基于蛋白質組學和LINCS數據庫預測中藥復方的不良反應——以黃連解毒湯為例

尚津鋒，李倩楠，姜婷月，焦家康，畢 磊，王璟邑，劉 欣

基于蛋白質組學和LINCS數據庫預測中藥復方的不良反應——以黃連解毒湯為例

尚津鋒，李倩楠，姜婷月，焦家康，畢 磊，王璟邑，劉 欣*

北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029

基于蛋白質組學和LINCS數據庫探討預測中藥復方不良反應的方法。以黃連解毒湯為例，對黃連解毒湯干預腦缺血大鼠模型進行蛋白質組學分析，運用LINCS數據庫、Python、RStudio等篩選與黃連解毒湯成分化合物結構相似和基因表達類似的臨床藥物，檢索藥物的不良反應，預測黃連解毒湯可能的不良反應。黃連解毒湯干預腦缺血模型蛋白質組學共篩選出72個上調蛋白和91個下調蛋白。阿司匹林、曲克蘆丁等11個臨床藥物與黃連解毒湯成分的化學結構相似，表現出皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應；地昔帕明、山柰酚等30個臨床藥物與黃連解毒湯基因表達譜類似，表現出惡心、頭暈、頭痛等不良反應。根據上述結果，預測黃連解毒湯可能的不良反應為腹瀉、惡心、頭暈、頭痛、嘔吐等。以黃連解毒湯為例，探討了一種預測中藥復方不良反應的新方法，為臨床研究提供參考。

蛋白質組學；LINCS數據庫；中藥復方；黃連解毒湯；腦缺血；不良反應

黃連解毒湯出自《肘后備急方》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子4味苦寒藥物組成，為“苦寒直折”的代表方劑，具有清熱解毒的功效，主治三焦火毒之證[1]。現代研究顯示，黃連解毒湯在體內外均具有明顯的抗炎作用，能夠治療炎癥感染、高血脂、糖尿病、消化性潰瘍等多種疾病[2]。近年來，在“毒損腦絡”的中醫理論觀點指導下，黃連解毒湯廣泛應用于治療腦血管疾病[3]。臨床上，黃芩、黃連、黃柏、梔子或多或少存在不良反應，可能與其藥性苦寒有關[4-7]，然而黃連解毒湯不良反應報道較少，因此預測黃連解毒湯潛在的不良反應具有臨床意義和研究價值。

目前已有研究從化學結構角度預測藥物的不良反應[8]，化學結構決定藥物的性質，結構不同的藥物，性質不同，通常藥理、毒理作用差異較大。靶標是藥物和機體效應之間的橋梁，藥物作用于靶標產生毒效，構建“藥-靶-不良反應”網絡利于發現潛在不良反應[9]?；瘜W結構相似、調控靶標相近的藥物藥效和毒理相似，從化學結構和作用靶標預測藥物的不良反應具備可行性。為此，本研究設計了一種預測中藥復方不良反應的方法：通過比對化學結構和基因表達，尋找與中藥復方成分化學結構相似和基因表達類似的臨床常用藥物，檢索臨床常用藥物的不良反應數據，以此為依據預測中藥復方的不良反應。同時以黃連解毒湯治療腦缺血為例，驗證該方法的實用性：對黃連解毒湯干預腦缺血大鼠模型進行蛋白組檢測，分析黃連解毒湯治療腦缺血的基因表達譜，并利用LINCS等數據庫檢索與黃連解毒湯成分化合物結構相近和基因表達相似的藥物，根據藥物的不良反應，從而推測黃連解毒湯治療腦缺血可能的不良反應。

1 資料與方法

1.1 黃連解毒湯治療腦缺血的蛋白質組學研究

1.1.1 儀器、藥物和主要試劑 RIGOL L-3000型高效液相色譜系統（北京普源精電科技有限公司），MX-S型渦旋振蕩器（SCILOGEX公司），CV100-DNA型真空離心濃縮儀（北京吉艾母科技有限公司），XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋（北京市光明醫療儀器有限公司），hf-48型高通量組織研磨器（上海賀帆儀器有限公司），JY96-IIN型超聲破碎儀（上海滬析實業有限公司）等。

