響應面優化雜交構樹葉黃酮提取工藝及對5 種禽病原菌的抑制作用

魏 磊， 景炳年， 王品勝， 高正龍， 謝曉陽， 陳譚星， 孟慶法， 王 偉

（1.河南省植物天然產物開發工程技術研究中心，河南鄭州 450002；2.河南省高新技術實業有限公司，河南鄭州 450002；3.河南省科學院地理研究所，河南鄭州 450052）

禽大腸桿菌病、 沙門菌病和葡萄球菌病是嚴重損害家禽生長的細菌性傳染病， 具有常見性和高發性，主要包括氣囊炎、腦膜炎、臍炎、敗血癥、傷寒、腸炎、白痢、化膿性關節炎、各臟器嚴重感染等癥狀 （吳陳俊，2021； 商春穎，2020； 何松芳，2017），是由禽致病性細菌如大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌等引起，給家禽產業造成嚴重的經濟損失，同時也嚴重威脅著禽產品消費者的健康安全。 使用抗生素可有效改善這些癥狀， 但會在動物體內及其制品中殘留從而直接威脅人類健康， 尤其長期低劑量地在飼料中進行添加更易產生耐藥性的超級細菌（王云鵬等，2008）。因此在飼料及飼料添加劑行業尋找安全、高效、穩定、易得的抗生素替代品迫在眉睫。天然植物及其提取物以其資源豐富、來源廣泛、毒副作用低、殘留少和不易產生耐藥性等獨特優點作為飼料或飼料添加成分備受青睞（劉華等，2020；Mulat 等，2019）。

研究表明， 沙棘黃酮可提高飼料中蛋白質和鈣的利用率，提高肉雞胴體品質（李垚等，2008）。艾葉黃酮可提高肉雞小腸抗氧化能力， 抑制腸道內產酸克雷伯菌生長（Wan 等，2016）。 青蒿黃酮可提高肉雞血清中抗氧化酶活性， 降低丙二醛的含量（Zhao 等，2016）。 槲皮素可促進IgY 抗體分泌， 提高肉雞免疫性能 （Hager-Theodorides 等，2014）。黃芩黃酮對雞大腸桿菌和雞白痢具有明顯的體內抑菌作用, 并對人工誘發的雞大腸桿菌病和雞白痢有明顯的防治效果（梁英等，2007）。 總之， 植物黃酮作為飼料添加成分進行研發應用的前景廣闊。

構樹（Broussonetia papyrifera），為?？茦嫎鋵俣嗄晟淙~喬木或灌木。 構葉以其蛋白質含量豐富，適口性好，成為豬、牛、羊、雞等畜禽養殖的新型飼料（邳植等，2018），含有的天然活性成分主要為黃酮和多糖等物質。 雜交構樹是中國科學院通過野生構樹雜交和太空搭載等技術手段培育出的構樹新品種。相較普通構樹，雜交構樹蛋白質含量更高、纖維素含量更低、生長快耐刈割（黃炎坤等，2020）。 2015 年雜交構樹產業被評為國家十大精準扶貧項目之一。 目前僅有雜交構樹樹皮黃酮對真菌抑制作用研究（開偉華等，2015）及普通構樹葉黃酮和根黃酮對大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌和弧菌的抑制作用研究（徐夢宇等，2011； 李萬倉，2008），針對雜交構樹葉片黃酮的響應面結合超聲波輔助提取工藝優化及其對禽主要致病菌的抑制作用鮮見報道。

因此， 本文結合響應面法和超聲波法優化雜交構葉黃酮的乙醇提取工藝， 并檢測雜交構葉黃酮對5 種禽致病菌即雞源大腸桿菌、 鼠傷寒沙門菌、雞白痢沙門菌、雞傷寒沙門菌、雞源金黃色葡萄球菌的抑制作用， 旨在為雜交構葉黃酮開發為天然植物飼料添加成分及加速雜交構葉資源的綜合開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 構葉為中國科學院植物研究所培育的兩年生雜交構樹“科構101”葉片，采自河南省開封市蘭考中科華構生物科技有限公司生產基地，陰干后粉碎備用；禽致病菌包括：雞源金黃色葡萄球菌CVCC 548、 雞源大腸桿菌CVCC 1555、雞白痢沙門菌CVCC 1887、鼠傷寒沙門菌CVCC 3384、雞傷寒沙門菌QAU 0320，購自中國獸醫藥品監察所；蘆丁，購自中國藥品生物制品檢定所；牛肉浸膏，購自北京雙旋微生物培養基制品廠；胰蛋白胨，購自上海保錄生物科技有限公司；96 孔板，購自美國Corning 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 雜交構葉黃酮提取 稱定1.00 g 雜交構葉粉，倒入100 mL 三角瓶中，加入一定料液比、一定濃度乙醇溶液，在一定溫度下超聲一定時間，重復提取3 次，濾液合并后于旋轉蒸發儀上濃縮，定容至25 mL， 取20 μL 進行黃酮濃度和含量的測定。

