肥料配施對北蒼術3種倍半萜類成分及2種生物合成關鍵酶基因表達的影響

王孟聰，翁麗麗，孫 金，肖春萍，陳天麗

肥料配施對北蒼術3種倍半萜類成分及2種生物合成關鍵酶基因表達的影響

王孟聰，翁麗麗，孫 金，肖春萍*，陳天麗*

長春中醫藥大學藥學院，吉林 長春 130117

探討不同肥料配施對北蒼術(DC.) Koidz. 3種倍半萜成分蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇含量及2種生物合成關鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy- 3- methylglutarate monoacylase A reductase，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）活性及基因表達的影響。在不同的肥料配施下，采用高效液相色譜法測定北蒼術3種倍半萜類成分的含量，采用試劑盒法（雙抗體夾心法）測定北蒼術根莖中HMGR和FPPS的活性；采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法測定北蒼術HMGR和FPPS的表達量；采用SPSS軟件對生物合成關鍵酶活性和基因表達量進行相關性分析。適宜的氮磷鉀配施，可促進北蒼術倍半萜類成分的積累，并顯著提高其生物合成關鍵酶活性及基因表達。該試驗區所代表的土壤肥力狀況下有利于倍半萜類成分積累的最優施肥方案為氮肥（N）180 kg/hm2，磷肥（P2O5）225 kg/hm2，鉀肥（K2O）105 kg/hm2。不同肥料配施下，關鍵酶基因HMGR與蒼術酮、β-桉葉醇呈顯著正相關（＜0.05）；關鍵酶基因FPPS與白術內酯II、β-桉葉醇呈極顯著正相關（＜0.01），與蒼術酮顯著相關（＜0.05）。優化氮磷鉀配施對北蒼術倍半萜類成分蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇積累及生物合成關鍵酶HMGR和FPPS活性及基因表達作用顯著，北蒼術根莖中倍半萜類成分蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇的生物合成受到多種基因及酶的調控，其中關鍵酶FPPS發揮了較大的調控作用。

北蒼術；肥料配施；倍半萜；3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶；法呢基焦磷酸合酶；基因表達；白術內酯II；β-桉葉醇；蒼術酮

北蒼術(DC.) Koidz.為菊科多年生草本植物，以干燥根莖入藥[1]。倍半萜類成分是蒼術屬植物主要化學成分，主要包括蒼術酮、白術內酯II、蒼術苷A、β-桉葉醇等，具有抗炎、抗腫瘤、保護神經系統、保肝、抗菌、抗病毒等廣泛的藥理作用，此類成分的提高對于北蒼術藥材質量的控制意義重大[2-4]。研究表明[5-8]，倍半萜類成分多數通過甲羥戊酸途徑在植物體內合成，3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase，HMGR）和法呢基焦磷酸合酶基因（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）是倍半萜類化合物生物合成途徑的關鍵酶和限速酶。HMGR對MVA途徑起催化作用，FPPS催化倍半萜化合物的前體化合物法呢基二磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）的合成[9-10]。藥材質量與土壤中營養成分組成等密切相關，氮、磷、鉀是植物生長發育過程中的重要營養元素，合理配施可以引起植物有效成分性質或含量的變化，孫金等[11]研究發現科學合理的氮、磷、鉀配施可以促進北蒼術生長和北蒼術中倍半萜類成分含量的增加，但目前針對肥料配施對北蒼術中倍半萜類成分生物合成影響的研究較少，作用機制尚不明確。因此，本研究以北蒼術為材料，研究不同肥料配施下北蒼術根莖中蒼術酮、白術內酯II、β-桉葉醇3種倍半萜類成分含量以及關鍵酶HMGR和FPPS活性和基因表達量，分析北蒼術倍半萜類與關鍵酶活性及基因表達之間的關系，為闡明肥料配施對北蒼術倍半萜類成分合成的分子調控機制，提高北蒼術倍半萜類成分含量和品質奠定理論基礎，并為北蒼術種植過程中合理的肥料配施提供理論依據。