黃芩配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業有限公司，批號2005056，生產日期2020-05-25，有效期至2023-05-24），黃連配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業有限公司，批號1910044，生產日期2019-10-18，有效期至2022-10-17），黃柏配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業有限公司，批號2005042，生產日期2020-05-19，有效期至2023-05-18），梔子配方顆粒（浙江貝尼菲特藥業有限公司，批號2005036，生產日期2020-05-15，有效期至2023-05-14），金納多（德國威瑪舒培博士藥廠，批號6280219），蛋白定量染液（Huaxingbio公司，批號WC320333），牛血清白蛋白（Thermo Scientific公司，批號VA294012），二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT，Amresco公司，批號2923C501-0.1KG），碘代乙酰胺（iodoacetamide，IAM，Amresco公司，批號0736C278），胰蛋白酶（Promega共，批號0000490995），碳酸氫銨（Sigma-Aldrich公司，批號BCBN6056V），尿素（Amresco公司，批號3635C203），乙腈（J. T. Baker公司，批號0000221770)，氨水（Wako Pure Chemical Industries Ltd.，批號CTH2187），甲酸（Sigma-Aldrich公司，批號BCBM11920）等。

1.1.2 動物分組、造模和取材 選用的動物為SPF級8周齡雄性SD大鼠[許可證號SCXK（京）2019-0010]，體質量220～240 g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物實驗經北京中醫藥大學學術委員會實驗動物倫理分委員會批準（批準號BUCM-4-2021101101-4007）。所有動物飼養于北京中醫藥大學動物房，于室溫22～25 ℃，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替環境中適應3 d后進入實驗。

將大鼠分為假手術組，模型組，黃連解毒湯高、中、低（0.710、0.355、0.178 g/kg，根據實驗動物與人體臨床等效劑量換算關系確定）組和陽性藥（金納多，21.6 mg/kg）組。分組前進行標號，并隨機將動物分為6組，每組10只大鼠。所有動物每12小時ig給藥1次（每日7: 00和19: 00時），連續給藥5 d，假手術組和模型組大鼠ig同體積蒸餾水。第6天早上8:00給藥后造模。

造模方式采用大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，末次給藥后1 h大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，分離頸動脈，夾閉頸總動脈，由頸外動脈插入線栓，頭端直徑（0.32±0.02）mm，至線栓18 mm標記進入頸內動脈與頸總動脈分叉處，術后保溫。除假手術組大鼠不插線栓外，其他組大鼠均造模且操作一致。造模12 h后進行神經功能評分，隨后麻醉，快速剝離完整的腦，進行氯化三苯基四氮唑（triphenyl-tetrazolium chloride，TTC）法染色。運用TTC染色法、Bederson評分觀測大鼠腦梗死體積和神經功能評分，并計算大鼠腦梗死率。采用雙盲法進行神經功能評分，Bederson評分分為4個等級，0分：無神經損傷癥狀；1分：懸尾實驗不能完全伸展對側前爪；2分：前肢抵抗對側推力能力下降；3分：向對側轉圈。腦梗死率越大，神經功能評分越高，大鼠損傷越嚴重，以腦梗死體積和神經功能評分判斷造模是否成功。

根據大鼠腦梗死體積和神經功能評分結果，確定黃連解毒湯中劑量組的治療效果最好。以黃連解毒湯的中劑量進行后續實驗，將大鼠分為假手術組、模型組以及黃連解毒湯組，每組3只，造模、取材等步驟同上。各組大鼠處理12 h后麻醉，快速剝離完整的腦，于冰上剝離皮層組織，用生理鹽水快速沖洗，擦干，凍存于?80 ℃冰箱等待檢測。

1.1.3 蛋白質分析 先對“1.1.2”的樣品進行蛋白提取，并采用Bradford法[10]測定提取的蛋白濃度。參考FASP法[11]酶解蛋白，每組樣品取出100 μg蛋白溶液，加入40 mmol/L的IAM，37 ℃酶解反應12 h，使用C18脫鹽柱對樣品進行脫鹽。采用RIGOL L-3000高效液相色譜系統進行梯度洗脫，經液相分離后經過Q Exactive HF-X質譜儀進行鑒定。

液相色譜分析條件：流動相為100%質譜水-0.1%甲酸（A液）和80%乙腈-0.1%甲酸（B液），體積流量為600 nL/min，洗脫程序為0～7 min，8%～12% B；7～55 min，12%～30% B；55～65 min，30%～40% B；65～66 min，40%～95% B；66～80 min，95% B。

