多年生黑麥草細胞分裂素信號通路B 類ARR轉錄因子LpARR10 的耐鎘功能分析

張晴，邢靜，姚佳明，殷庭超，黃心如，何悅，張敬，徐彬

（南京農業大學草業學院，江蘇 南京 210095）

隨著工業的不斷進步，重金屬資源的需求也日益增加，而重金屬礦產資源的大量開采會導致礦區土地和水體遭受不同程度污染，其中重金屬鎘（Cd）是污染最為嚴重及生物毒性最強的元素之一［1］。近幾年，隨著《美麗鄉村建設》和《山水林田湖草生態保護修復工程指南（試行）》政策的推行［2］，重金屬礦區及周邊的土壤治理、植被恢復及園林綠化顯得至關重要。草類是重金屬修復的理想材料，不僅能吸收土壤重金屬元素，還具有環境美化作用。因此，挖掘草類耐鎘基因資源，并通過分子育種手段培育耐鎘新品種具有重要的現實意義。

植物的耐逆反應受細胞分裂素、乙烯、脫落酸和茉莉酸等內源激素的調控［3］。細胞分裂素在植物耐逆反應中起到正調控作用，已有很多研究表明外源或內源增加（過量表達細胞分裂素合成基因ipt）能夠有效提高植物的耐高溫、干旱和高鹽等能力［4-6］。近年來，有研究表明外源細胞分裂素處理也能夠緩解重金屬鎘對植物造成的損傷［7-8］。例如，在鎘脅迫下，外部噴施6-BA 提高了玉米（Zea mays）幼苗體內葉綠素和脯氨酸的含量，促進了葉片過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性的升高，并增加了玉米幼苗生物量［7］。另外，Gemrotová 等［8］的研究結果表明，在鎘脅迫條件下，細胞分裂素拮抗劑PI-55 和細胞分裂素降解抑制劑INCYDE［2-chloro-6-（3-methoxyphenyl）aminopurine］處理對藥用鱗芹屬（Bulbine）植物幼苗的芽和根生長均具有顯著影響，其中INCYDE 處理顯著提高了其芽和根的生長。上述研究結果表明細胞分裂素有助于保護植物免受高Cd脅迫帶來的損傷。然而，細胞分裂素調控植物耐鎘的生理生化途徑尚不清楚。細胞分裂素下游Arabidopsis Response Regulator（ARR）家族轉錄因子是調控細胞分裂素信號傳導的關鍵節點［9］。根據核心功能域的相識度和 C 端功能域的長度，ARRs 可劃分為兩類，即 A 類和 B 類 ARRs［10-11］。B 類 ARRs 具有轉錄激活活性，通過促進細胞分裂素響應基因的轉錄，發揮正調控細胞分裂素信號傳導的功能［12-13］。有研究證明，B 類ARRs 能夠延緩擬南芥（Arabidopsis thaliana）的衰老，并提高其耐逆性［14-15］。因此，本研究推測細胞分裂素可能通過其信號傳導通路B 類ARR 轉錄因子發揮調控耐鎘的分子功能。

多年生黑麥草（Lolium perenne）是重要的早熟禾亞科冷季型草，具有牧草和草坪草兩種生態型，在我國長江流域及以南的丘陵地區和人工草地中廣泛種植［16］。多年生黑麥草的耐重金屬鎘的能力弱，限制了其在礦區土壤修復的利用。因此，培育耐鎘黑麥草新品種具有重要意義。本試驗以多年生黑麥草為研究材料，從已發表的多年生黑麥草轉錄組數據庫中篩選出5個受逆境誘導的ARR 轉錄因子，其中LpARR10受鎘誘導表達。因此，該研究擬通過分析LpARR10 的進化關系及功能域，探究LpARR10基因在鎘逆境條件下的表達模式，評價LpARR10過量表達轉基因株系的耐鎘能力，以明確LpARR10基因的調控耐鎘性的功能及途徑。研究結果有助于進一步認識植物的耐鎘機制，并為培育耐鎘性強的黑麥草新品種提供基因資源。

