miR-29c在腎纖維化大鼠中的表達水平及其與腎間質纖維化程度的關系▲

徐小龍 江 鵬 羅景印 張劍歌 黃海鵬

(廣西醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，南寧市 530007，電子郵箱：gzzyxxl@163.com)

腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是許多病因導致的腎功能衰竭的共同途徑和病理表現，是目前臨床研究的熱點問題，主要表現為細胞外基質成分的生成和降解失衡[1]。穿刺活檢是目前診斷RIF的金標準,但因其具有創傷性，很難成為臨床上持續性跟蹤的常規檢查手段，因此探索一種診斷RIF的無創方法具有重要的臨床意義。近年來，許多學者試圖揭開miRNA與器官纖維化發生和發展的關系，尋求診斷和治療的新靶點。研究表明，在單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)小鼠模型中，隨著RIF程度的加重，其腎組織中miR-29的表達水平下降，并預測miR-29可以通過抑制轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)發送信號來發揮抗纖維化作用[2]。miR-29家族包括miR-29a、miR-29b、miR-29c，研究表明，UUO小鼠模型腎組織miR-29c表達量與RIF病情程度關系密切[3]，但是該研究并未就血清中miR-29c的表達水平與RIF的關系做進一步的闡明。本研究通過建立成熟大鼠UUO模型，探討大鼠血清和腎組織中miR-29c表達水平與RIF的相關性，及其與TGF-β1/Smad3纖維化信號通路的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 20只4周齡雄性SD大鼠購于南方醫科大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(粵)2006-0015]，體質量在200～250 g之間，飼養于動物實驗中心，飼養食物為專用鼠糧，正常進水，飼養中心保持通風清潔，溫度在25℃左右。TRI Reagent BD(RNA抽提試劑)購自濟南科賽特科技公司(批號：TB126-500)；氯仿、異丙醇、100%乙醇、0.02 M乙酸鈉、甲醛均購自上海化學試劑有限公司；75%乙醇(100%乙醇為原料，以DEPC處理水配制而成)；冰醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司(批號：1000218)；無RNA酶的水和無RNA酶的糖原購自美國Invitrogen Life Technologies公司(批號：AM9930、A216-01)；TE緩沖液(pH 8,含10 mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，1 mM乙二胺四乙酸)和0.2 M MOPS緩沖液(pH 7.0)購自華美生物工程公司(批號：AA0060-500ml、BJ-P64004)；甲醛上樣染液購自上海Ambion公司(批號：XH051)；GoldView染料購自上海賽百勝基因技術有限公司(批號：PH0621)；瓊脂糖購自上海生工生物工程有限公司(批號：A600015-0025)；RNA酶抑制劑、MMLV反轉錄酶、10×RT緩沖液均購自北京Epicentre公司(批號：PM11369、M4425H、T1087)；2.5 mM dNTP混合液(dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5 mM)購自美國HyTest有限公司(批號：R72501)；RT Primers購自上海百力格生物技術有限公司(批號：4399966)；2×PCR Master Mix購自美國Arraystar公司(批號：K0171)；RNALater保存液購自上海前塵生物科技有限公司(批號：AM70210)；TGF-β1和Smad3免疫組化試劑盒購自美國St.Louis生物公司(批號：7754-BH-005/CF、AF3797-SP)，TGF-β1、Smad3一抗均為兔抗鼠多克隆抗體。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立：將20只SD雄性大鼠按隨機數字表法分為假手術組(Sham組)和UUO組，每組10只。采用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行腹腔注射麻醉，在左側腹腎區做一2～3 cm切口后打開腹腔，游離大鼠左側輸尿管，分別于近左腎門處和輸尿管上1/3水平處結扎UUO組大鼠輸尿管，僅游離Sham組大鼠輸尿管但不結扎；然后縫合腹壁，術后將大鼠放置于清潔干燥環境中飼養，自由進食水。實驗結束后，在獲取標本時觀察輸尿管和腎盂情況，如術側結扎部位以上輸尿管、腎盂明顯擴張，且腎盂較對側明顯增大，則表明建模成功，本實驗建模成功率為100%。