1.2.2 蘆丁標準曲線繪制及黃酮含量測定 以蘆丁為標準品，采用分光光度法測定黃酮含量?？v坐標為吸光度（A），橫坐標為蘆丁質量濃度（C），繪制標準曲線，求得回歸方程。根據回歸方程計算提取液黃酮含量。 黃酮提取得率計算公式為：

提取得率/%=黃酮質量濃度×提取液體積×稀釋倍數×100/雜交構葉質量。

1.2.3 雜交構葉提取黃酮單因素試驗及響應面設計 單因素試驗包括乙醇濃度（A） 、料液比（B） 、超聲溫度（C）和超聲時間（D）四個獨立試驗，再根據Box-Behnken 試驗設計原理，按照Design-Expert 8 軟件安排29 組試驗并對結果進行分析，得到雜交構葉黃酮提取優化方案。 試驗設計因素水平和29 組試驗結果分別見表1 和表2。

表1 因素與水平

表2 響應面試驗設計方案和結果

1.2.4 雜交構葉黃酮制備工藝 按照上述響應面優化后的提取工藝提取雜交構葉黃酮， 抽濾濃縮至一定體積后加入該體積2 倍的無水乙醇， 低溫靜置24 h 去除多糖后真空冷凍干燥，即得雜交構葉黃酮樣品。

1.2.5 雜交構葉黃酮對禽致病菌抑制作用

1.2.5.1 菌懸液制備 5 種禽致病菌37 ℃搖床復蘇后接種于固體培養基上， 過夜培養后挑取單個菌落混懸于液體培養基中， 使用麥氏比濁儀檢測菌液濃度， 將各菌株調制成106～108CFU/mL 的菌懸液。

1.2.5.2 最小抑菌濃度（MIC）測定 MIC 采用二倍稀釋法進行測定。將1.2.4 項下雜交構葉黃酮配制成400 mg/mL 母液后用0.22 μm 濾膜過濾，再依次倍比稀釋9 個濃度，依次為200、100、50、25、

12.5 、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL。 將10 個濃度梯度黃酮藥液各100 μL 分別加入96 孔板中， 再分別加入100 μL 1.2.5.1 項下制備好的各種菌懸液。 陽性對照加入100 μL 菌懸液和100 μL液體培養基，陰性對照加入200 μL 液體培養基。96 孔板加蓋密封后37 ℃培養過夜，觀察結果，無菌生長的最小濃度為MIC 值。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線 以蘆丁質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制蘆丁標準曲線， 得到蘆丁標準曲線方程為A=0.2608C-0.0276，R2=0.9985，線性關系良好， 結果如圖1 所示。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度 當料液比1：20 g/mL、 超聲溫度30 ℃、時間20 min 時，考察乙醇濃度（20%、40%、60%、80%、100%） 對雜交構葉黃酮提取得率的影響，結果如圖2A。在乙醇濃度為60%時得率最大，根據相似相溶原理推測雜交構葉黃酮極性與60%乙醇相似，故最佳乙醇濃度為60%。

2.2.2 料液比 當乙醇濃度60%、超聲溫度30 ℃、時間20 min 時， 考察料液比（1:20、1:30、1:40、1:50、1:60 g/mL）對雜交構葉黃酮提取得率的影響，結果如圖2B。 得率隨提取試劑體積增加而升高，在料液比為1:50 g/mL 時達到最大， 因此選擇最佳料液比為1:50 g/mL。

2.2.3 超聲溫度 當乙醇濃度60%、料液比1:50 g/mL、 超聲時間20 min 時， 考察溫度（20、30、40、50、60 ℃） 對雜交構葉黃酮提取得率的影響，結果如圖2C。40 ℃時得率最高，50 ～60 ℃時得率下降， 推測溫度過高會影響黃酮分子結構穩定性而發生轉化或降解，因此選擇40 ℃為最佳提取溫度。

2.2.4 超聲時間 當乙醇濃度60%、料液比1:50 g/mL、超聲溫度40 ℃，考察提取時間（20、30、40、50、60 min）對雜交構葉黃酮提取得率的影響，結果如圖2D。 得率隨時間延長而升高，30 min 達到最大，此后略有下降。推測超聲時間延長會增加雜質溶出，降低提取效果，故選擇30 min 為最佳超聲時間。

圖2 乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）、超聲時間（D）對雜交構葉黃酮提取得率的影響

2.3 響應面試驗結果 采用Design-Expert 8 軟件對表2 數據進行分析， 求得擬合回歸方程：Y=1.69118 +0.045317A -0.13675B +0.12140C -0.13302D-0.080900AB-0.031100AC+0.023600AD-0.072550BC-0.15110BD-0.13500CD-0.34897A2-0.24237B2-0.31140C2-0.12105D2。 對擬合模型進行方差分析，結果見表3。