1 材料與方法

試驗于2018年9月-2020年7月在南京農業大學草業學院草類生理生化與分子生物學實驗室進行。

1.1 LpARR10 功能域、進化與基因結構分析

從本研究團隊已發表的多年生黑麥草全長轉錄組數據庫（SRA 號：PRJNA335527）［17］中獲取LpARR10編碼區序列（coding sequence，CDS），采用NCBI-blastn 在線軟件預測其蛋白功能域。從Tair 網站獲取擬南芥A 類和B 類ARR 轉錄因子序列，利用MEGA 6.0 軟件繪制LpARR10 和擬南芥A 類和B 類ARR 轉錄因子的遺傳進化圖。根據LpARR10的CDS 設計基因全長引物（表1），以多年生黑麥草（品種：Buena Vista）的gDNA 為模版，克隆并測定LpARR10的基因序列。根據其CDS 和基因組序列，利用BioXM 軟件預測其外顯子和內含子等基因結構。

1.2 LpARR10 基因的表達分析

多年生黑麥草種子播于陶粒土中，放置于智能人工氣候室（夜間20 ℃，10 h；白天25 ℃，14 h；光強為750 mmol·m-2·s-1）。每 3 d 澆灌一次 1/2 霍格蘭氏（Hoagland’s）營養液［18］，待種子萌發 14 d 后挑取生長情況一致的幼苗水培于 Hoagland’s 營養液中，預培養 2 周后用 25 μmol·L-16-BA 和 200 μmol·L-1CdCl2處理其根部［19］，并在0、0.5、2、6、12、24 和 48 h 后取根和葉片樣品，凍存于-80 ℃冰箱，每個處理有 4個生物學重復。采用 Plant RNA Kit（Omega Bio-Tec，美國）提取樣品的 mRNA，利用 Takara cDNA synthesis kit（含基因組 DNA 酶）將 mRNA 反轉錄為cDNA。采用羅氏熒光定量系統（Roche Light Cycler?480-Ⅱ）測定目的基因的相對表達量，目的基因及內參基因LpeLF4A的引物序列見表1。

表1 試驗所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 載體構建及擬南芥的遺傳轉化

以多年生黑麥草cDNA 為模版，采用NEB Q5 高保真酶克隆LpARR10編碼區序列，經雙酶切連接到入門載體 pEND-linker，利用 LR 反應（Gateway LR Enzyme Mix）將測序正確的 pEND-LpARR10與 pEarleygate-103 過量表達載體進行同源重組，獲得35S∶∶LpARR10-GFP表達組件，將構建好的載體轉入農桿菌中（AGL1菌株）。采用 LB 液體培養基（10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化鈉，pH=7.4）將含有過量表達載體的農桿菌培養至OD600約為1.0，離心后棄掉LB 培養基，用5%的蔗糖溶液（含有0.02% Silwet L-77）懸浮菌液，暗培養2 h 后侵染野生型擬南芥“Columbia”的花序［20］。一周后再次侵染花序，以提高轉基因成功率。收取T0代種子，利用20%的84 消毒液浸泡消毒20 min，無菌水沖洗4 次，用0.2%的瓊脂糖溶液將種子鋪于含有20 μmol·L-1草銨膦（Basta）的 1/2 MS 培養基（主要成分為 650 mg·L-1NH4NO3，1.9 g·L-1KNO3，440 mg·L-1CaCl2·2H2O，370 mg·L-1MgSO4·7H2O，700 mg·L-1KH2PO4）上，培養一周后，篩選出抗性轉基因植株。根據載體抗草銨膦基因（Bar）設計常規PCR 引物，以抗性轉基因株系基因組DNA 為模版，利用2×PCR 預混液（Takara）進行PCR 擴增，檢測抗性轉基因株系基因組DNA 中是否有Bar基因，以篩選和鑒定陽性LpARR10過量表達轉基因株系。獲得穩定遺傳的T3代陽性轉基因株系，每個株系選取4 棵，分別提取葉片的總RNA 并進行反轉錄得到cDNA，用擬南芥TUBULIN4基因為內參基因進行定量PCR 反應，檢測各轉基因株系中LpARR10基因的表達。