1.2.2 大鼠血液及術側腎組織標本獲取：模型建立后第3天和第7天，采用單純隨機抽樣法分別從各組中抽取5只大鼠，采用2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行腹腔注射麻醉，打開大鼠的腹腔和胸腔，心臟取全血2～3 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，在室溫下(25℃左右)1 200 r/min離心30 min后分離血清，放入-80℃冰箱保存備用；心臟取血后立即使用冰鹽水進行心臟灌注，直至術側腎臟變蒼白后取出術側腎臟，去除腎臟表面組織，垂直于腎臟長軸切取2塊1～2 mm厚的腎組織，分別置于4%甲醛和RNALater保存液中，放入-80℃冰箱保存備用。本研究對所有動物的處理均符合醫學倫理學規定。

1.2.3 血清及腎組織miR-29c表達水平的測定：取1.2.2步驟所獲得的血清和RNALater保存液中的腎臟組織標本，按照試劑盒說明書，經勻漿、兩相分離、RNA沉淀、RNA清洗、重新溶解RNA沉淀后，提取血清及腎組織中的總RNA；以RNA為模板、RT混合液為反應液，使用實時熒光定量PCR擴增儀進行反轉錄反應合成cDNA。反轉錄混合反應液包括dNTP(2.5 mM)2 μL、10×RT緩沖液2 μL、反轉錄特異引物(1 μM)0.3 μL、總RNA 600 ng、MMLV反轉錄酶(200 U/μL)0.2 μL、RNA酶抑制劑(40 U/μL) 0.3 μL，加無RNA酶水至總體積為20 μL。反應條件為16℃ 30 min、42℃ 40 min、85℃ 5 min。反轉錄中，內參U6引物序列為5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′，rno-miR-29c引物序列為5′GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTAACCG3′。獲取cDNA后進行PCR擴增，反應體系包括2×Master Mix 5 μL、10 μmol/L的PCR特異上游引物0.5 μL、10 μmol/L的PCR特異下游引物0.5 μL、加水至總體積為8 μL。將上述溶液混合，5 000 r/min短暫離心后，將8 μL混合液加到384-PCR板對應的每個孔中，再加入對應的2 μL cDNA，粘上封口膜，將384-PCR板短暫離心后置于實時熒光定量PCR儀上進行PCR擴增，反應條件為95℃，10 min；40個循環(95℃，10 s；60℃，60 s)；為了建立PCR產物溶解曲線，在上述擴增反應基礎上，加溶解曲線反應條件(95℃,10 s；60℃,60 s；95℃,15 s)，溫度降到60℃后再緩慢加熱到99℃，可獲得溶解曲線。反應結束后分析PCR產物溶解曲線，并以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。qRT-PCR反應中，內參U6上游引物序列為5′GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3′，下游引物序列為5′CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3′； 對應miRNA的特異引物5′GGGTAGCACCATTTGAAA3′，與反轉錄引物相匹配的引物5′TGCGTGTCGTGGAGTC3′。

1.2.4 腎組織Masson染色：取1.2.2步驟中置于4%甲醛的腎臟組織標本行Masson染色，觀察RIF程度。取4%多聚甲醛固定的腎組織，經蒸餾水沖洗、固定、脫水、透明、浸蠟和包埋后，切成厚約3 μm的切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，蒸餾水沖洗。麗春紅、酸性品紅染色15 min，1%冰醋酸洗2次，2 min/次。1%磷鉬酸染色5 min。1%冰醋酸洗2次，2 min/次，1%亮綠染色15 min，1%冰醋酸洗2次，2 min/次，脫水，透明，封固。按Banff分級半定量評分[6]評估RIF纖維化程度。每個標本在光鏡下隨機選取10個不重復的腎皮質區(×200)，通過觀察以下5個參數評估RIF病變程度，即腎小管萎縮、間質纖維化、水腫、炎性反應、小管再生或退行性病變，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算每個參數占視野的百分比，每個參數根據病變范圍的百分比按0～3分評定，0分為正常，1分為病變范圍<25%，2分為病變范圍在25%～50%之間，3分為病變范圍>50%，每個視野5個參數得分之和為該視野的評分。

