

1.2 試劑與試藥

對照品：膽酸（10078-201415）；新橙皮苷（111857-201804，99.4 %）；柚皮苷（110722-201815，91.7 %）；綠原酸（110753-201817，96.1 %）均來自中國食品藥品檢定研究院。甲醇（20115029），乙腈（21015166）均為色譜純；其他試劑均為分析純。利膽排石糖漿（201111、201112、210623、210624、210625）。

2 薄層色譜鑒別方法與結果

2.1 人工牛黃

用10 mL 量筒量取10 mL 樣品，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL 乙醇，密塞，搖勻，放入超聲儀內，超聲處理30 min，冷卻后搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。采用同法對未添加人工牛黃的樣品進行處理，得陰性對照液。稱取適量的膽酸對照品，加入甲醇，制得濃度為每l mL 含l mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取以上三種溶液各5 μL，點樣于同一硅膠G 薄層板上，以正已烷-乙酸乙酯-甲醇-醋酸（20∶25∶3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，用10 %磷鉬酸乙醇溶液做顯色劑，均勻噴灑，放入恒溫鼓風干燥箱中，于105 ℃加熱至斑點清晰，在日光下觀察色譜情況［3］。色譜圖可見清晰的膽酸斑點，且分離度好，陰性無干擾，見圖1。

圖1 人工牛黃薄層色譜圖：1～3.三批供試品；4.膽酸對照品；5.陰性樣品

2.2 枳殼

用25 mL 量筒量取20 mL 樣品，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL 95%乙醇，密塞，搖勻，放入超聲儀內，超聲處理30 min，冷卻后搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液。采用同法對未添加枳殼藥材的樣品進行處理，制得陰性對照液。稱取適量的新橙皮苷、柚皮苷的對照品，加入甲醇，得濃度為每l mL 各含l mg 的混合溶液，作為混合對照品溶液。分別吸取供上述三種溶液各3 μL，點于同一塊硅膠G 薄層板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水（35∶17∶5）于10 ℃以下放置過夜的下層溶液，展開，取出晾干，均勻噴灑3%三氯化鋁乙醇溶液，放入恒溫鼓風干燥箱中，在100～105 ℃下加熱數分鐘后，于365 nm 紫外燈下觀察色譜情況［4］。在色譜圖中，可見清晰且分離度好的新橙皮苷和柚皮苷的斑點，陰性無干擾，見圖2。

圖2 枳殼薄層色譜圖：1.陰性樣品；2.新橙皮苷和柚皮苷混合對照溶液；3～5.三批供試品

3 含量測定方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱：島津ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A 為乙腈，流動相B 為0.1 %磷酸溶液，梯度洗脫，見表1；檢測波長為327 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣為10 μL。

表1 洗脫程序

3.2 溶液制備

3.2.1 對照品溶液配制 取適量綠原酸對照品，精密稱定，加入50 %甲醇，制成濃度為每1 mL 含綠原酸40 μg 的對照品溶液。

3.2.2 供試品溶液配制 取樣品約5 g，精密稱定，置50 mL 棕色容量瓶中，加入約40 mL 的50 %甲醇，密塞，超聲處理30 min，放冷后，再用50 %甲醇溶液定容至刻度，搖勻后過濾，取續濾液為供試品溶液。

3.2.3 陰性對照溶液配制 照利膽排石糖漿制劑工藝，制備未添加茵陳藥材的陰性樣品，采用“3.2.2”項下方法處理，得陰性對照溶液。

3.3 專屬性試驗

按“3.1”項下色譜條件，分析供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液的測定結果，圖譜表明方法專屬性良好，見圖3。

圖3 綠原酸HPLC色譜圖：A為對照品；B為供試品；C為陰性對照

3.4 線性試驗

以甲醇為稀釋劑對綠原酸對照品儲備液（0.409 8 mg/mL）進行稀釋，分別得濃度為：409.8 μg/mL、81.96 μg/mL、40.98 μg/mL、16.39 μg/mL、8.196 μg/mL 的對照品溶液，按“3.1”項下色譜條件測定。得峰面積（Y）-濃度（X，μg/mL）的回歸方程Y=3.275 24×10-3X-29 311.4，r=0.999 9。表明綠原酸在8.196 μg/mL～409.8 μg/mL 濃度范圍內，線性良好。

3.5 穩定性試驗

按“3.1”項下色譜條件，分別于0 h、2 h、5 h、10 h、12 h、24 h 對同一供試品溶液進樣分析，各時間段綠原酸峰面積RSD 為0.39%。結果可知，24 h內溶液穩定性良好。

3.6 重復性試驗

采用“3.2.2”項下供試品溶液制備方法，對樣品（批號210625）進行前處理，共制備6 份，按“3.1”項下色譜條件測定，測得樣品中綠原酸的平均含量為0.269 5 mg/g，RSD 為2.44 %，重復性符合要求。

3.7 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號210625）6 份各約5 g，精密稱定，分別加入2 mL 濃度為0.658 5 mg/mL 的綠原酸對照品溶液,采用“3.2.2”項下供試品溶液制備方法，按“3.1”項下色譜條件測定，結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果

3.8 樣品的含量測定

采用“3.2.2”項下供試品溶液制備方法，分別將5 批利膽排石糖漿樣品制成供試品溶液，測定制劑中綠原酸的含量，5 批樣品的綠原酸含量范圍為0.269 5 mg/g～0.359 4 mg/g。結果見表3。

表3 樣品的含量測定結果（mg/g）

4 討論

4.1 人工牛黃薄層鑒別摸索

膽酸為人工牛黃的主要成分，且性質比較穩定。薄層鑒別方法摸索中，考察了不同提取溶劑（三氯甲烷、95%乙醇）及不同提取方法（超聲、回流）對色譜結果的影響，發現兩種方法效果均較好，考慮到方法操作簡便性、經濟性和毒性等，選擇以95%乙醇超聲提取的方法［4］。

4.2 枳殼薄層鑒別摸索

現代藥理學研究提示，枳殼主要含揮發油類和黃酮苷類橙皮苷等，具調節胃腸道平滑肌、升血壓、強心、利尿、解熱鎮痛等作用［5］。

試驗中，新橙皮苷和柚皮苷斑點位置相近，容易出現斑點粘連情況，重點摸索展開劑中三氯甲烷的比例，最終得斑點分離情況較好的展開劑為：三氯甲烷-甲醇-水（35∶17∶5），于10 ℃以下放置過夜的下層溶液。

4.3 綠原酸的含量測定

茵陳具有利濕退黃、解毒療瘡的作用，可用于陽黃及陰黃的治療［6］。現代藥理研究顯示，有保肝利膽、退黃利濕、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性，常用于肝膽疾病的治療。其利膽成分主要是綠原酸、對羥基苯乙酮等［7-8］。HPLC 法因其高效、高分辨率等技術優勢，已成為目前控制中藥制劑有效成分的重要手段［9］。故選擇對綠原酸的含量進行檢測，可有效地控制質量，進一步保證藥品療效。通過紫外可見分光光度計對綠原酸對照品溶液波長進行掃描，最大吸收波長與《中國藥典》一致，確定檢測波長為327 nm。由于利膽排石糖漿為較黏稠液體，故選擇以稱重方式稱取樣品進行實驗。

本研究所建立的方法專屬性強、重復性好，可用于利膽排石糖漿的質量控制。