不同濃度丙泊酚麻醉孕中期大鼠對雄性子代學習和記憶功能的影響及其機制▲

梅 靜 喇宏玲 徐桂萍

(新疆維吾爾自治區人民醫院麻醉科,烏魯木齊市 830001，電子郵箱：my7future7@163.com)

人類神經發育過程中接觸麻醉劑會導致神經變性和長期神經行為異常，例如學習障礙和記憶障礙等[1]。孕中期是神經發生和神經元遷移的時期，在此期間胎兒對外部環境十分敏感。而隨著腹腔鏡手術和胎兒手術的迅速發展，越來越多的孕婦在懷孕期間，特別是在孕中期進行手術。因此，麻醉劑對胎兒出生前神經發育的影響受到越來越多學者的關注。已有研究表明，丙泊酚可能對子代長期行為產生影響，但其結論仍然存在很大的爭議[2-3]。因此，需要進一步研究丙泊酚對孕中期胎兒神經發育的影響及其機制。研究證實，鈣離子-鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的磷酸化或激活，可激活環磷酸腺苷效應元件結合蛋白(cyclic AMP responsive element binding protein,CREB)從而影響個體的學習和空間記憶，對海馬區的記憶功能鞏固發揮著關鍵作用[4-5]。但目前關于丙泊酚麻醉孕中期大鼠對子代海馬組織中CaMKⅡ/CREB信號通路的影響的研究較少。因此，本研究探討丙泊酚麻醉孕中期大鼠對子代學習和記憶缺陷的影響，并觀察CaMKⅡ/CREB信號通路在其中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物、試劑與耗材 72只8周齡成年無特定病原體級SD雌性大鼠和24只雄性大鼠購于新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心[生產許可證號為SYXK(新)2016-0001，質量合格證號為NO.65000200000364]。生長相關蛋白43(growth-associated protein 43,GAP43；批號：ab75810)、突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95；批號：ab238135)、B細胞淋巴瘤蛋白-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2；批號：ab182858)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax；批號：ab32503)、Caspase3(批號：ab32351)、Cleaved-caspase3(批號：ab32042)、CaMKⅡ(批號：ab181052)、CREB(批號：ab32515)、磷酸化CREB(phosphorylated-3-CREB,p-CREB；批號：ab32096)和內參蛋白GAPDH(批號：ab9485)一抗和二抗(批號：ab6721)均購于美國Abcam公司；視頻跟蹤系統購于上海移動數據有限公司(型號：XR-XM101)；丙泊酚購于美國Sigma Aldrich公司(批號：2078-54-8)，KN-93磷酸鹽購于美國Selleck化學公司(批號：S7423)，尼氏染色試劑盒購于上海碧云天公司(批號：C0117)，戊巴比妥鈉(分析純)購于德國默克公司(批號：20160411)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養環境：成年SD大鼠飼養于在(24±1)℃的環境中，光照/黑暗周期為12 h/12 h，動物自由攝食和飲水。所有實驗程序和實驗方案均獲得我院實驗動物倫理委員會批準[文號PHXUAR-LL-2020-0453-R]，并按照美國國立衛生研究院《實驗動物的護理和使用指南》[6]的原則，使所用動物的總數及動物的痛苦最小化。

1.2.2 孕鼠的麻醉劑暴露和剖腹探查術：將3只雌鼠與1只雄鼠關于一籠中(共24籠)，進行自由交配。第2天通過目測觀察每只雌鼠的陰道栓子聯合陰道涂片檢測來判斷是否存在精子，如存在則認為受孕成功，并定義為孕0 d，由此推算并選擇孕期為14 d的母鼠進行實驗(本研究中每只雌鼠均檢測到精子并存在陰道栓子)。于自制透明塑料瓶中固定孕期為14 d的72只雌性大鼠，采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進行麻醉，行頸內靜脈穿刺放置靜脈導管。使用隨機數字表法將雌鼠分為4組，每組18只，其中對照組(C組)經頸內靜脈注射2 mL/kg生理鹽水后不做任何處理；丙泊酚低劑量組(L組)經頸內靜脈注射1.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉誘導，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續靜脈泵注1.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術，麻醉時間4 h；丙泊酚中劑量組(M組)經頸內靜脈注射1.5%的丙泊酚2 mL/kg進行麻醉誘導，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續靜脈泵注1.5%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術，麻醉時間4 h；丙泊酚高劑量組(H組)經頸內靜脈注射2.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉誘導，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續靜脈泵注2.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術，麻醉時間4 h。

