青藏高原燕麥附著耐低溫乳酸菌的篩選與鑒定

藺豆豆，琚澤亮，柴繼寬，趙桂琴

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

青藏高原是我國主要牧區之一，氣候嚴酷，暖季短暫、冷季漫長，枯草期長達7個月之久。冷季氣溫大幅度下降，使家畜在暖季放牧中增加的體重及營養被大量消耗，加之冷季飼草料供給不足，使老、弱、病畜難以安全越冬，形成“夏壯、秋肥、冬瘦、春死”的惡性循環，成為制約青藏高原畜牧業發展的主要因素［1］。人工種草是解決這一問題的有效途徑［2］。燕麥（Avena sativa）對青藏高原高寒氣候有獨特的適應能力，具有易種植栽培、抗逆性強、產量高、品質優等優點，是該地區人工種草的首選草種，對緩解家畜季節性飼草緊缺、防止冬季掉膘、促進當地草地畜牧業的可持續發展具有重要作用。燕麥可曬制成青干草，也可生產青貯。但該地區草產品加工機械化程度低，技術手段落后，調制燕麥干草仍采用自然晾曬的方式，青藏高原地區秋季多雨，曬制青干草受天氣影響很大，營養損耗較多，因此更適于青貯，在灌漿至乳熟期刈割，稍加晾曬含水量即可達到青貯要求［3］。調制青貯受天氣影響小、生產的草產品適口性好、最大限度保留了飼草的營養，適宜在青藏高原及周邊海拔較高、收獲季節多雨的冷涼地區推廣應用，也是長期保存飼草料的一種方式［4-6］。

一般情況下，低海拔地區飼草青貯發酵在40～45 d 即可完成，而青藏高原地區牧草多在8月底至9月收獲，這時最高氣溫已降至 15～18 ℃左右，且晝夜溫差非常大［7］，進入 10月后氣溫更低。Liu 等［8］發現 10 ℃下柱花草（Stylosanthes guianensis）青貯料中乳酸含量較30 °C 降低了61.11%，乙酸含量下降了63.91%，好氣性細菌數量增加了83.72%。玉米（Zea mays）在不同溫度（5、10、15、20 和25 ℃）下的青貯，pH 下降速度隨溫度降低而顯著減緩，發酵 30 d 后，5 ℃下青貯料的 pH 仍為 5.0［9］。垂穗披堿草（Elymus nutans）在 5 ℃下青貯 60 d 后 pH 值為 6.08，乳酸含量為0.34%，基本無青貯效果；在15 ℃下青貯60 d 后pH 值降至5.68，乳酸含量僅為1.44%，發酵程度較低［7］。在青藏高原高寒牧區，由于秋冬季氣溫很低，完成青貯發酵所需的時間明顯增加，燕麥與箭筈豌豆（Vicia sativa）混播捆裹青貯要80 d 才能完成發酵，較長的發酵時間增加了營養物質的流失［10］。添加外源乳酸菌可促進青貯發酵，但一般乳酸菌適宜生長溫度為20～37 ℃［10-11］，市售乳酸菌添加劑的適宜溫度遠高于青藏高原的氣溫，因此在低溫發酵中收效甚微［12］。要想盡快完成發酵，就需要添加低溫下活性較高的耐低溫乳酸菌。目前市場上未見此類乳酸菌制劑，但已有相關研究報道。崔棹茗等［13］發現，青藏高原乳酸菌具有耐低溫、耐酸和耐鹽性強等特性。保安安［14］從不同地區不同發酵階段的垂穗披堿草青貯料中也分離得到6 株產酸和耐低溫能力強的優異菌株。陳明霞等［15］通過限制性培養方法篩選得到3 株耐低溫乳酸菌并成功應用于黑麥草（Lolium multiflorum）低溫青貯。從不同溫度和發酵階段的垂穗披堿草青貯料中也分離得到耐低溫的清酒乳桿菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌［7］。由此可見，從植物生長地采集和分離適應環境的乳酸菌是可行的。

燕麥作為青藏高原地區主要的青貯原料，在青貯生產中面臨秋冬氣溫低、發酵緩慢、營養損耗嚴重等問題［10，16］，能否在其生產地分離得到耐低溫的乳酸菌，用于促進低溫發酵，目前尚未見相關研究報道。因此，本試驗擬收集青藏高原不同海拔區燕麥植株附著乳酸菌資源，分析其耐低溫和低pH 及產酸能力，篩選具有促進燕麥低溫發酵的潛力菌株，以期為發掘和利用青藏高原本土特有乳酸菌資源、改善燕麥低溫青貯發酵品質和促進優質燕麥青貯生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點地理信息

