基于全腫瘤MRI篩選胰腺導(dǎo)管腺癌SMAD4表達影像-生物學(xué)標志物

梁 亮 ，董 行 ，羅榮奎，丁 鶯 ，周建軍 ，曾蒙蘇 *

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院放射科，廈門 361015

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院放射科，上海 200032

3.上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海 200032

4.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

作為消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，胰腺癌2018年全球新發(fā)病例達458 918例［1］，胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是其最常見的病理類型，惡性程度較高。由于缺乏有效的治療手段，患者預(yù)后大多較差，5年總生存率僅約7%［2］。目前，胰腺癌治療前的影像學(xué)評估主要基于病變形態(tài)、周圍結(jié)構(gòu)侵犯和遠處轉(zhuǎn)移等，無法充分反映胰腺癌的生物學(xué)特性，因此對治療方案的選擇、療效和患者生存質(zhì)量造成影響［3］。

研究生物學(xué)標志物是了解胰腺癌生物學(xué)行為的有效手段［4］。SMAD4基因是PDAC最重要的抑癌基因之一，其缺失導(dǎo)致腫瘤更具侵襲性，與腫瘤的發(fā)展及療效、預(yù)后不佳密切相關(guān)［5-7］。不同SMAD4基因表達患者的復(fù)發(fā)模式不同，SMAD4缺失者更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而表達SMAD4者多為局部侵犯［8-9］。因此，明確PDAC患者SMAD4基因表達對胰腺癌個體化精準診治具有重要的臨床價值。

臨床發(fā)現(xiàn)病變時，僅10%～30%的胰腺癌符合可手術(shù)切除條件［10-12］。而非手術(shù)活檢常難以獲得滿意的胰腺癌組織標本，且無法完整反映腫瘤的生物學(xué)特性和異質(zhì)性。近年來興起的影像組學(xué)技術(shù)能挖掘常規(guī)醫(yī)學(xué)影像中蘊含的深層數(shù)據(jù)，從中提取并定量分析高通量數(shù)據(jù)，在腫瘤生物學(xué)行為評估方面更有優(yōu)勢［13］，且可以發(fā)現(xiàn)肉眼無法識別的腫瘤特征［14］。以往研究［15-17］基于CT圖像和紋理分析，發(fā)現(xiàn)影像組學(xué)特征與胰腺癌患者生存情況及組織病理學(xué)等有一定相關(guān)性。但基于MRI的胰腺癌全腫瘤影像組學(xué)研究目前較少，且未見胰腺導(dǎo)管腺癌SMAD4基因表達相關(guān)影像-生物學(xué)標志物研究報道。

本研究應(yīng)用MRI和影像組學(xué)分析方法對PDAC進行全腫瘤影像學(xué)評價，結(jié)合組織病理學(xué)和SMAD4表達情況，尋找PDAC SMAD4表達的影像-生物學(xué)標志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2012年1月至2017年9月于復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院接受Magnetom Aera 1.5T MRI行腹部增強檢查且疑似胰腺惡性腫瘤的患者326例，其中經(jīng)本院手術(shù)病理學(xué)證實為PDAC，且符合入選排除標準的患者60例。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準（B2018-266），并免除書面知情同意。

納入標準：（1）在本院接受同一臺1.5T MRI腹部增強檢查，圖像質(zhì)量不影響全腫瘤評價；（2）手術(shù)后病理檢查證實為PDAC；（3）MRI檢查后1個月內(nèi)進行術(shù)前實驗室檢查及手術(shù)；（4）患者臨床資料完整，包括基本信息、實驗室檢查、手術(shù)經(jīng)過、病理檢查等；（5）有SMAD4表達檢測結(jié)果。排除標準：MRI檢查前行經(jīng)皮肝穿刺膽道引流（PTCD）、放置膽管支架或抗腫瘤治療，以及其他不宜參加研究的因素。