1 材料

1.1 試驗區概況及供試材料

選擇前茬作物為玉米的地塊作為試驗田，具體位置位于吉林省柳河縣安口鎮北蒼術種植基地，地理位置125°36′4.94″E，42°12′37.65″N，海拔399 m。對土壤情況進行測定：土壤pH為5.65、有機質含量為51.73 g/kg、速效氮、有效磷、速效鉀含量分別為41.89、94.40、143.54 mg/kg。選取長勢相近，葉莖完好，無病蟲害，植株健壯，根系發達的一年生北蒼術苗作為供試材料移栽試驗田，由吉林省昌農實業集團有限公司柳河北蒼術栽培基地提供。經長春中醫藥大學中藥資源與鑒定教研室翁麗麗教授鑒定為北蒼術(DC.) Koidz. 正品。試驗中尿素（N，總氮≥46%）、過磷酸鈣（P2O5，總磷≥46%）、硫酸鉀（K2O，總鉀≥50%）為試驗用肥料。

1.2 試劑

對照品蒼術酮（批號P11M10F73437，質量分數≥97.3%）、β-桉葉醇（批號P24O8F46474，質量分數≥99.4%）、白術內酯II（批號M22A10S95762，質量分數≥99.9%）均購于上海源葉生物科技有限公司。磷酸、乙腈為色譜純；甲醇分析純；水為超純水。植物通用總RNA提取試劑盒，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司）。植物HMGR ELISA檢測試劑盒、植物FPPS ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 試驗設計

參考依據北蒼術種植基地對北蒼術的多年種植實踐經驗，對本實驗的施肥種類和施肥時間進行設置。采用L9(34)正交試驗設計優化設置施肥方案[11]，設置氮、磷、鉀3個因素，4個水平，正交試驗方案見表1。設置10個不同的施肥處理，3次重復，30個小區，小區總面積150 m2，每個小區3 m2（1.5 m×2.0 m），行株距為15 cm×20 cm，每個小區栽種100株北蒼術。北蒼術植株于2019年5月25日移栽，移栽前無任何施肥，后期除肥料按設計施用外，其他田間管理措施一致。

表1 L9(34)正交試驗設計的施肥種類和施肥量

Table 1 Fertilization types and fertilization amount of orthogonal experiment L9(34)

處理組合施用量/(kg·hm?2) 尿素（N）過磷酸鈣（P2O5）硫酸鉀（K2O） T0N0P0K0 0 0 0 T1N1P1K1 90 75105 T2N1P2K2 90150210 T3N1P3K3 90225315 T4N2P1K2180 75210 T5N2P2K3180150315 T6N2P3K1180225105 T7N3P1K3270 75315 T8N3P2K1270150105 T9N3P3K2270225210

5月下旬（苗期）施入基肥，N肥60.0%、P肥100.0%、K肥33.3%，N、P、K比例為6∶8∶4；6月下旬（營養生長期）和8月下旬（果期）分別進行1、2次追肥處理，其中N肥20.0%、K肥33.3%，N、K比均為2∶4。將不同處理組合的氮磷鉀肥用相同體積自來水溶解，均勻噴施于小區土壤表面。

2.2 樣品的收集

移栽北蒼術種苗前，隨機選取其中的200株測定其生長指標，計算其各指標平均值則為基礎生物量。取樣時間是種苗移栽后的第30、60、90、120、150 d，在每個平行小區隨機取樣6株，將取樣后的北蒼術裝入冰盒帶回實驗室，將樣品除去地上部分和須根后進行清洗，吸水紙吸干附著水分，其中一部分根莖樣品進行分裝、液氮固定，儲存于?80 ℃冰箱備用，另一部分洗凈后室內陰干，干燥后粉碎過篩備用。

2.3 含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取白術內酯II、β-桉葉醇、蒼術酮適量，加甲醇溶解，配制成質量濃度為10.1、33.0、53.4 μg/mL的混合儲備液，備用。