在甘肅省天祝抓喜秀龍鄉、山丹軍馬二場、甘南州合作市那吾鄉、甘南州瑪曲縣歐拉鄉，青海省西寧市湟中縣魯沙爾鎮、海北州海晏縣西海鎮、果洛瑪沁縣大武鎮、玉樹稱多縣清水河鎮共8個地點進行采樣。各樣點的地理信息見表1。

表1 采樣點地理信息Table 1 Geographical information of sampling sites

1.2 樣品采集

于2020年8-9月在8個不同海拔區，采集處于開花至灌漿期的燕麥材料，裝于提前滅菌的樣袋，低溫保存，帶回實驗室后在無菌環境下裝入1 L 無菌聚乙烯瓶中密封，室溫條件下進行青貯發酵，經3 和60 d 青貯發酵后用于乳酸菌的采集、分離、篩選和鑒定。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸菌的采集、分離與純化 在無菌環境中分別稱取青貯3 和60 d 后的燕麥青貯料10 g，放入錐形瓶中，加入90 mL 無菌生理鹽水，置于搖床上振動（轉速120 rpm·min-1）2 h，用無菌生理鹽水進行梯度稀釋，取3個適宜梯度涂板，每個梯度3個重復。在葡萄糖酵母膏蛋白胨培養基（glucose yeast extract peptone medium，GYP）（葡萄糖10 g，酵母提取物5 g，蛋白胨5 g，乙酸鈉2 g，吐溫805 mL，碳酸鈣5 g，氯化鈉5 g，鹽溶液5 mL，瓊脂15 g，溴甲酚紫0.04 g，蒸餾水1000 mL，pH=6.8）上對乳酸菌進行分離培養，37 ℃厭氧培養箱中培養48 h 后進行菌落挑選和分離。根據菌落大小、顏色、光澤、形狀和是否具有透明環等特征采集單菌落。在MRS 培養基（蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母粉4.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫801 mL，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH：6.2±0.2）上劃線培養（37 ℃，1 d），重復劃線分離培養3次，獲得純化的單菌株。對菌株進行革蘭氏染色、鏡檢觀察、過氧化氫酶試驗，初步認定革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株為乳酸菌［17］。利用MRS 液體培養基（不加瓊脂）進行富集（37 ℃，1 d）后加入等體積甘油（40%），分裝后-20 ℃保存備用。

將低溫保存備用的菌株快速流水解凍，置于MRS 液體培養基中活化培養（37 ℃，1 d），進行2 次傳代培養后，離心收集菌體，采用比濁法加入生理鹽水調制菌液濃度為108 cfu·mL-1。

1.3.2 耐低溫乳酸菌篩選 在MRS 液體培養基中接種活化菌株，接種量為3%，分別在20、15、10 和5 ℃恒溫培養，其中5 ℃下培養10 d，10 和15 ℃下培養7 d，20 ℃下培養5 d，分析乳酸菌對溫度的適應能力。配制含3.0%和6.0% NaCl 的MRS 液體培養基，接種活化菌株，接種量為3%，37 ℃培養3 d，分析乳酸菌的耐鹽能力。用HCl溶液將 MRS 液體培養基 pH 分別調至 3.0、3.5、4.0、4.5 和 5.0，接種活化菌株，接種量為 3%，37 ℃培養 3 d，分析乳酸菌的耐酸性［18］。

將滅菌MRS 液體培養基分裝，每試管5 mL，倒置放入杜氏小管，接種活化菌株，接種量為3%，37 ℃下培養3 d，觀察是否產氣。MRS 液體培養基中接種活化菌株，接種量為3%，37 ℃下培養30 h，每隔5 h 取樣一次，測定培養液的pH 值，分析乳酸菌菌株的產酸速率。同時，以培養液為對照，測定樣品在600 nm 波長下的吸光度值（optical density value，OD 值），分析乳酸菌的生長速度［19］。