1.2.5 腎組織免疫組化：取1.2.2步驟中置于4%甲醛的腎臟組織標本，采用EliVision法進行免疫組化。將3 μm石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸緩沖液沸水煮20 min修復抗原，3%過氧化氫滅活內源性酶，兔抗鼠TGF-β1(1 ∶100)、Smad3(1 ∶100)多克隆抗體4℃孵育過夜，滴加聚合物增強劑后滴加酶標抗鼠/兔聚合物，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色反應；蘇木素復染，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，每個標本隨機選取10個不重復視野(×200)觀察抗體陽性表達情況(抗體陽性表達部位呈黃色)，計算每個視野中陽性面積所占視野面積的百分比。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗；采用Spearman秩相關檢驗進行相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組大鼠血清和腎組織miR-29c表達水平的比較 建模后3 d、7 d，UUO組大鼠血清和腎臟組織的miR-29c表達水平均低于Sham組(均P<0.05)； 建模后7 d UUO組大鼠的血清和腎臟組織miR-29c表達水平均低于建模后3 d(均P<0.05)，而在Sham組中不同時間點miR-29c表達水平差異則無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠血清和腎組織miR-29c相對表達水平的比較(x±s)

2.2 兩組大鼠的RIF程度比較 Masson染色結果顯示，建模后3 d、7 d，Sham組大鼠腎組織基本正常，未見明顯變化。建模后3 d,UUO組大鼠腎組織出現灶狀小管上皮扁平化、管腔擴張，腎間質散在單個核細胞浸潤和腎間質輕度水腫，腎小球結構基本正常；建模后7 d，UUO組大鼠腎小球明顯水腫，腎間質廣泛存在單個核細胞浸潤、間質明顯水腫。建模后3 d、7 d，UUO組大鼠的RIF程度評分均高于Sham組，且UUO組大鼠建模后7 d的RIF程度評分高于建模后3 d的RIF程度評分(均P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 兩組大鼠腎組織病理學改變(Masson染色,×200)

表2 兩組大鼠腎組織RIF程度評分的比較(x±s,分)

2.3 兩組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平的比較 建模后3 d、7 d，UUO組大鼠腎組織的TGF-β1和Smad3蛋白表達水平均高于Sham組(均P<0.05)；UUO組大鼠建模后7 d的腎組織TGF-β1和Smad3蛋白表達水平均高于建模后3 d的表達水平(均P<0.05)，而建模后3 d、7 d，Sham組的TGF-β1、Smad3蛋白表達水平差異并無統計學意義(均P>0.05)。見表3、圖2、圖3。

圖2 兩組大鼠腎組織的TGF-β1蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

圖3 兩組大鼠腎組織的Smad3蛋白表達情況(免疫組化染色,×200)

表3 兩組大鼠腎組織TGF-β1、Smad3蛋白相對表達水平的比較(x±s，%)

2.4 UUO組大鼠miR-29c、TGF-β1蛋白、Smad3蛋白表達水平與RIF程度的相關性 UUO組大鼠血清和腎組織miR-29c表達水平與RIF程度評分均呈負相關(rs=-0.581、-0.712，均P<0.001)；血清和腎組織的miR-29c表達水平與腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平均呈負相關(rs=-0.741、-0.695、-0.682、-0.594,均P<0.001)；腎組織TGF-β1、Smad3蛋白表達水平與RIF程度評分均呈正相關(rs=0.631、0.684，均P<0.001)；血清miR-29c表達水平與腎組織miR-29c表達水平呈正相關(rs=0.752，P<0.001)；腎組織TGF-β1蛋白表達水平與Smad3蛋白表達水平呈正相關(rs=0.812，P<0.001)。