1.2.3 剖腹探查術：以翻正反射消失作為動物麻醉誘導成功的標準。成功麻醉誘導后剪去L組、M組、H組大鼠的腹毛，對露出的皮膚使用75%無菌酒精消毒3遍，使用0.125%丁哌卡因(0.2 mL/只)進行局部麻醉，于腹部正中做一長約3 cm的縱向切口。無菌探查腹腔范圍包括膈肌(肝臟)、盆腔、膀胱、兩側腹中線水平(脾臟或腎)；隨后用2 mL的37℃無菌生理鹽水沖洗腹腔，吸凈液體，用75%酒精消毒切口。采用4-0縫線間斷縫合腹膜和肌層，采用3-0縫線間斷縫合皮膚并消毒，擦干切口血漬。在25 min內完成手術。大鼠蘇醒后放回原籠，繼續妊娠。

1.2.4 圍術期監測：麻醉各組動物后，采用RM6240生理信號采集處理系統、血壓計、血氣分析儀分別監測其心電圖、血壓、血氧飽和度，麻醉結束后立即從母鼠髂外靜脈取血進行血氣分析。麻醉期間監測孕鼠血氧飽和度、血壓、心率，剔除血氧飽和度<95%或平均動脈壓超出/低于基礎值20%的孕鼠。從上述4組中每組隨機選12只血氧飽和度、血壓、心率正常的孕中期大鼠，進行后續實驗。

1.2.5 收集生殖發育參數：統計上述的48只孕鼠的妊娠時長，即從孕0 d開始到子代出生，以及子代大鼠的性別比例、數量和體重。

1.2.6 檢測子代的學習記憶功能：子鼠出生后30 d，從各組母鼠所產的所有雄性子代中按隨機數字表法選擇30只，進行學習和空間記憶檢測(為排除發情周期對嚙齒動物行為的影響，僅對雄性子代進行了行為測試)。采用Morris水迷宮系統(美國CoulBOURN公司)檢測大鼠的學習記憶功能。將Morris水迷宮系統(直徑1.6 m、深0.6 m，第Ⅱ象限中有可移動的圓柱形平臺直徑0.15 m)置于固定的測試間內，每日8：00開始測試，水溫(23±1)℃，第Ⅱ象限的平臺在水下1 cm，每日訓練1次。第1～5天(出生后30～34 d)觀察大鼠的定位航行能力，即從離平臺最遠的第Ⅲ象限選擇一固定入水點將大鼠背對平臺放入水中；若90 s內大鼠找到平臺，則將其留在平臺上20 s，若90 s內未能找到，將其引上平臺同樣停留20 s。記錄大鼠尋找到平臺的時間，即為逃避潛伏期，若90 s內未找到平臺，按90 s計算。第6天(出生后35 d)行空間探索實驗，撤去水中平臺，于固定的進入點將大鼠放入水中，記錄90 s內在第Ⅱ象限停留時間及穿越原平臺次數。每次試驗后，干燥大鼠毛發并用熱燈溫暖5 min，然后再放回常規籠。取所測雄性子代的平均值作為最終測定結果。

1.2.7 抑制劑注射和學習、空間記憶測試：由于實驗結果顯示M組和H組劑量丙泊酚對子代學習記憶缺失的影響高于L組，且H組與M組子代學習記憶缺失的影響無明顯差異，因此選擇M組子代用于機制研究。于M組的雄性子代出生后36 d(測試完成后1 d)隨機選取6只，腹腔注射CaMKⅡ的特異性抑制劑KN-93磷酸鹽0.5 mg/kg，用生理鹽水溶解至2.5 mL，1次/d，持續 7 d (出生后36～42 d)，作為M+KN-93組。另取出生后36 d的M組雄性子代大鼠作為對照，腹腔注射2.5 mL生理鹽水(1次/d，持續7 d)，作為M+saline組。于出生后43～48 d使用Morris水迷宮法檢測大鼠子代的學習記憶能力。

1.2.8 Western blot分析：在C組、L組、M組、H組、M+KN-93組及M+saline組的子代大鼠完成最后一次Morris水迷宮測試后，采用隨機數字表法在每組選擇3只子代大鼠,斷頭法處死后分離腦海馬組織。海馬組織勻漿后用RIPA裂解緩沖液提取海馬組織總蛋白，用于測定GAP43、PSD95、凋亡標志物(Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3、CaMKⅡ，CREB、p-CREB、GAP43、PSD95的表達。經過SDS-PAGE分離并隨后轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、Caspase3(1 ∶500)、Cleaved-Caspase3( 1 ∶1 000)、CaMKⅡ(1 ∶1 000)、CREB(1 ∶600)、p-CREB(1 ∶800)、GAP43(1 ∶1 000)、PSD95(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)的一抗4℃孵育過夜，用1×Western Wash Buffer洗滌3次，每次5 min。洗滌后用辣根過氧化物酶結合的免疫球蛋白G抗體(二抗)孵育1 h，用1×Western Wash Buffer洗滌3次，每次5 min。通過增強化學發光法使蛋白條帶顯色，使用Amersham Biosciences ECL檢測系統掃描蛋白條帶，并通過ImageJ軟件進行定量，實驗重復3次。