1.3.3 耐低溫乳酸菌的鑒定 利用16S rDNA 基因序列同源性分析方法進行菌種的初步鑒定。將活化的菌株在MRS 培養基中富集培養24 h 后離心收集菌體，參照生工Bacteria DNA Ki（t上海生工生物科技有限公司）試劑盒使用說明提取 DNA，進行 16S rDNA 擴增，引物序列為：27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492r（5′-TACCTTGTTACGACT-3′），由上海生工生物科技有限公司合成。PCR 擴增反應體系：2×PCR Master Mix，上下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，9.5 μL ddH2O，總體積為 25 μL。反應條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，51 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 1 min，30個循環；最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。取 5 μL PCR 產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳以檢測目的條帶。將擴增產物送至上海生工生物科技有限公司測序。

將乳酸菌菌株 16S rDNA 基因序列用 BLAST（basic local alignment search tool，http：//blast. ncbi. nlm. nih.gov/blast.cgi）在GenBank 中搜索，與待測菌株相似性最高的已知分類地位的菌種比對，初步確定待測菌株的屬種。然后從GenBank 數據庫中下載已知乳酸菌菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 進行序列比對后，用MEGA 5.0 的Neighbor-joining 法構建系統發育樹，進行2000 次Bootstrap 檢驗。結合API 50 CHL 發酵試劑盒（BioMérieux，法國），按照試劑盒說明書測定不同菌株的碳源利用差異，鑒定菌種。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2019 對數據進行初步整理，采用SPSS 21.0 軟件對不同菌株測定指標進行單因子ANOVA 模型分析，結合Duncan 法進行多重比較（P＜0.05）。試驗誤差以平均值的標準誤（standard error of mean，SEM）表示。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化及耐低溫菌株篩選

通過挑選GYP 培養基上有黃色溶菌環的菌株，初步獲得232 株乳酸菌。對初獲菌株進行革蘭氏染色、鏡檢觀察和過氧化氫酶試驗，篩選出56 株乳酸菌。將其分別在 5 ℃培養10 d、10 和 15 ℃培養 7 d，20 ℃培養5 d，根據生長情況進行篩選，得到18 株耐低溫乳酸菌菌株（表2）。

表2 燕麥青貯中分離的乳酸菌信息Table 2 Information of lactic acid bacteria isolated from oat silage

2.2 耐低溫乳酸菌生理特性分析

分離篩選的18 株耐低溫乳酸菌生理特性如表3所示。所有乳酸菌菌株均為革蘭氏陽性、過氧化氫酶促陰性細菌。其中，OLP1、OCLB7、OCWC8和 OCWC9為異型發酵乳酸菌，OCEF2、OCPP3、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77、OL122、OL194和 OL205為 同 型 發 酵 乳 酸 菌 。 OCEF2、OCPP3、OL36、OL77和 OL205為球菌，OLP1、OCLB7、OCWC8、OCWC9、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL3、OL8、OL25、OL54、OL122和OL194為桿菌。

OL205菌 型mo球ccus Co 同Ho +--OL19 4菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL122菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL77菌 型mo球ccus Co 同Ho +--OL54菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL36菌 型mo球ccus Co 同Ho +--OL25菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL8菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL3菌 型mo桿Bacillus同Ho +--WC9菌 型OC 桿Bacillus異Hetero+-+WC8菌 型OC 桿Bacillus異Hetero+-+L B7 OC 菌 型桿Bacillus異Hetero+-+L F6 OC 菌 型mo桿Bacillus同Ho +--L P5 OC 菌 型mo桿Bacillus同Ho +--acteria strains LF4 OC 菌 型mo桿Bacillus同Ho +--P P3 OC 菌 型mo球ccus Co 同Ho +--cid b EF2 ccus菌 型mo OC 球Co 同Ho +--征8 lactic a Bacillus菌Hetero P1型+-+OL特f 1桿 異se菌e cs o的p o ++ ++++W ++++ ++ ++++W ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ ++++W ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ ++++W ++++ ++ ++++W ++++ ++ +++++ ++++ ++ ++++W ++++e. ++ +++++ ++++ositiv ++ ++++W ++++eakly p eans w ++ +++++ ++++。性陽e；“W”m ++ ++++W ++++弱示ativ eg ++ +++++ ++++eans n性陰cteristi 示酸，“-”e；“-”m aracteristics乳tation ty Catalase c lu m g 表ositiv s p Gas fro性低ra stain en Ch℃）陽溫ble 3 C Ferm 8 株e 色表Gram耐ha酶erature（ap 氣+”+”mean表征Sh 3 1型 染氫產化類氏糖Temp蘭表Ta 狀 酵 氧萄，“W”0%0%特pH5.050度形NaCl發過3.葡6.05革4.4.3.3.示溫2015105：“te：“注No