表3 回歸模型系數檢驗

由表3 可知，模型P＜0.0001，差異極顯著（P＜0.01）。 決定系數R2=0.9632，說明96.32%的雜交構葉黃酮提取得率變化符合該模型， 模型擬合程度良好，表明該試驗模型成立。 信噪比Adeq Precision 為15.462，遠大于4，說明方程的擬合度和可信度較高，試驗誤差較小。 由各因素F 值可知四個因素對雜交構葉黃酮提取得率影響顯著性順序為料液比（B）＞超聲時間（D）＞超聲溫度（C）＞乙醇濃度（A），B、C 和D 之間交互作用極顯著，A與B、C、D 之間交互作用不顯著，表明雜交構葉多糖提取得率與各因素間不單單是線性關系。 失擬項P值0.1030 ＞0.05，不顯著，表明模型與具體試驗結果吻合程度高。 因此該模型可對雜交構葉黃酮提取得率進行預測和分析。

利用Design-Expert 8 軟件作出響應面圖，如圖3 所示。 響應面均開口向下，存在極高值。 響應面坡度陡峭程度反映交互作用強弱，越陡峭，表明響應值對因素改變越敏感， 反之影響越?。◤埶?，2015）。 圖3 直觀反映了各因素交互作用對響應值的影響，料液比和超聲時間、超聲溫度和超聲時間交互作用曲面陡峭， 表明其對雜交構葉黃酮提取得率交互作用明顯。

圖3 兩因素交互作用對雜交構葉黃酮提取得率影響的響應面圖

用響應面軟件得出雜交構葉黃酮最佳提取工藝為：乙醇濃度60.8%，料液比1：48.6 g/mL，超聲溫度33.5 ℃，超聲時間23.5 min，在此預測工藝條件下，黃酮提取得率為1.77%。為便利試驗操作修正為：乙醇濃度60%，料液比1：49 g/mL，超聲溫度34 ℃，超聲時間24 min，在此條件下重復3 次試驗，得到雜交構葉黃酮平均提取得率為1.75%，達到預測值的98.87%，說明應用響應面法優化雜交構葉黃酮的超聲輔助提取工藝模型有效， 參數可靠，具有一定參考價值，為雜交構葉黃酮的深度開發提供理論依據。

2.4 抑菌試驗結果 雜交構葉黃酮對5 種禽致病菌抑制作用結果見表4。 對所選5 種禽致病菌的MIC 為6.25 ～50 mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為殺死99.9% （降低3 個數量級）的供試菌種所需的最低藥物濃度，其范圍為12.5 ～100 mg/mL，整體抑菌作用較強， 尤其是對金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌抑制作用最強。

表4 雜交構葉黃酮對5 種禽致病菌MIC和MBC 檢測結果

3 討論與結論

本研究通過響應面法對雜交構葉黃酮超聲輔助提取工藝進行了優化，對乙醇濃度，料液比，超聲溫度，超聲時間進行了單因素試驗，得出雜交構葉黃酮提取的最優工藝參數為乙醇濃度60%，料液比1：49 g/mL，超聲溫度34 ℃，超聲時間24 min，在此條件下，雜交構葉黃酮提取得率為1.75%，試驗誤差小，說明所得優化提取工藝參數可靠性高。朱開梅等（2011）采用微波輔助提取結合正交法優化提取構葉黃酮， 其最佳工藝為提取溫度45 ℃，時間15 min， 料液比1：10 g/mL， 微波功率350 W，此條件下，黃酮提取量為1.39 mg/g（相當于提取得率0.139%），該工藝的提取效率低于本試驗。而楚芳冰等（2015）采用超聲輔助提取結合正交法優化提取構葉黃酮，確定的最佳工藝為料液比1：30 g/mL，超聲時間40 min，乙醇濃度50%，溫度50 ℃，此條件下黃酮提取得率可達4.01%，高于本試驗。 由此可見，不同方法、構樹品種、產地、樹齡及采摘季節都會影響黃酮類物質在體內的生成和積累， 應深入研究變化規律才能在最佳時節采收。

目前， 在雛雞和青年雞階段多數養殖場使用大量抗生素，控制傳染性細菌病的發生，但忽視對傳染源和傳播途徑的綜合防控， 最終導致致病菌對常規抗生素的敏感性降低，耐藥性加大，藥物治療效果變差，養殖成本增加。本研究中雜交構葉黃酮對5 種重要致病菌的抑制作用由強到弱分別為：金黃色葡萄球菌MIC=6.25 mg/mL、鼠傷寒沙門菌MIC=12.5 mg/mL、大腸埃希菌MIC=25 mg/mL、雞白痢沙門菌MIC=25 mg/mL、 雞傷寒沙門菌MIC=50 mg/mL，整體抑菌效果顯著，作為雞飼料添加成分防治傳染性細菌病前景廣闊。 本研究為雜交構葉黃酮類物質開發為飼料添加成分的進一步研究與應用提供理論參考。