1.4 轉基因擬南芥的耐鎘性分析

擬南芥野生型（wild type，WT）和T3代轉基因株系種子用20%的84 消毒液浸泡消毒20 min，無菌水沖洗4次，用0.2%低熔點瓊脂糖將種子鋪于1/2 MS 和加有180 μmol·L-1CdCl2的1/2 MS 培養基中，4 ℃黑暗春化48 h，豎直放置于培養室中培養，10 d 后觀察植株表型并統計根長和鮮重指標。本試驗對轉基因和野生型擬南芥進行Cd 處理的濃度（180 μmol·L-1）為預試驗篩選得到。該試驗獨立重復3 次，單次試驗每個株系至少種植4 皿用于數據的統計分析（4個生物學重復）。

1.5 數據統計與分析

使用SPSS 23.0 進行試驗數據的計算、統計和差異顯著性分析（P＜0.05），數據以平均值±標準誤差的形式呈現。利用SigmaPlot 12.5、MEGA 6.0 和Excel 2013 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 LpARR10 是 B 類 ARR 轉 錄因子

進化分析表明LpARR10 與擬南芥B 類ARR 轉錄因子聚為一組，且與AtARR10 和AtARR12 親緣關系較近（圖1），說明LpARR10 為B 類ARR 轉錄因子。LpARR10具有6個外顯子，編碼598個氨基酸（基因登錄號為ALT32069.1，圖2a）。LpARR10 的氨基酸序列與模式植物大麥（Hordeum vulgare）、擬南芥、水稻（Oryza sativa）和高粱（Sorghum bicolor）同源ARR 轉錄因子的相似度較高，且與大麥HvARR12 的同源性最高（圖2b）。氨基酸序列分析表明LpARR10 具B 類ARR 轉錄因子特異的磷酸受體結構域（phosphoaccepter receiver domin of type B Arabidopsis response regulators，REC domain of B-type ARRs）、金屬及磷酸化結合位點和YXXK 功能域（active site）（圖 2b）。

圖1 LpARR10 與擬南芥ARR 轉錄因子的系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of LpARR10 and Arabidopsis ARR transcription factors

圖2 LpARR10 的基因組結構及其同源基因的氨基酸序列和功能域分析Fig.2 Genetic structure，amino acid sequence and function domain analysis of LpARR10 and its homologus genes

2.2 LpARR10 受細胞分裂素和Cd 誘導表達

LpARR10在多年生黑麥草根和葉片中均表達，因此，本研究分別測定了LpARR10在葉片和根中的表達變化。與處理前相比，細胞分裂素處理2 和6 h 后葉片中LpARR10的表達量顯著升高，然而，在處理0.5、12、24 和48 h 后沒有顯著變化（圖3a）。在根部，細胞分裂素處理均顯著提高了LpARR10的表達量，其中在處理6 h 時表達量最高，是處理前的17.48 倍，說明根部對細胞分裂素處理更加敏感（圖3b）。

圖3 外源細胞分裂素處理下多年生黑麥草葉片和根中LpARR10 基因表達分析Fig.3 Expression analysis of LpARR10 gene in perennial ryegrass leaves and roots treated with cytokinin

在葉片中，在鎘處理2 和6 h 后，LpARR10基因的表達量顯著升高，分別為處理前的1.41 和1.37 倍，隨后表達量下降，而在 12、24 和 48 h 時與 0 h 無顯著差異（圖 4a）。在根中，Cd 處理 0.5 h 后即顯著地提高了LpARR10基因的表達量，并在處理24 h 后，LpARR10的表達量達到峰值，其中12、24 和48 h 的基因表達量分別為處理0 h 時的3.85、9.53 和5.92 倍（圖4b）。LpARR10的表達對鎘和細胞分裂素的響應模式相似，在處理后期，表達量在根部增加的倍數明顯高于葉部。

圖4 鎘處理下多年生黑麥草葉片和根中LpARR10 基因表達Fig.4 LpARR10 gene expression in leaves and roots of perennial ryegrass under cadmium treatment