質譜分析條件：Nanospray Flex（NSI）離子源，離子噴霧電壓為2.4 kV，離子傳輸管溫度為275 ℃，質譜全掃描范圍為/350～1500；一級質譜分辨率設為120 000（/200），最大增益控制（automatic gain control target，AGC）為3×106，最大注入時間為80 ms；二級質譜分辨率設為15 000（/200），AGC為5×104，最大注入時間為45 ms。

1.1.4 統計分析 對Rattus norvegicus數據庫采用Proteome Discoverer 2.4軟件進行搜庫。應用RStudio的limma包對所納入數據集的數據矩陣進行標準化并篩選差異蛋白[12]。以|log2FC|＞0.5 [FC表示差異倍數（fold change）] 且＜0.05為標準，篩選有統計學意義的差異蛋白，即log2FC＞0.5、＜0.05為上調蛋白，log2FC＜?0.5、＜0.05為下調蛋白。對調控蛋白的基因進行分析，得到差異基因，并利用RStudio的ggplot2包[13]等繪制差異基因火山圖。黃連解毒湯組和模型組相比得到的上調、下調基因，是黃連解毒湯是否干預腦缺血模型表達差異較大的基因，以此作為黃連解毒湯治療腦缺血的作用靶標。

1.2 篩選與黃連解毒湯成分結構相似的藥物

TCMSP數據庫包含中藥的成分、靶點等數據，并提供成分的結構式、藥理學參數等[14]。利用TCMSP數據庫檢索黃芩、黃連、黃柏、梔子的組成成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18和血腦屏障（blood brain barrier，BBB）≥?0.30為閾值，去重篩選得到黃連解毒湯的有效成分。由于目前已發現的藥物數量眾多，功效各異，因此本研究僅檢索腦缺血治療化學藥，判斷這些藥物是否與黃連解毒湯成分的化學結構相似。根據《2021 AHA/ASA指南：卒中和短暫性腦缺血發作患者的卒中預防》[15]和《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[16]檢索治療腦缺血的上市化學藥。運用PubChem數據庫[17]獲取黃連解毒湯化合物和腦缺血臨床藥物的SMILES號，構建黃連解毒湯化合物數據庫和治療腦缺血臨床藥物數據庫。

rdKit包能夠根據化學結構分析小分子之間的結構相似性，得到化合物之間的相似性分數[18]。利用Python的rdKit包計算黃連解毒湯化合物、臨床藥物化學結構之間的相似性，臨床藥物與全部成分化合物結構相似性分數的平均值越高，說明該藥物和黃連解毒湯成分的結構越相近。此外，將分析得到的化合物相似性矩陣導入RStudio的hClust包進行聚類分析并繪制聚類樹狀圖，聚成一類的化合物之間結構相似，性質相近，產生的藥理作用也越相似。根據結構聚類樹狀圖和相似性分數平均值排名，篩選出與黃連解毒湯成分結構相似的藥物集合。

1.3 篩選與黃連解毒湯基因表達類似的藥物

LINCS數據庫（https://commonfund.nih.gov/ LINCS/programhighlights）中包含豐富的生物信息數據，利用多種模型系統和各種化學擾動的集合，生成大規模擾動-效應網絡[19]?；贚INCS數據庫，CMap（Build 02）（https://portals.broadinstitute.org/ cmap/）包含1309個不同劑量藥物治療的5個人類細胞系的6100個基因表達圖譜，通過將輸入的差異基因與化合物的所有參考表達譜進行比較，得到連接性分數在?1～1的化合物排序[20-21]。如果藥物治療疾病與化合物的表達譜高度正相關，即藥物治療疾病的靶標與化合物作用靶標相似程度很高，說明藥物治療疾病的機制可能與該化合物效應相似。

將蛋白質組學分析得到的差異基因輸入CMap數據庫，獲取化合物連接性分數，化合物的連接性分數越接近1，說明該化合物的作用于人體細胞的基因表達譜與黃連解毒湯治療腦缺血的基因表達譜越相似。通過上述方法，篩選出與黃連解毒湯治療腦缺血基因表達相似的藥物集合。