2.3.2 供試品溶液的制備 將處理后的北蒼術藥材粉碎過三號篩，精密稱定0.3 g，參照《中國藥典》2020年版一部蒼術項下含量測定方法，制備供試品溶液。

2.3.3 蒼術酮、白術內酯II、β-桉葉醇含量測定 色譜條件參照本課題組前期建立的北蒼術一測多評方法[6]。

2.3.4 線性回歸方程的繪制 精密量取“2.3.1”項下混合儲備液逐級稀釋成系列濃度（分別為原濃度的1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025倍），取15 μL注入高效液相色譜儀。以峰面積為縱坐標（），質量濃度為橫坐標（），進行線性回歸，回歸方程見表2。

表2 3種對照品回歸方程和線性范圍

Table 2 Regression equations and linear ranges of three reference substances

成分回歸方程r線性范圍/μg 蒼術酮Y＝18 717.410 7 X＋1 756.575 80.999 70.020 0～0.801 0 白術內酯IIY＝47 177.499 2 X＋483.693 00.999 90.003 8～0.151 5 β-桉葉醇Y＝30 772.658 2 X＋4 034.467 60.999 50.012 4～0.495 0

2.4 關鍵酶活性測定

稱取北蒼術根莖0.2 g，加入1.8 mL預冷的0.01 mol/L PBS（pH 7.4，NaCl 8 g、Na2HPO41.44 g、KH2PO40.24 g），液氮研磨成勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心20 min。采用試劑盒法（雙抗體夾心法）測定不同肥料配施下北蒼術根莖中關鍵酶HMGR和FPPS的活性，操作步驟按照試劑盒內說明書進行，2種關鍵酶HMGR標準曲線及測定范圍分別為＝0.030 5＋0.075 4，＝0.999 1，線性范圍為0～80 U/L；FPPS標準曲線＝0.004 8＋0.038 2，＝0.999 5，線性范圍為0～400 U/mL。

2.5 關鍵酶基因表達量測定

2.5.1 植物總RNA的提取與cRNA的合成 根據Takara植物通用總RNA提取試劑盒說明書提取北蒼術根莖總RNA，采用Multiskan Sky全波長酶標儀測定樣品RNA濃度及純度，并將其反轉錄成cDNA，?20 ℃儲存，備用。

2.5.2 引物設計與合成 以EF-1α為內參基因[12]，根據試驗樣品中轉錄組篩選出的HMGR和FPPS基因片段，由上海生工設計合成引物，引物序列見表3。

2.6 引物特異性檢測

2.6.1 北蒼術內參基因及關鍵酶基因實時熒光定量PCR熔解曲線 以北蒼術根莖中cDNA為模板，陰性（NTC）為對照進行實時熒光定量PCR，所得熔解曲線見圖1，結果表明EF-1α、HMGR和FPPS均為特異性單峰，空白對照無擴增，且沒有引物二聚體及非特異性擴增干擾，說明本實驗引物具有較高的特異性，符合試驗要求。

表3 實時熒光定量PCR引物

Table 3 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

基因TRINITY引物序列（5’-3’）產物長度/bp EF-1α 正向ACCAACTGGGTTGACAACTGAAGT 64 反向AGCCTCGGTAAGGGCTTCAT HMGRDN14568正向AACCGCCACCACTCACTCACATTCTTC109 反向GGACGCCGTTGCTTCTGGAC FPPS 正向TCTTGCGTGTGCCCTTGGTTG206 反向TGACCTCTGCGTGTATGGGACTC

A-EF-1α基因 B-HMGR基因 C-FPPS基因

2.6.2 北蒼術內參基因及關鍵酶基因實時熒光定量PCR擴增曲線與擴增效率 進行實時熒光定量PCR擴增，結果發現以5倍梯度稀釋北蒼術根莖組織cDNA后，得到的擴增曲線平滑，指數擴增期明顯，得到的北蒼術內參基因和關鍵酶相關基因和的相對定量標準曲線見圖2，其相關系數及擴增效率符合試驗要求，表明該方法的準確性和重復性較好。