2.3 LpARR10 過量表達轉基因株系的鑒定

收取T0代種子，經草銨膦（Basta）抗性篩選，共得到3個抗性轉基因株系（圖5）。根據抗除草劑Bar基因設計特異性引物，進行PCR 檢測，野生型擬南芥沒有檢測出目的基因條帶，而轉基因植株均檢測出目標條帶（圖5a），且T3代轉基因株系的種子均能在草銨膦篩選板上萌發（圖5b），說明3個株系的T3代均為純合轉基因植株。進一步采用定量PCR 方法檢測野生型和轉基因株系中黑麥草LpARR10基因的表達量，結果表明LpARR10在3個轉基因株系中均表達（圖5c）。

圖5 LpARR10 轉基因陽性株系的鑒定Fig.5 Identification of LpARR10 overexpression transgenic lines

2.4 過量表達LpARR10 提高了擬南芥耐鎘能力

在無鎘處理的條件下（1/2 MS 培養基），野生型與轉基因株系的生長狀況無明顯差異（圖6）。當處于180 μmol·L-1Cd 脅迫時，擬南芥植株葉片變黃，地上部和根系生長受到抑制。在野生型擬南芥中，Cd 處理使得根長和地上部鮮重分別降低了88.47%和72.82%。然而，在Cd 處理條件下，3個轉基因株系的根長和地上部鮮重均顯著高于野生型對照，說明LpARR10基因正調控擬南芥耐鎘功能。盡管3個轉基因株系中目標基因LpARR10的表達量有顯著差異，但在正常和鎘處理條件下，轉基因株系之間的表型沒有顯著差異。

圖6 鎘處理條件下轉基因株系和野生型擬南芥鮮重和根長Fig.6 Fresh weight and root length in transgenic lines and wild type Arabidopsis when treated with Cd

3 討論

土壤是植物根部生長發育的環境，為植物提供必需的養分，也是很多微生物和小動物的棲息地。土壤重金屬鎘含量超標會降低土壤微生物和小動物群落豐度，限制植物的正常生長和發育，嚴重威脅生態系統安全［21］。植物可以從重金屬污染土壤中吸收鎘元素，從而降低其在污染土壤中的含量，是一種低成本、可持續、效率高的土壤修復方式［22］。草坪草物種多樣性高，耐逆性強，可通過修剪地上部來降低土壤鎘含量，是污染土壤植物修復較理想的選擇。因此，挖掘草坪草耐鎘基因、培育耐鎘和富集鎘的草坪草新品種具有重要意義。本研究以重要的冷季型草坪草-多年生黑麥草為材料，克隆出其B 類ARR 轉錄因子編碼基因LpARR10，明確了LpARR10受鎘脅迫誘導的表達模式，證明了LpARR10的耐鎘功能，豐富了多年生黑麥草耐鎘調控的分子途徑。LpARR10可作為多年生禾本科草坪草分子育種重要的基因資源。