3 討 論

miRNA是由20～23個核苷酸組成的短鏈非編碼RNA序列，編碼miRNA的基因主要位于染色體的內含子或非編碼外顯子，由miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ作用下轉錄形成初級轉錄產物,在輸出蛋白復合物作用下，初級轉錄產物由核內被輸送至細胞質，經核糖核酸酶Ⅲ剪切為21～23nt的雙鏈miRNA。成熟的miRNA被保留在RNA誘導的沉默復合體中，通過抑制靶基因的表達發揮調控靶基因的作用[4]，在不同的生物學進程及病理進程中發揮重要作用，包括細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、腫瘤發生和發展、器官的形成、組織纖維化、瘢痕形成等[5]，且 miRNA在血清、組織、尿液或其他體液中的表達比較穩定[6]。研究表明，miR-192、miR-21表達水平升高可促進腎臟纖維化,miR-29c表達水平升高可抑制腎臟纖維化[7-8]。miR-29包括miR-29a、miR-29b和miR-29c，在成熟的組織細胞中廣泛表達，在腎臟、心臟、肺組織中的表達尤為明顯[9-11]。Qin等[12]的研究表明，大鼠纖維化腎組織中的miR-29表達水平與RIF程度呈負相關，并檢測到纖維化腎組織中的Smad3蛋白表達水平升高。TGF-β1是公認的最主要的致纖維化因子，主要是通過TGF-β1/Smad3通路介導腎小管上皮細胞轉分化，在RIF的發生、發展過程中起重要作用[13]。Smad蛋白是TGF-β1信號傳導通路中的重要傳導介質，到目前為止共發現11種Smad蛋白，根據結構和功能的不同其可分為三大類，即受體激活型(R-Smads)、共用型(Co-Smads)、抑制型(I-Smads)，TGF-β1在調控組織或器官纖維化過程中首先與絲氨酸/蘇氨酸激酶受體Ⅱ型受體結合，使Ⅱ型受體發生磷酸化后轉變成激活受體，激活的Ⅱ型受體又使細胞膜上的Ⅰ型受體活化，活化的Ⅰ型受體可使細胞質內的某些信號蛋白分子(主要是Smad3蛋白)磷酸化，磷酸化的Smad3蛋白分子與Smad4蛋白分子結合成復合物轉移至細胞核內，作為轉錄因子調控轉錄及轉錄后的過程，而這種過程主要是通過miRNA的調控來實現[14-15]。已有研究證實miR-29c在大鼠UUO腎組織中的表達水平與RIF程度呈負相關[16]，但UUO血清中miR-29c表達水平與RIF的相關性如何目前尚未清楚。

本研究檢測UUO大鼠模型的miR-29c水平，并分析其與RIF程度的相關性。結果顯示，建模后3 d、7 d，UUO組大鼠梗阻側腎臟較對側增大，病理證實纖維化加重，表示建模成功。且在建模后相同時間點，與Sham組大鼠比較，UUO組大鼠腎組織的RIF程度明顯加重，血清與腎組織的miR-29c表達水平降低，腎組織的TGF-β1與Smad3蛋白表達水平均升高；且隨著RIF程度的加重，UUO組大鼠血清與腎組織miR-29c表達水平逐漸降低，腎組織TGF-β1及Smad3蛋白表達水平逐漸升高；相關性分析結果顯示，UUO組大鼠血清與腎組織的miR-29c表達水平與RIF程度評分、TGF-β1及Smad3蛋白表達水平均呈負相關(均P<0.05)，提示在腎纖維化進程中，miR-29c與TGF-β1、Smad3呈負反饋調節關系。

綜上所述，腎纖維化大鼠血清和腎組織中的miR-29c表達水平降低，且與RIF程度呈負相關，miR-29c可能通過調節TGF-β1/Smad3通路參與腎纖維化的發生與發展。血清miR-29c有可能成為診斷腎纖維化的無創性指標。本研究的局限性在于miR-29c與RIF的相關性仍是推論，且本研究的實驗對象為大鼠UUO模型，所得結論是否適用于人體，還需進一步研究。