2.6.3 實時熒光定量PCR擴增 以cDNA為模板，根據表2中各基因的引物序列，按照20 μL反應體系（SYBR?Premix ExTM10.4 μL，10 μmol/LForward Primer 0.8 μL，10 μmol/L Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL）及反應程序[95 ℃預變性30 s；40個循環（95 ℃變性5 s，64 ℃退火1 min）]對不同肥料配施下北蒼術和基因表達量進行測定，每個樣品3個生物學重復。RT-PCR反應內參基因為。

A-EF-1α基因 B-HMGR基因 C-FPPS基因

2.7 數據處理

使用Excel 2019進行試驗數據的換算和預處理，計算實時熒光定量PCR結果采用2-△△Ct法[13]進行；數據分析、各參數之間的多重比較及圖形繪制等利用SPSS 21.0、GraphPad prism 6.0、Photoshop CC 2018進行。

3 結果與分析

3.1 肥料配施對北蒼術3種倍半萜成分含量的影響

3.1.1 肥料配施對北蒼術蒼術酮含量的影響 北蒼術種苗基礎蒼術酮質量分數為（1.807 4±0.042 1）mg/g。由圖3可知，不同肥料配施下，不同方案的北蒼術根莖中蒼術酮含量在移栽的30～120 d時期整體呈現下降的趨勢，質量分數0.968 8～5.249 3 mg/g。移栽150 d時，各方案下的蒼術酮含量呈現上升的趨勢，質量分數在1.355 4～4.525 2 mg/g。T4施肥方案各個時期的蒼術酮含量與同時期其他組相比，處于較高水平，特別在移栽150 d時，蒼術酮含量明顯較高，質量分數達到4.525 2 mg/g，是空白組（T0）的1.51倍。綜合分析，采用T4施肥方案，北蒼術根莖中蒼術酮含量會達到較高水平，說明該施肥方案能夠有效促進倍半萜類成分代謝，增加蒼術酮的合成與積累。

不同字母表示差異性顯著，P＜0.05，下同

3.1.2 肥料配施對北蒼術β-桉葉醇含量的影響 北蒼術種苗基礎β-桉葉醇質量分數為（2.948 8±0.095 8）mg/g。由圖4可知，不同肥料配施下，不同方案北蒼術根莖中β-桉葉醇在30～150 d呈現下降趨勢，移栽30 d的β-桉葉醇范圍在2.491 5～5.180 5 mg/g。比較各方案30～120 d各個時期北蒼術根莖中β-桉葉醇量，T6方案相對較高，在60、90、120 d的β-桉葉醇質量分數分別達到1.013 2、0.817 8、1.388 1 mg/g，是空白組T0的1.35、3.91、8.74倍。移栽150 d較前一時期整體呈上升趨勢，T6方案仍然處于較高水平，β-桉葉醇質量分數為0.963 3 mg/g，是空白組的1.76倍。由此可知，T6方案北蒼術根莖中的β-桉葉醇含量在發育期較高，表明不同肥料配施的比例可能發揮相似的協同作用，實際生產過程中可以通過調控肥料的用量和配比降低農業生產成本。

3.1.3 肥料配施對北蒼術白術內酯II含量的影響 北蒼術種苗基礎白術內酯II質量分數為（0.275 7±0.001 7）mg/g。由圖5可知，不同肥料配施下，北蒼術根莖中白術內酯II的含量變化趨勢與β-桉葉醇相似，不同方案下的北蒼術根莖中白術內酯II含量在移栽30～150 d時期整體呈現下降的趨勢。移栽30 d時的北蒼術根莖中白術內酯II質量分數在0.449 2～0.783 7 mg/ g，其中T6施肥方案下的白術內酯II質量分數為0.738 6 mg/g，與其他組相比相對較高。綜合移栽30～150 d各個時期，T6方案相對其他方案白術內酯II含量處于較高水平，在30、60、90、120、150 d的白術內酯II質量分數分別為0.738 6、0.607 5、0.461 0、0.445 3、0.638 5 mg/g，是空白組的1.30、1.89、1.08、1.53、1.58倍。綜合上述分析，T6方案施肥下北蒼術根莖中的白術內酯II含量在發育期較高，證明該施肥方案可以促進倍半萜類成分的合成與積累。