1.4 預測藥物和黃連解毒湯的不良反應

SEP-L1000數據庫（http://maayanlab.net/ SEP-L1000/）通過化學結構和基因表達特征，對超過20000種小分子化合物（包含美國藥監局批準藥物在內）的不良反應進行優先度排序，有助于理解藥物作用機制[22]。將“1.2”和“1.3”項中基于化學結構和基因表達2個特征相似度篩選的藥物集合輸入SEP-L1000數據庫，預測藥物的不良反應，獲取每個藥物發生不同不良反應的可能性分數。計算每種不良反應在化學結構相似和基因表達相似2個藥物集合可能性分數的總和，從高到低對不良反應進行排序，以此作為依據，預測黃連解毒湯治療腦缺血潛在的不良反應。

2 結果

2.1 黃連解毒湯治療腦缺血的蛋白質組學結果

黃連解毒湯干預腦缺血模型的各組大鼠腦梗死體積和神經功能評分結果見圖1～3。結果表明，連解毒湯中劑量（0.355 g/kg）組的治療效果最好。以黃連解毒湯中劑量進行蛋白質組學分析。運用蛋白質組學技術共鑒定出4794種蛋白，以|log2FC|＞0.5、＜0.05為標準，在黃連解毒湯組和模型組之間篩選出163個差異蛋白，包括72個上調蛋白和91個下調蛋白。差異蛋白對應71個上調基因和88個下調基因，利用RStudio繪制的火山圖見圖4。黃連解毒湯組和模型組相比得到的159個差異基因，是黃連解毒湯干預腦缺血模型大鼠的差異表達基因，以此作為黃連解毒湯治療腦缺血的作用靶標。

圖1 黃連解毒湯對腦缺血模型大鼠腦梗死體積的影響 (TTC)

與假手術組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

與假手術組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

圖4 黃連解毒湯干預腦缺血模型大鼠的差異基因火山圖

2.2 基于化學結構和基因表達篩選藥物

2.2.1 黃連解毒湯成分結構相似的藥物篩選 利用TCMSP數據庫檢索黃芩、黃連、黃柏、梔子的成分，共得到370個成分，以OB≥30%、DL≥0.18和BBB≥?0.30為標準，篩選得到59個成分。根據腦缺血診療指南獲取腦缺血治療常用藥物21個，包括鹽酸托培松、曲克蘆丁、氨酪酸、奧拉西坦、硫酸氫氯吡格雷、氯吡格雷、肝素、阿司匹林、艾地苯醌、胞磷膽堿鈉、依達拉奉、辛伐他汀、阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、甘露醇、呋塞米、尼莫地平、西洛他唑、奧扎格雷鈉、胞苷二磷酸膽堿、華法林。利用Python的rdKit包計算黃連解毒湯成分與化學藥結構之間的相似性分數，將運算結果保存為×矩陣格式。同時運用RStudio的hClust包對59個黃連解毒湯成分和21個腦缺血治療藥物進行聚類，共聚成10類，樹狀圖見圖5。不同的中藥復方成分與不同類型的上市藥物聚成一類，提示黃連解毒湯可能具有不同的藥理作用。基于結構相似性的化合物聚類表明，具有相似化學結構的黃連解毒湯成分聚合成類，具有相同基團的腦缺血治療藥物基本聚成一類。肝素、甘露醇、氨酪酸與鯊烯，華法林、阿司匹林與雙苯-1,2-二甲酸酯，曲克蘆丁與茵芋堿、脫氫蒽酮IIA，依達拉奉與吳茱萸次堿等聚集，表明黃連解毒湯成分與治療腦缺血常用藥物具有相似的結構或功能基團。

臨床藥物與黃連解毒湯成分結構相似性分數的平均值從高到低排序：華法林（0.248）、阿司匹林（0.220）、曲克蘆?。?.215）、氯吡格雷（0.215）、硫酸氫氯吡格雷（0.209）、尼莫地平（0.204）、依達拉奉（0.193）、艾地苯醌（0.187）、鹽酸托培松（0.179）、呋塞米（0.174）、辛伐他?。?.172）、胞磷膽堿鈉（0.165）、胞苷二磷酸膽堿（0.161）、阿托伐他?。?.161）、西洛他唑（0.160）、瑞舒伐他?。?.156）、奧拉西坦（0.147）、奧扎格雷鈉（0.129）、氨酪酸（0.119）、肝素（0.105）、甘露醇（0.053）。由此可見，華法林、阿司匹林、曲克蘆丁等藥物與黃連解毒湯成分結構較相似。選擇相似性分數≥0.170的藥物建立黃連解毒湯成分結構相似藥物集合，包括華法林、阿司匹林、曲克蘆丁、氯吡格雷、硫酸氫氯吡格雷、尼莫地平、依達拉奉、艾地苯醌、鹽酸托培松、呋塞米、辛伐他汀共11個臨床藥物。這些藥物與黃連解毒湯成分化合物的結構相似，并具備治療腦缺血的功效，是與黃連解毒湯成分結構相似、作用功效相近的藥物。