ARR基因是細胞分裂素信號傳導關鍵基因，由于其首先在擬南芥中被克隆，因此命名為擬南芥響應調控因子［23-24］。高等植物ARRs 可分為A 和B 兩類，是植物在生長、發育和抵御逆境過程中必不可少的一類轉錄因子。A 類ARRs 是細胞分裂素信號傳導負調控因子，它可以通過競爭B 類ARRs 的磷酸轉運蛋白（arabidopsis his phosphotransfer proteins，AHPs）和抑制B 類ARRs 的轉錄，發揮負反饋調控細胞分裂素信號傳導的功能［9］。與A類ARRs 不同的是，B 類ARRs 含有較長的C 末端和典型的磷酸受體結構域（REC domain of B-type ARRs），具有轉錄激活活性，可以激活細胞分裂素響應基因的表達，發揮正調控細胞分裂素信號傳導的功能［10-11］。有研究證明，擬南芥B 類ARR 轉錄因子ARR10能夠參與細胞分裂素通路以調節擬南芥的生長和發育；ARR10和ARR12參與了細胞分裂素介導的擬南芥原生木質部分化的調控［25-26］。B 類ARR 轉錄因子也能參與生長素的信號傳導，調控生長素相關基因的表達，進而影響植物的生長、發育［13］。B 類ARR 家族基因也能夠調控植物逆境脅迫相關基因的表達，進而提高植物的耐逆性［14］。但是，B 類ARRs 在耐鎘功能方面尚未見報道。本研究克隆得到了多年生黑麥草B 類ARR 轉錄因子LpARR10，將其與擬南芥所有ARRs 進行進化分析，結果顯示LpARR10 與B 類ARRs 聚為一組，且與擬南芥AtARR10 和AtARR12 的親緣關系較近。氨基酸序列分析表明LpARR10的C 端較長，且具有典型的B 類ARRs 磷酸受體結構域（REC domain of B-type ARRs）及金屬和磷酸化結合位點，說明LpARR10屬于B 類ARRs。本研究進一步在擬南芥中過量表達LpARR10，與野生型對照相比，轉基因株系的耐鎘能力顯著提高，說明B 類ARRs（LpARR10）正調控植物的耐鎘功能。本研究發現3個轉基因株系中LpARR10上調表達的表達倍數不同，但它們的耐鎘表型卻沒有明顯差異，說明LpARR10可能存在翻譯后修飾。前人研究表明磷酸轉運蛋白（AHPs）能夠磷酸化B 類ARRs，使其變成活化狀態，進而發揮生物學功能［9-10］。本研究發現LpARR10 的第 79 位絲氨酸（serine，S）是 B 類 ARRs 成員保守的磷酸化位點，因此，本研究推測LpARR10的第 79位絲氨酸（S79）是介導AHPs 磷酸化LpARR10的關鍵位點。利用Crispr/Cas9 技術對多年生黑麥草基因組進行單堿基位點編輯已經實現［27］，因此，后續利用Crispr/Cas9 技術對LpARR10第79 位絲氨酸位點進行突變，可以明確LpARR10翻譯后修飾的途徑及其發揮傳遞細胞分裂素信號功能的分子機制。

細胞分裂素是調控植物生長、發育、衰老和耐逆反應重要的植物激素之一。有研究表明外源噴施細胞分裂素和細胞分裂素降解抑制劑能夠提高植物的耐鎘能力［7-8］，然而，其調控耐鎘的分子途徑尚未可知。本研究發現，LpARR10基因受細胞分裂素和鎘處理上調表達，并且細胞分裂素和鎘對于LpARR10表達的調控模式高度一致。例如，在葉中，LpARR10均在細胞分裂素和鎘處理2 和6 h 時顯著上調表達，其他處理時間無顯著差異。在根部，LpARR10的表達在整個細胞分裂素和鎘處理周期均顯著高于0 h，上調表達倍數明顯高于葉部。上述試驗結果表明LpARR10可能是多年生黑麥草響應細胞分裂素和鎘處理的關鍵節點，是細胞分裂素調控耐鎘反應的關鍵基因。異源過量表達試驗也證明，LpARR10的確具有正調控擬南芥的耐鎘功能。綜上所述，本研究初步明確了細胞分裂素通過其信號傳導通路基因LpARR10發揮正調控植物耐鎘的功能。

4 結論

本研究通過克隆多年生黑麥草細胞分裂素信號傳導通路LpARR10基因，并根據進化和氨基酸序列分析，發現LpARR10 與擬南芥B 類ARR 轉錄因子聚為一組，且具有高等植物B 類ARRs 高度保守的磷酸受體結構域（REC domain of B-type ARRs）及金屬和磷酸化結合位點，說明LpARR10 為B 類ARRs。定量表達分析表明，無論在葉部還是在根部，LpARR10均受細胞分裂素和鎘處理誘導上調表達，但在根部上調表達的倍數明顯高于葉部。另外，LpARR10在細胞分裂素和鎘處理條件下表達模式較為一致，說明其可能是細胞分裂素調控植物耐鎘功能的關鍵節點。異源過量表達LpARR10顯著提高了擬南芥的耐鎘能力，表明細胞分裂素極可能通過LpARR10調控耐鎘的功能。該研究結果對深入揭示多年生黑麥草B 類ARR 轉錄因子的功能，進一步培育耐鎘多年生黑麥草的新品種具有重要的理論意義。