1.2.9 尼氏染色觀察神經元的密度：選擇M+KN-93組及M+saline組的出生后48 d的子代大鼠各3只，經斷頭法處死，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛經心臟灌流，然后取出腦組織，并在4℃下于4%多聚甲醛中固定過夜。石蠟包埋后，距前囟3.3 mm處行冠狀切片(厚4 μm)，并行尼氏染色。使用數字顯微鏡照相機(德國徠卡公司)捕獲CA1區域的錐體細胞層的代表性顯微照片。每只大鼠計算3張尼氏染色切片的細胞圖像。由兩名工作人員使用ImageJ軟件以盲法對尼氏染色陽性神經元細胞進行計數。實驗重復3次。神經元密度=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.3 統計學分析 采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間采用t檢驗或單因素方差分析(采用LSD-t進行多重比較)。以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對雌鼠生殖結局和子代體格發育參數的影響 4組雌鼠的妊娠時長、每只雌鼠產仔數、子代雄雌比、雄性子代體重比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 4組雌鼠生殖結局和子代發育參數的比較(x±s)

2.2 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對子代學習記憶能力的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數均減少，第Ⅰ象限的停留時間均延長，而第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；與L組大鼠雄性子代相比，M組和H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數均減少，第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；而M組和H組大鼠雄性子代上述指標差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組大鼠雄性子代Morris水迷宮系統檢測指標的比較(x±s)

組別n平臺穿越次數(次)各象限停留時間(s)ⅠⅡⅢⅣC組305.724±0.9729.213±1.45343.561±6.98827.536±4.03511.545±2.164L組303.584±0.671a18.891±3.094a32.564±3.162a26.563±4.31412.191±2.971 M組302.474±0.433ab17.244±2.552a19.672±2.711ab26.644±1.66012.094±2.385 H組302.094±0.213ab17.012±1.231a15.694±1.302ab27.941±2.32113.172±2.562 F值176.11682.652225.14521.55217.632P值0.0110.0310.0090.0620.115

2.3 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對子代海馬區凋亡相關蛋白表達的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代海馬區的Bax、Cleaved-Caspase3表達量均上調， Bcl-2、GAP43、PSD95表達量均下調(均P<0.05)；與L組比， M組、H組大鼠雄性子代海馬區的Bax、Cleave-Caspase3表達量均上調，Bcl-2、GAP43、PSD95表達量均下調(均P<0.05)；而4組大鼠雄性子代海馬區的Caspase3表達量，以及M組與H組上述蛋白表達量比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見圖1、表3。

圖1 4組凋亡相關蛋白電泳條帶圖

表3 4組大鼠雄性子代海馬區凋亡相關蛋白相對表達量的比較(x±s)

2.4 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對子代海馬組織CaMKⅡ/CREB信號通路激活的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代海馬組織的CaMKⅡ蛋白表達量均上調，p-CREB蛋白表達量均下調；與L組相比，M組、H組大鼠雄性子代海馬區的CaMKⅡ蛋白表達量均上調，p-CREB蛋白表達量均下調(均P<0.05)；而4組大鼠雄性子代海馬區的CREB蛋白表達量，以及M組與H組上述蛋白表達量比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見圖2、表4。

圖2 4組CaMKⅡ/CREB信號通路蛋白電泳圖

表4 4組大鼠雄性子代海馬區CaMKⅡ、CREB、p-CREB蛋白相對表達量的比較(x±s)

2.5 KN-93磷酸鹽對大鼠雄性子代學習記憶能力的改善作用 在出生后48 d，與M+saline組相比，M+KN-93組大鼠雄性子代的逃避潛伏期變短，平臺穿越次數增加，第Ⅱ象限停留時間延長，海馬組織中CaMKⅡ蛋白表達量下調，p-CREB、GAP43、PSD95蛋白表達量上調，神經元細胞密度增加(均P<0.05)。見表5～6和圖3～4。

表5 兩組大鼠雄性子代Morris水迷宮測試結果的比較(x±s)

表6 兩組大鼠海馬區相關蛋白相對表達量和神經元細胞相對密度的比較(x±s)

圖3 兩組雄性子代海馬區尼氏染色結果(×200)