圖4 不同氮磷鉀配施對北蒼術中β-桉葉醇含量的影響()

圖5 不同氮磷鉀配施對北蒼術白術內酯II含量的影響()

3.1.4 不同肥料配施下北蒼術最佳施肥方案分析 綜合性評價采收期（即150 d時）不同肥料配施下的北蒼術生長狀況，分析方法采用模糊數學隸屬函數法，隸屬函數公式如下。當某一指標與生長狀況呈負相關時，采用公式（2）進行計算[11]。

U（X）=(X－min)/(max－min) （1）

U（X）=1－(X－min)/(max－min) （2）

U（X）為不同肥料配施下北蒼術某個測定指標，min為該指標的最小值，max為該指標的最大值。

通過計算不同肥料配施下北蒼術各指標的平均隸屬函數值，分析施肥條件對北蒼術生長的影響。平均隸屬函數值越大，說明該施肥條件越有利于北蒼術生長。由表4可知，不同肥料配施下各指標的隸屬均值均大于空白組T0，北蒼術根莖倍半萜類成分含量的隸屬函數從小到大依次為T0＜T5＜T9＜T8＜T1＜T7＜T4＜T2＜T3＜T6。說明不同肥料配施直接影響北蒼術根莖倍半萜類成分積累，適宜的氮磷鉀配施可以積極作用北蒼術生長，基于此分析，T6（N2P3K1）方案效果最優。

3.2 肥料配施對2種生物合成關鍵酶基因活性和表達量的影響

3.2.1 不同氮、磷、鉀配施對北蒼術關鍵酶HMGR活性的影響北蒼術種苗基礎關鍵酶HMGR活性為（63.38±1.19）U/L。由圖6可知，不同肥料配施下，北蒼術關鍵酶HMGR活性在移栽30～90 d呈下降趨勢，90～120 d無顯著變化，移栽150 d較120 d整體呈上升趨勢。移栽150 d時關鍵酶HMGR的活性范圍在64.530 0～96.388 0 U/L，達到了相較于整個時期的較高水平。T4施肥方案在移栽30～150 d關鍵酶HMGR活性較高，特別是移栽60～150 d，關鍵酶HMGR活性分別是84.857 9、83.273 2、81.579 2、81.415 3 U/L，是空白組T0的1.15、1.29、1.44、1.17倍。縱觀整個生長期，T4施肥方案下，發育期內HMGR活性相較于其他方案表現為更高水平，推測此方案影響倍半萜類成分的生物合成，說明合理的施肥方案可以提高酶活性，促進北蒼術次生代謝。

表4 不同氮磷鉀配方施肥下北蒼術根莖倍半萜類成分含量的隸屬函數分析

Table 4 Membership function analysis of content of sesquiterpenes in rhizomes of A. chinensis under different NPK fertilization

編號質量分數/%隸屬均值 蒼術酮白術內酯II β-桉葉醇 T000.0300.01 T10.680.320.070.36 T20.761.000.420.73 T30.990.640.690.77 T40.860.100.540.50 T50.340.060.050.15 T61.000.441.000.81 T70.210.600.620.48 T80.4000.540.31 T90.520.070.180.26

圖6 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶HMGR活性的影響()