1.2 MRI檢查采用Magnetom Aera 1.5T MRI 成像儀（Siemens Healthcare公司）及相陣控體線圈，序列參數(shù)見表1。動態(tài)增強掃描采用自動監(jiān)測觸發(fā)掃描，監(jiān)測層面為腹主動脈。信號值達90時觸發(fā)并延遲10 s開始動脈期掃描，30 s后行門脈期掃描，80～120 s后行延遲期掃描。對比劑：釓噴酸葡胺，以0.1 mmol/kg注射，注射速率為1～2 mL/s。

表1 磁共振成像參數(shù)

1.3 全腫瘤影像組學(xué)特征提取

1.3.1 病灶分割由1名放射診斷醫(yī)師（具有11年腹部影像診斷經(jīng)驗）利用影像組學(xué)分析軟件（Radiomics, Siemens Healthcare公司），基于工作流中3D域的通用自動分割算法進行半自動腫瘤分割，覆蓋腫瘤整體，分割序列包括T1WI (VIBE)、T2WI、ADC圖、動脈期、門脈期和延遲期，當分割輪廓不正確時由研究者手動編輯輪廓。所有分割圖像均由另一名放射診斷醫(yī)師（具有13年腹部影像診斷經(jīng)驗）檢查確認。

基于工作流中3D域的通用自動分割算法進行半自動分割，分析軟件自動識別全腫瘤輪廓（黃線勾畫），見圖1。研究者于橫斷位（左上圖）、矢狀位（右上圖）和冠狀位（左下圖）連續(xù)層面確認輪廓是否準確，當分割輪廓不正確時由研究者手動編輯輪廓，勾畫完成后提取整體全腫瘤（右下圖黃色標識）進行分析。

圖1 Radiomics病灶分割

1.3.2 特征提取病灶分割完成后，軟件基于Pyradiomics library算法［18］自動提取病灶全腫瘤影像組學(xué)特征。每個序列獲得影像組學(xué)特征1 214個，其中包括一階統(tǒng)計（19個）、基于形狀（16個）、GLCM（24個）、GLRLM（16個）、GLSZM（16個）、NGTDM（5個）、GLDM（14個）七大類共110個，每個特征同時經(jīng)平方、平方根、對數(shù)、指數(shù)和小波等多個濾波器計算變換額外特征。

1.4 圖像分析

1.4.1 主觀評價由上述2名放射診斷醫(yī)師共同對PDAC影像學(xué)征象進行評價，由爭議時經(jīng)討論取得一致。評價利用PACS系統(tǒng)完成，指標包括病灶MRI信號、形態(tài)、境界、強化方式、有無壞死囊變、是否浸潤胰周組織、是否侵犯周圍血管、遠端胰管是否擴張、遠端胰腺是否萎縮、是否伴隨潴留囊腫形成等。

1.4.2 全腫瘤影像學(xué)定量評價對病灶短徑、長徑、全腫瘤ADC值、動脈期強化率、門脈期強化率、延遲期強化率、門脈期與動脈期強化差異、延遲期與動脈期強化差異及延遲期與門脈期強化差異等進行定量評價。原始定量數(shù)據(jù)利用影像組學(xué)一階統(tǒng)計指標獲得。平掃T1WI (VIBE)、T2WI、動脈期、門脈期及延遲期5個序列共6 070個征象進入影像基因組學(xué)特征篩選。

1.5 病理學(xué)評價SMAD4表達采用EnVision兩步法進行免疫組織化學(xué)染色檢測。組織蠟塊以4 μm厚度切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化及抗原修復(fù)后，使用抗SMAD4抗體（小鼠單克隆抗體B-8，sc-7966；Santa Cruz公司；1∶300稀釋），應(yīng)用全自動免疫組化染色系統(tǒng)（Bond Max，Leica Biosystems Melbourne Pty）及其配套聚合物優(yōu)化檢測試劑系統(tǒng)（DS9800，含過氧化物酶封閉劑、一抗后試劑、二抗試劑、DAB顯色液及蘇木精復(fù)染液，Leica Biosystems Newcastle）對切片進行染色。由我院一名病理科醫(yī)師（具有8年病理診斷經(jīng)驗）對患者病理組織切片重新閱片評價，確認病理類型及分化情況，并分析SMAD4表達情況［19］。SMAD4染色陽性區(qū)域小于10%者判定為SMAD4陰性表達（基因缺失）。根據(jù)免疫組化染色結(jié)果將患者分為SMAD4陽性表達組（圖2A）和陰性表達組（圖2B）。