18 株乳酸菌都能在3.0%和6.0% NaCl 條件下穩定生長，具有良好的耐鹽性（表3），其在pH 為3.0～5.0 條件下也生長良好，尤其是 OLP1、OCPP3、OCLP5、OCLB7、OL3、OL8、OL36、OL54、OL77和 OL122在 pH 為 3.0 的條件下仍可良好生長，表明其對酸性環境的適應性更強。由于同型乳酸菌產酸效率更高，造成的干物質損失更小，因此，選取 14 株同型發酵乳酸菌（OCEF2、OCPP3、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77、OL122、OL194和OL205）測定產酸速率和生長速度。

由表 4 可知，培養 5 h 后，菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122的產酸速度較快，pH 均降至4.7 以下，顯著低于其他菌株（P＜0.05）。培養 10 h 后，菌株 OL77產酸最快，pH 降至 3.74，其次為 OL3和 OL25，pH降至 3.79。菌株 OCEF2、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL194和 OL205產酸引起的 pH 值降幅加大。培養 15 h 后，菌株OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122的 pH 降至 3.8 以下，顯著低于其他菌株（P＜0.05）。培養 20 h后，所有菌株的pH 值變化均趨于平緩，在30 h 后所有菌株的pH 值均降至4.2 以下，最低的為菌株OL8，pH 為3.61，其次為 OL77和 OL54，pH 均為 3.62。

表4 供試乳酸菌的產酸速率Table 4 Acid production rate of tested lactic acid bacteria

供試菌株的生長速度呈現出和產酸速率類似的規律（表 5）。培養 0～5 h，菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和OL122處于對數生長期，OD 值迅速上升，均大于1.60（P＜0.05），其他菌株的生長在起始階段較為遲滯。5～10 h，菌株 OCEF2、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL194和 OL205的生長速度增加，OD 值上升，平均為 1.68。10～25 h，所有菌株的生長速度開始放緩，仍以菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122的繁殖量較高（P＜0.05）。培養 25 h 后，菌株 OL77的 OD 值在所有培養菌株中最高，達2.52，其次為OL54，為2.50。培養30 h 后所有菌株均未出現明顯衰退。

表5 供試乳酸菌的生長速率Table 5 Growth rate of tested lactic acid bacteria

2.3 耐低溫乳酸菌的分子鑒定

結合表6 和圖1 可知，菌株OLP1與類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraginis）處于同一族群，進化親緣度100%，與對應標準菌株序列相似性為99.73%。菌株OCEF2與屎腸球菌（Enterococcus faecium）處于同一族群，進化親緣度98%，序列相似度為97.94%。OCPP3、OL36、OL77和 OL205與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）處于同一族群，進化親緣度98%，且與標準菌株的序列相似度達97.99%以上。菌株OCLF4和 OCLF6與香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）處于同一族群，進化親緣度為96%，與標準菌株的序列相似度分別為99.51%和98.72%。OCLP5與類食品乳桿菌（Lactobacillus paralimentarius）和消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）處于同一族群，進化親緣度為89%，與標準菌株的序列相似度為98.43%。OCLB7與布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）處于同一族群，進化親緣度為100%，序列相似度99.46%。OCWC8和OCWC9與魏氏乳桿菌聚在同一族群中，進化親緣度為100%，與標準菌株16S rDNA 基因序列相似度達 99% 以上。菌株 OL3、OL8、OL25、OL54、OL122和OL194與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和 類植物 乳桿 菌（Lactobacillus paraplantarum）聚為一個族群，進化親緣度為 100%，其中，菌 株 OL3、OL54、OL122和 OL194的16S rDNA 基因序列與植物乳桿菌標準菌株的相似度均大于戊糖乳桿菌，而菌株OL8和OL25與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌標準菌株的相似度一致，但僅根據這一結果尚難鑒定到種水平。

圖1 篩選菌株及相關菌種的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of screened lactic acid bacteria strains and related species

表6 乳酸菌菌株的16S rDNA 基因序列分析Table 6 Analysis of 16S rDNA gene sequences of lactic acid bacteria

篩選的18 株耐低溫乳酸菌可初步分為9 種，反映了燕麥附生乳酸菌類群的豐富性。結合之前的產酸速率及生長速度試驗，菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122生長速度快、產酸速率高。因此，對這8個菌株進行糖發酵特性研究。