3.2.2 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶FPPS活性的影響 北蒼術種苗基礎關鍵酶FPPS活性為（326.67±8.90）U/mL。根據圖7可知，不同肥料配施下，移栽30～90 d后關鍵酶FPPS活性呈現下降趨勢，移栽30d的關鍵酶FPPS活性差異最顯著，活性范圍426.111 1～582.777 8 U/mL。移栽120～150 d，各方案下的北蒼術根莖中FPPS活性與90 d相比整體呈上升趨勢。其中T6方案在所有施肥方案中FPPS活性水平相對較高，特別在60～150 d階段，分別為553.333 3、423.958 3、577.916 7、531.388 9 U/mL，是空白組的1.06、1.52、1.16、2.56、1.14倍。由上可知，T6施肥方案下北蒼術根莖中關鍵酶FPPS活性較高，結合對HMGR活性的分析，可以發現不同酶對倍半萜類成分合成的促進作用可能不同，合理的肥料配施對北蒼術生長發育有促進作用。

3.2.3 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶基因表達量的影響 基因相對表達量以種苗基礎表達量為單位進行計算（下同）。由圖8可知，不同肥料配施下，北蒼術根莖中關鍵酶基因相對表達量在移栽30～120 d呈現下降趨勢。移栽150 d時，各處理組關鍵酶基因相對表達量較前階段整體呈上升趨勢，范圍在2.568 7～11.463 7。

T4施肥方案在移栽30～150 d各個時期關鍵酶HMGR相對表達量處于較高水平，特別是在移栽60～150 d這個時期，T4施肥方案下關鍵酶基因相對分別是11.9921、9.254 3、6.465 0、7.544 44，是空白組的2.93、2.70、3.43、1.35倍。綜上分析可知，北蒼術根莖中關鍵酶基因相對表達量與活性存在同樣的變化趨勢，即在T4施肥方案下，關鍵酶基因表達量發育期內表達最高，進一步說明此方案積極影響倍半萜類成分生物合成。

圖7 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶FPPS活性的影響()

圖8 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶基因HMGR表達量的影響()

3.2.4 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶基因表達量的影響 由圖9可知，從整體上看，移栽30～150 d的北蒼術在不同肥料配比處理下，各方案根莖中關鍵酶基因相對表達量呈現先下降后升高的趨勢，且移栽90 d時，各方案下的關鍵酶基因相對表達量較低，范圍為1.570 3～3.971 6。不同方案在移栽120 d和150 d時關鍵酶基因FPPS相對表達量整體呈上升趨勢，T3、T4、T5、T6、T7試驗組的關鍵酶基因相對表達量在移栽150 d時較前一時期增加，范圍在6.789 2～12.705 5。由此分析，不同施肥方案下的北蒼術根莖中關鍵酶基因表達量變化程度不同，但變化趨勢與其活性的整體變化趨勢相似，證明了關鍵酶基因的表達可以調控酶活性，以便深入研究北蒼術倍半萜類成分的生物合成。

3.3 肥料配施對北蒼術3種倍半萜類成分及2種生物合成關鍵酶基因表達相關性分析

根據北蒼術生長發育期蒼術酮、白術內酯II、β-桉葉醇含量，關鍵酶HMGR、關鍵酶FPPS活性及關鍵酶基因、相對表達量變化，對北蒼術3種倍半萜類成分含量和2種生物合成關鍵酶活性及基因表達量進行相關性分析，結果見表5。