圖2 PDAC組織SMAD4表達

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。分類變量以n(%)表示，組間比較采用Fisher確切概率法；連續(xù)性變量以x±s或M（P25,P75）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

通過最大相關(guān)最小冗余（maximum relevance minimum redundancy，mRMR）算法評估影像基因組學(xué)特征的冗余度和相關(guān)性，評估依據(jù)為互信息（mutual information，MI），校正P值閾值設(shè)定為0.10。多因素融合最佳模型通過最佳子集正向選擇獲得：從最佳特征開始，迭代所有剩余特征，將該特征添加到模型中，從而優(yōu)化所選標準；重復(fù)此過程，直到達到預(yù)定義的最大特征數(shù)。最佳子集依據(jù)貝葉斯信息準則（Bayesian information criterion，BIC）選擇，BIC值最小者為最佳子集。確定最佳子集后，采用ROC曲線檢測其診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料及病理學(xué)評價60例PDAC患者中，SMAD4陽性表達者11例（18.3%），SMAD4陰性表達者49例（81.7%）。結(jié)果（表2）顯示：2組性別分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.012），SMAD4陽性組以女性居多；2組年齡、CEA、CA19-9、病灶位置及分化程度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 臨床資料及病理學(xué)評價

2.2 影像學(xué)主觀評價結(jié)果（表3、圖3）顯示：2組間T1WI、T2WI信號，增強后延遲強化，病變侵犯等情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 不同SMAD4表達組PDAC影像學(xué)表現(xiàn)

表3 2組間影像學(xué)主觀評價比較

2.3 全腫瘤影像學(xué)定量評價結(jié)果（表4）顯示：2組病灶大小、ADC、不同時相強化率及強化差異 的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 2組間全腫瘤影像學(xué)定量評價比較

2.4 全腫瘤影像組學(xué)分析經(jīng)基于SMAD4表達的PDAC全腫瘤影像組學(xué)特征篩選，共獲得6個影像組學(xué)特征（表5、圖4），用于多因素影像基因組學(xué)特征融合建模。建模所得最佳特征子集為門脈期_wavelet-HHL_NGTDM_Contrast+T1WI_wavelet-HHL_GLDM_HighGrayLevelEmphasis（表6），BIC為33.4；ROC分析（圖5）顯示：該子集預(yù)測PDAC患者SMAD4表達的曲線下面積（AUC）為0.92（P＜0.001），預(yù)測靈敏度為90.9%、特異度為81.6%，組內(nèi)預(yù)測準確度為83.3%。

表5 基于SMAD4表達的PDAC全腫瘤影像組學(xué)特征單因素篩選結(jié)果

圖4 基于SMAD4表達的PDAC全腫瘤影像組學(xué)特征單因素篩選熱圖

表6 SMAD4表達的PDAC全腫瘤影像基因組學(xué)特征最佳子集

圖5 全腫瘤影像基因組學(xué)特征最佳子集預(yù)測SMAD4表達的ROC曲線

用顏色表示篩選所得6個特征的分布情況，綠色代表低值、黃色代表高值、黃綠色代表中間值；每行表示1個影像組學(xué)特征，列對應(yīng)所有研究對象，上方淺藍色對應(yīng)SMAD4陽性表達者11例，上方深藍色對應(yīng)SMAD4陰性表達者49例。

3 討 論

全球胰腺癌發(fā)病率占癌癥的第11位，2018年所導(dǎo)致的死亡占癌癥的第7位［1］。由于其缺乏有效治療手段，患者預(yù)后多較差，且致死率不斷上升。有研究［20］認為，2030年，胰腺癌將成為癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。對胰腺癌生物學(xué)行為的深入了解，將胰腺癌的影像學(xué)評估由單純的形態(tài)學(xué)評價向影像-生物學(xué)評價模式轉(zhuǎn)變，作為組織病理學(xué)標志物的補充，有利于胰腺癌診治手段的發(fā)展。