2.4 8個優選菌株的糖發酵特性分析

從表7 可知，8個菌株均能發酵的糖有L-阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、β-龍膽二糖和葡萄糖酸鹽，共22 種。均不能發酵的糖有赤蘚糖醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿東醇、L-山梨糖、半乳糖醇、肌糖、淀粉、肝糖、木糖醇、D-來蘇糖、D-海藻糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽和5-酮基-葡萄糖酸鹽，共16 種。

表7 8個優選菌株的糖發酵特性Table 7 Sugar fermentation profiles of 8 lactic acid bacteria strains

續表Continued Table

除此之外，菌株 OCPP3、OL36和 OL77均能發酵 D-木糖、D-棉籽糖、D-塔格糖，均不能發酵β-甲基-木糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、D-松二糖和D-阿拉伯糖醇。菌株OL3和OL54均能發酵D-木糖、β-甲基-木糖苷、鼠李糖、胰島素、D-松二糖和D-塔格糖，均不能發酵α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、D-棉籽糖和D-阿拉伯糖醇。菌株OL8、OL25和 OL122均能發酵 α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖和 D-阿拉伯糖醇，均不能發酵 D-木糖、β-甲基-木糖苷、鼠李糖、胰島素和D-塔格糖。

結合伯杰氏細菌鑒定手冊和前人研究結果，戊糖乳桿菌可以發酵D-木糖和鼠李糖，植物乳桿菌不能發酵鼠李糖；植物乳桿菌能利用α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖，而戊糖乳桿菌不能利用α-甲基-D-甘露糖苷和D-棉籽糖［18］。因此將菌株OL3和OL54鑒定為戊糖乳桿菌，菌株OL8、OL25和OL122鑒定為植物乳桿菌。

3 討論

青貯過程受溫度影響比較大，青貯時間較長時尤為明顯［13］。低溫會抑制微生物的活動和繁殖，延長青貯發酵時間。燕麥附著乳酸菌數量在高海拔地區均低于105 cfu·g-1，難以快速啟動乳酸發酵［20］。隨著發酵時間的延長，可溶性糖（water soluble carbohydrate，WSC）含量由于乳酸菌的消耗而顯著降低，芽孢桿菌及酵母菌等對青貯原料中較難利用的物質如纖維等具有較強的降解能力，使青貯原料中可溶物質增加，營養流失加劇。適宜的添加劑可促進發酵進程并改善青貯發酵品質，在氣溫偏低、青貯發酵緩慢的高寒地區，添加劑的使用更具有重要意義。Zhang 等［12］研究發現，與對照菌株相比，在5 ℃下給小麥（Triticum aestivum）秸稈（干物質含量32%）接種篩選的耐低溫植物乳桿菌，青貯發酵30 或60 d 后，可以顯著改善青貯飼料的發酵品質。15 ℃條件下，添加3 株耐低溫乳酸菌均可促進黑麥草的發酵，降低pH 值，減少蛋白質或氨基酸的分解，發酵品質顯著提高［21］。因此，從高海拔地區燕麥附生乳酸菌種群中篩選生長速度快、產酸能力強的耐低溫菌株，用于促進當地燕麥低溫青貯發酵是可行的。

在青貯發酵中，約有20 多種乳酸菌起作用，可分成同型發酵乳酸菌和異型發酵乳酸菌兩大類，其代謝過程差異較大，作用也不盡相同［22］。多數研究結果表明，同型發酵乳酸菌在產生乳酸和改善青貯飼料品質方面比異型發酵乳酸菌更有效［23］；異型乳酸菌則更有利于提高有氧穩定性［22］。本研究中，通過對不同海拔地區燕麥青貯乳酸菌的分離篩選，獲得18 株耐鹽、耐酸和耐低溫乳酸菌資源，其中OLP1、OCLB7、OCWC8和OCWC9為異型發酵乳桿菌，OCEF2、OCPP3和OCLF4等14 株為同型發酵乳桿菌，為燕麥低溫青貯乳酸菌資源利用提供了基礎材料。4 株異型發酵乳桿菌均來自發酵60 d 的燕麥青貯料，說明燕麥自然發酵后期異型乳酸菌可能成為主導菌株。這與Zhou 等［9］的研究結果類似，玉米在不同溫度下自然青貯，在20 和25 ℃下，植物乳桿菌和戊糖片球菌在1 d 內占據優勢，7 d 后異型發酵菌布氏乳桿菌開始出現，并最終占據主導地位；15 ℃可能是布氏乳桿菌生長的溫度下限。盡管如此，在低于15 ℃的溫度下發酵60 d 后，其他異型發酵乳酸菌仍在乳酸菌種群中占主導地位。本研究中，異型發酵乳桿菌包括類谷糠乳桿菌、布氏乳桿菌和魏氏乳桿菌，反映了燕麥自然青貯發酵后期異型發酵乳酸菌種類的豐富性。而菌株OCLB7（布氏乳桿菌）可以在低于15 ℃的環境中生長，可見青藏高原極端環境中分離出的乳酸菌對低溫的適應能力更強。