相關性分析結果（表5）表明，倍半萜類成分蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇之間相關程度不同，其中白術內酯II與β-桉葉醇的相關性（相關系數0.564），較白術內酯II與蒼術酮的相關性（相關系數0.291）更顯著。關鍵酶HMGR和FPPS活性及相對表達量之間無顯著相關關系，說明了和基因相互獨立表達。和基因和相對應的酶之間則均表現出極顯著正相關（＜0.01），其中關鍵酶FPPS活性與對應基因相對表達量相關系數略低（相關系數0.495）。根據3種倍半萜類成分與2種關鍵酶及基因的相關性可知，蒼術酮與關鍵酶和的基因表達量均呈顯著相關（＜0.05），說明北蒼術根莖中蒼術酮的合成同時受到這2種基因的影響。白術內酯II與2種關鍵酶HMGR和FPPS活性均呈極顯著正相關（＜0.01），與關鍵酶HMGR活性相關性（相關系數0.395）略小于與FPPS活性相關性（相關系數0.500）；白術內酯II與關鍵酶基因FPPS正相關關系較強（＜0.05），說明白術內酯II的生物合成與關鍵酶FPPS有關。β-桉葉醇與2種關鍵酶及其基因相關程度不同，與關鍵酶FPPS活性及基因表達量的相關性（＜0.01），較與關鍵酶HMGR活性與基因表達量的相關性更顯著（＜0.05），說明關鍵酶FPPS較HMGR在β-桉葉醇的生物合成中作用更明顯。綜上可知，北蒼術根莖中倍半萜類成分蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇的生物合成受到多種基因及酶的調控，其中關鍵酶FPPS調控作用較強。

圖9 不同氮磷鉀配施對北蒼術關鍵酶基因FPPS表達量的影響()

表5 不同氮磷鉀配施下北蒼術倍半萜類成分與關鍵酶活性及基因表達量相關性分析

Table 5 Correlation analysis of sesquiterpene components with key enzyme activities and gene expression in A. chinensisunder different combined applications of nitrogen, phosphorus and potassium

指標相關系數 蒼術酮白術內酯IIβ-桉葉醇HMGRFPPSHMGR/EF-1αFPPS/EF-1α 蒼術酮1.000 0 白術內酯II0.291 0*1.000 β-桉葉醇0.041 70.564**1.000 HMGR0.198 00.395**0.306*1.000 0 FPPS?0.059 70.500**0.659**0.162 01.000 HMGR/EF-1α0.290 0*0.2220.330*0.624 0**0.1311.000 FPPS/EF-1α0.279 0*0.382**0.452**0.067 90.495**0.2191.000

*＜0.05**＜0.01

4 討論

肥效管理是中藥材田間科學管理的關鍵要素之一，環境對于藥用植物的藥效物質也起到一定的決定作用，科學合理的施肥能有效增加藥材產量和改善藥材品質[14-15]。逯莉等[16]研究發現，用微生物肥和農家肥等量配比進行施肥，可以獲得優質高產的黃精。藥用植物的栽培種植不僅要保證經濟產量，更應重視藥材內在質量。研究表明[11]不同氮、磷、鉀配方施肥下北蒼術根莖中蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇的含量均有顯著性增加，而且各有效成分的變化與產量變化均呈正相關，與氮、磷、鉀的用量變化存在交互效應，說明合理的氮、磷、鉀配方施肥可以保證北蒼術高產優質。本研究發現，不同氮、磷、鉀配施下北蒼術在生長發育過程中，關鍵酶HMGR和FPPS活性及基因表達量差異顯著，說明合理施肥對促進北蒼術的次生代謝具有重要作用，對北蒼術的藥材品質有影響。Wang等[17]對藥用植物黃花蒿的研究中發現基因和基因單個過表達及同時過表達對倍半萜類成分青蒿素含量的提高均有顯著作用。丁逸雪等[18]對白術倍半萜成分的研究中發現高經度、低緯度、高海拔的環境有利于白術倍半萜成分的積累，說明藥用植物生長發育具體情況及環境條件的變化對次生代謝產物積累具有重要作用，對倍半萜的積累量影響顯著。另外，關鍵酶FPPS及其基因與蒼術酮、白術內酯II、β-桉葉醇含量的正相關關系，以及在一定的肥料配施下，關鍵酶HMGR和FPPS活性及其基因表達量顯著提高，進一步說明其在倍半萜類成分合成途徑上具有重要的調控作用，合理施肥對促進北蒼術的次生代謝具有重要作用。董天旺[19]研究發現，生物有機肥和氮、磷肥合理配施顯著促進了太白貝母的生長和生物堿的積累量，說明了科學合理的肥料配施是藥材品質的保障。肖婉君等[20]研究發現，肥料施用對當歸藥材有顯著的增效作用，可以改善藥材性狀，提高當歸的產量和質量。袁勇等[21]也做過相關探討，指出科學施肥，補充營養元素，是提高中藥材質量的重要措施，氮、磷、鉀的合理施用可以促進營養成分、有效成分的合成與積累。