SMAD4基因是重要的PDAC生物學(xué)標志物，是其最重要的抑癌基因之一。在PDAC患者中，SMAD4的缺失比例為55%～81.6%［7,19］，本研究中SMAD4基因缺失比例與此相符。SMAD4基因與細胞基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)，功能包括抑制腫瘤生長、介導(dǎo)細胞周期停滯以及誘導(dǎo)細胞凋亡等［21-22］，缺失將導(dǎo)致腫瘤更具侵襲性。

本研究中，SMAD4陽性表達組與陰性表達組間性別分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，SMAD4陰性表達組中男性比例高于SMAD4陽性表達組（P＝0.012），這可能是男性PDAC患者死亡率高于女性的原因之一。

本研究中，2組影像學(xué)主觀評價及定量評價指標差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。以往研究［23］對PDAC的CT表現(xiàn)進行分析，發(fā)現(xiàn)表達SMAD4的PDAC境界更清楚、胰周組織浸潤較SMAD4表達陰性者少，但組間差異不大。本研究的主觀評價指標中，SMAD4陽性表達組的形態(tài)不規(guī)則（27.3%vs38.8%）、壞死囊變（0vs14.3%）和侵犯周圍血管（27.3%vs49.0%）比例均低于陰性表達組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，有待擴大樣本量進一步研究。

本研究中，影像組學(xué)技術(shù)一定程度上彌補了上述影像學(xué)常規(guī)評價未能發(fā)現(xiàn)SMAD4基因相關(guān)影像-生物學(xué)標志物的不足，并初步建立了PDAC影像基因組學(xué)模型。作為發(fā)展于影像組學(xué)的技術(shù)，影像基因組學(xué)將影像與基因相關(guān)特征相互關(guān)聯(lián)［24］，從而深入了解腫瘤生物學(xué)行為、發(fā)掘腫瘤內(nèi)在的異質(zhì)性，是個體化精準醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要方向之一［25］。影像基因組學(xué)的研究與應(yīng)用，有望實現(xiàn)在體全腫瘤基因分析，預(yù)測個體治療的療效、可能的不良反應(yīng)，從而選擇最優(yōu)治療方案、改善預(yù)后［26］。

此外，本研究對PDAC病灶進行了全腫瘤影像學(xué)評價。與僅選取最大橫截面進行分析相比，全腫瘤影像學(xué)分析更能體現(xiàn)腫瘤的內(nèi)在生物學(xué)特征，并避免研究過程中選取最大橫截面時發(fā)生的選擇偏倚，結(jié)果更可靠［27］。因此，包括影像組學(xué)特征在內(nèi)的全腫瘤影像學(xué)分析有望無創(chuàng)獲取PDAC的影像-生物學(xué)標志物，且無需增加額外的檢查和醫(yī)療費用。

本研究僅探討了PDAC單一基因相關(guān)的影像基因組學(xué)特征，但篩選所得的最佳特征子集具有較好的診斷效能（AUC為0.92，組內(nèi)預(yù)測準確度為83.3%），子集內(nèi)的特征代表了病灶體素灰度的分布、變化和差異等圖像深層信息，反映了腫瘤的異質(zhì)性等生物學(xué)特征［13］。目前，PDAC相關(guān)影像-生物學(xué)標志物及影像基因組學(xué)研究仍然較少，本研究可作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

本研究也存在一定的局限性：（1）由于病例數(shù)相對較少，未對影像基因組學(xué)結(jié)果進一步驗證，而在特征篩選過程中通過mRMR算法和校正P值確保了組內(nèi)特征篩選的可靠性；（2）僅對SMAD4基因表達進行了研究，今后希望能在擴大樣本量的基礎(chǔ)上，通過多種檢測方法實施PDAC多基因融合的影像基因組學(xué)研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。