圖4 兩組大鼠海馬區相關蛋白電泳圖

3 討 論

盡管既往已有研究證實在胎兒期接觸丙泊酚對其長期神經發育結局的影響，但研究結果仍存在爭議[7-8]。有研究表明， 2.5%丙泊酚單次暴露2 h可損害子代小鼠的學習和記憶功能[9]。然而，另一項類似的研究表明，懷孕小鼠接觸丙泊酚不會導致子代小鼠出現學習行為異常[10]。上述研究之間的差異可能與物種、麻醉方案的差異(確切孕齡、麻醉劑類型、劑量、暴露時間等)或行為測試的敏感性有關。本研究采用孕14 d的大鼠進行實驗，此階段被認為與人類妊娠的孕中期相似[11]。本研究中孕中期大鼠丙泊酚的暴露方式為：經頸內靜脈注射(1.0%、1.5%、2.0%)2 mL/kg丙泊酚進行麻醉誘導，然后以 20 mg/(kg·h)的速度持續靜脈泵注丙泊酚，并行剖腹探查手術，麻醉時間為 4 h，該時間長度與臨床真實情況更類似。然而在一些臨床手術中，為了放松子宮平滑肌并為胎兒干預提供足夠的麻醉，胎兒腦部可能會遭受到濃度更高的麻醉劑造成的損害[12]。因此，本研究觀察不同濃度(1.0%、1.5%、2.0%)的丙泊酚麻醉對大鼠子代學習記憶的影響。本研究結果顯示，C組、L組、M組、H組雌性大鼠的妊娠期、每只雌鼠產仔數、子代雄雌比、雄性子代體重比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，說明孕中期接觸丙泊酚未對雌性大鼠生殖結局和雄性子代體格發育造成影響。本研究的Morris水迷宮測試結果表明，與C組大鼠雄性子代相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數均減少，第Ⅰ象限的停留時間均延長、第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；與L組大鼠雄性子代相比，M組和H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時長均增加，平臺穿越次數均減少，第Ⅱ象限的停留時長均縮短(均P<0.05)；而M組和H組大鼠雄性子代上述指標比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。這說明孕中期大鼠接觸低、中、高濃度的丙泊酚均能引起雄性子代的學習和記憶能力部分缺失，且中、高濃度丙泊酚的作用更明顯。

研究表明，CaMKⅡ的磷酸化或激活對海馬區的記憶的鞏固發揮著關鍵作用[13]，而且海馬CaMKⅡ/CREB信號通路在藥物誘導學習記憶功能衰退中具有重要意義。已有研究證實CaMKⅡ/CREB信號通路介導了重金屬誘導動物的學習記憶能力衰退，其中海馬區CaMKⅡ激活受到抑制和CREB激活(CREB磷酸化)增加是改善認知功能障礙的關鍵[14]。本研究結果顯示，不同濃度丙泊酚麻醉孕中期大鼠后，其雄性子代的學習記憶能力明顯降低。Caspase3經過切割、活化之后會變成Cleaved-Caspase3，而后者是高活性的細胞凋亡激活酶，本研究結果顯示，各丙泊酚干預組中海馬區Cleaved-Caspase3表達量增加，同時凋亡標志物Bax蛋白表達量也增加，而且凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達量降低(均P<0.05)，這表明丙泊酚對海馬神經元可能有促凋亡的作用。進一步研究發現，各丙泊酚干預組中大鼠雄性子代大腦海馬區CaMKⅡ的激活增加以及CREB的激活減少，表現為CaMKⅡ的磷酸化水平上調，而CREB的磷酸化受到抑制，而且中、高濃度丙泊酚的作用更明顯；使用CaMKⅡ抑制劑抑制其激活時，伴隨著海馬區CREB激活的增加，子代大鼠的學習記憶能力明顯恢復。這些結果表明丙泊酚麻醉孕中期大鼠可通過激活CaMKⅡ/CREB信號通路影響雄性子代的學習、記憶能力。另外，本研究結果顯示，不同濃度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠可降低其雄性子代海馬區突觸可塑性相關蛋白PSD95和GAP43的表達量，而有趣的是，當使用CaMKⅡ抑制劑抑制其激活后，大鼠雄性子代海馬組織的神經元細胞密度增加，而且海馬區PSD95和GAP43蛋白的表達量均上調。這表明海馬區的神經元數目及PSD95、GAP43表達可能受到CaMKⅡ/CREB信號通路調節。有學者發現，CaMKⅡ/CREB信號通路在海馬神經元保護和突觸可塑性中的主導作用[15]。

本研究存在幾個局限性：首先，由于為了減少實驗中處死動物的數量，本研究僅選擇中劑量丙泊酚組(M組)大鼠的子代作為機制研究，所得結果可能會有偏倚；其次，為避免子代大鼠受發情期的影響，本研究中僅選用大鼠雄性子代作為研究對象，丙泊酚對于大鼠雌性子代的影響仍需進一步研究。

綜上所述，使用不同濃度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠均會導致雄性子代的學習、記憶功能下降，并伴有海馬組織CaMKⅡ蛋白表達上調及CREB激活程度降低，抑制CaMKⅡ表達可提高大鼠雄性子代的學習、記憶功能，其作用機制可能與CREB激活有關，CaMKⅡ/CREB信號通路可能是治療孕中期丙泊酚暴露致子代學習、記憶能力缺失的關鍵靶點。