不同細菌種類16S rDNA 基因在功能和進化上具有同源性，基因序列變異頻率緩慢，因此在整體序列結構上極端保守，且擁有適宜的分子量大小，存儲了豐富的生物信息，是系統進化分類的可靠選擇［24］。對16S rDNA 序列進行分析，可以快速對微生物進行初步分類鑒定，基于16S rDNA 構建的系統進化樹也可以確定菌種在進化中的位置。一般認為，在種分類水平上若2個分類單位間16S rDNA 序列同源性高于97.5%，則屬于同一個種［25］。本研究中，菌株OLP1與類谷糠乳桿菌進化親緣度為100%；OCEF2與屎腸球菌進化親緣度為98%；OCPP3、OL36、OL77和OL205與戊糖片球菌進化親緣度為98%；OCLB7與布氏乳桿菌進化親緣度為100%；OCWC8和OCWC9與魏氏乳桿菌進化親緣度為100%，基本可以確定屬種。但OCLF4和OCLF6與香腸乳桿菌進化親緣度為96%；OCLP5與類食品乳桿菌和消化乳桿菌進化親緣度為89%，尚需要進一步鑒定。菌株OL3、OL8、OL25、OL54、OL122和OL194與植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和類植物乳桿菌進化親緣度為100%，但具體為哪一種尚不能確定。植物乳桿菌和戊糖乳桿菌在16S rDNA 序列上僅有2 bp 的差異，表現出極高的序列相似性，只通過16S rDNA 序列分析很難區分［13］。因此結合糖發酵結果，菌株OL3和OL54均能發酵D-木糖和鼠李糖，均不能發酵α-甲基-D-甘露糖苷和D-棉籽糖，因此鑒定為戊糖乳桿菌。而菌株OL8、OL25和OL122均能發酵α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖，均不能發酵D-木糖和鼠李糖，因而將其鑒定為植物乳桿菌［21］。

乳酸菌作為生物型添加劑直接增加了青貯原料中乳酸菌的數量，提高了發酵初期乳酸菌與其他微生物的競爭能力，有利于促進乳酸發酵的進程。關于植物乳桿菌、戊糖片球菌和戊糖乳桿菌作為青貯添加劑的報道較多，效果也非常顯著［12，26-31］。生長速度和產酸速率是篩選青貯用乳酸菌的重要指標［18］。本研究篩選的耐低溫菌株中，戊糖片球菌 OCPP3、OL36和 OL77，戊糖乳桿菌 OL3和 OL54，植物乳桿菌 OL8、OL25和 OL122的生長速度更快，產酸速率也顯著高于其他菌株；其中OL77、OL54和OL122表現較好，可作為燕麥低溫青貯調制的備選添加菌株。

4 結論

1）青藏高原地區燕麥附著乳酸菌資源豐富、種類多樣。從不同海拔地區初步分離到232 株乳酸菌資源，經進一步篩選，獲得56 株菌株。

2）56 株菌株中，18個菌株體現出了良好的耐低溫、耐低pH 和耐鹽能力，其中4 株為異型發酵乳酸菌，14 株為同型發酵乳酸菌。

3）14 株同型發酵乳酸菌中，有8 株產酸速率和生長速度較快，其中3 株為戊糖片球菌，2 株為戊糖乳桿菌，3 株為植物乳桿菌。

4）綜合考慮菌株的耐低溫能力、產酸速率和生長速度及多樣性，戊糖片球菌OL77、戊糖乳桿菌OL54和植物乳桿菌OL122可作為青藏高原地區燕麥低溫青貯發酵的備選添加菌株。