綜上所述，本研究發現北蒼術根莖中倍半萜類成分蒼術酮、白術內酯II和β-桉葉醇的生物合成受到多種基因及酶的調控，其中關鍵酶FPPS發揮了較大的調控作用。科學合理的肥料配施可促進北蒼術倍半萜類成分含量的增加，并顯著提高其生物合成關鍵酶HMGR和FPPS的活性及基因表達。因此，在北蒼術的栽培種植過程中，合理的肥料配施可以提高北蒼術倍半萜成分的積累，保障其質量。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of combined application of fertilizer on gene expression of three sesquiterpenes and two key biosynthesis enzymes in

WANG Meng-cong, WENG Li-li, SUN Jin, XIAO Chun-ping, CHEN Tian-li

College of Pharmacy, Changchun University of Chinese Medicine, Changchun 130117 , China

To investigate the effects of different fertilizer combinations on the contents of sesquiterpene components in, including atractylone, atractylenolide-II and β-eudesmol, and the activities and gene expression of the key enzymes for biosynthesis of 3-hydroxy-3-methylglutarate monoacylase A reductase (HMGR) and farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS).Under different fertilizer combinations, the contents of three sesquiterpenes inwere determined by HPLC, and the activities of HMGR and FPPS in rhizomes ofwere determined by kit method (double antibody sandwich method). qRT-PCR was used to determine the expression levels of HMGR and FPPS in. SPSS software was used to analyze the correlation between the activities of key enzymes in biosynthesis and gene expression quantity.The suitable combination of nitrogen, phosphorus and potassium could promote the accumulation of sesquiterpenes in, and significantly improved the activity and gene expression of key enzymes in biosynthesis. The optimal fertilization scheme for sesquiterpene accumulation under the soil fertility condition represented by the test area was N 180 kg/hm2, P2O5225 kg/hm2and K2O 105 kg/hm2. Under different fertilizer combinations, the key enzyme gene HMGR was significantly positively correlated with atractylone and β-eudesmol (< 0.05). The key enzyme gene FPPS was significantly positively correlated with atractylenolide II and β-eudesmol (< 0.01), and significantly correlated with atractylone (< 0.05).The optimization of nitrogen, phosphorus and potassium fertilizer application has an effect on the accumulation of atractylone, atractylenolide II and β-eudesmol in, and also has significant effects on the activities and gene expression of key biosynthesis enzymes of HMGR and FPPS. The biosynthesis of sesquiterpenes atractylone, atractylenolide II and β-eudesmol in rhizomes ofis regulated by a variety of genes and enzymes, and the key enzyme FPPS plays a greater regulatory role.

(DC.) Koidz.; combined application of fertilizer; sesquiterpene; 3-hydroxy-3- ethylglutarate monoacylase A reductase; farnesyl pyrophosphate synthase; gene expression; atractylenolone II; β-eudesmol; atractylenone

R286.2

A

0253 - 2670(2022)13 - 4109 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.024

2021-11-06

國家自然科學基金資助項目（81803649）；吉林省科技廳科技項目（20191102035YY）；吉林省中醫藥管理局科技項目（2020047）

王孟聰，碩士研究生，研究方向為中藥品質鑒定、質量標準以及開發利用。Tel: (0431)81672193 E-mail: 15630714647@163.com

肖春萍，講師，博士，研究方向為中藥資源、栽培理論和資源開發。Tel: (0431)81672193 E-mail: btxnw@163.com

陳天麗，實驗師，博士，研究方向為中藥藥劑學與藥效物質基礎研究。Tel: 18604437775 E-mail: 731116920@qq.com

[責任編輯 時圣明]