2.2.2 黃連解毒湯基因表達類似的藥物篩選 將黃連解毒湯治療腦缺血的上調、下調基因輸入CMap數據庫，共檢索到1309個藥物，根據連接性分數從大到小排序，篩選出連接性分數＞0.400的30種藥物，建立黃連解毒湯基因表達相似藥物集合，見表1。這些藥物與黃連解毒湯干預腦缺血的基因表達譜相似度較高，作用靶點相近，這些藥物可能與黃連解毒湯藥理機制相似。

2.3 黃連解毒湯不良反應預測

2.3.1 黃連解毒湯不良反應概述 從中國知網、萬方、維普、PubMed、Web of Science 5個數據庫檢索黃連解毒湯的不良反應文獻，未見黃連解毒湯治療腦缺血的不良反應報道。根據檢索結果發現黃連解毒湯在臨床上運用廣泛，常搭配其他中藥復方或化學藥治療阿爾茨海默病[23-25]、2型糖尿病[26]、動脈粥樣硬化[27]、感染性心內膜炎[28]等疾病。在治療過程中，黃連解毒湯的不良反應發生率較低，發生的不良反應以腹瀉居多，兼有惡心、失眠、便溏腹脹、腹痛、眩暈、藥疹等癥狀出現，多數研究的對照組和試驗組不良反應發生率無統計學差異。上述結果表明，黃連解毒湯在治療疾病中偶爾出現不良反應，出現不良反應以腹瀉為主，可能與黃芩、黃連、黃柏、梔子的藥性苦寒、易傷脾胃有關。

1個顏色代表一類，標有*的代表腦缺血治療常用藥物，未標有*的代表黃連解毒湯成分

表1 基于CMap數據庫篩選的黃連解毒湯基因表達類似藥物

Table 1 Similar drugs of Huanglian Jiedu Decoction gene expression screened based on CMap database

藥物英文名稱藥物中文名稱連接性分數特異度實驗次數有效率/% desipramine地昔帕明0.4010.1954 75 butamben布坦本0.4010.1594 75 harmaline駱駝蓬堿0.4050.0424 75 netilmicin奈替米星0.4060.0074 75 decitabine地西他濱0.407－1100 strophanthidin毒扁豆堿0.4080.3144 75 brinzolamide布林佐胺0.4200.0394 75 esculetin七葉皂苷0.4200.4103 66 amprolium氨丙啉0.4240.0005 80 pralidoxime解磷定0.4250.1424 75 tomelukast托魯司特0.437－1100 kaempferol山柰酚0.4390.1254 75

續表1

藥物英文名稱藥物中文名稱連接性分數特異度實驗次數有效率/% dilazep地拉卓0.4410.0425 80 oxybenzone氧化苯甲酮0.4410.1594 75 clemizole氯咪唑0.4570.1585 80 prestwick-920 0.4570.1044 75 seneciphylline千里光堿0.4580.0744 75 arachidonic acid花生四烯酸0.4630.1093 66 tetramisole四咪唑0.4680.0154 75 betulin白樺脂醇0.4710.0193100 cytochalasin B細胞松弛素B0.475－1100 tropine托品0.5060.0004100 2-deoxy-D-glucose2-脫氧-D-葡萄糖0.509－1100 12,13-EODE 0.537－1100 corticosterone皮質酮0.5470.0004100 oligomycin寡霉素0.561－1100 phenanthridinone菲啶酮0.568－1100 mecamylamine美加明0.5720.0083100 fendiline芬地林0.5760.0343100 MG-132 0.594－1100

2.3.2 基于成分結構的不良反應預測 運用SEP-L1000數據庫檢索黃連解毒湯成分結構相似藥物的不良反應，共檢索到阿司匹林、氯吡格雷、依達拉奉、呋塞米、艾地苯醌、尼莫地平、辛伐他汀、華法林8個藥物的不良反應，按可能性分數的總和對不良反應進行排序，從高到低前20種不良反應為皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉、瘙癢、疼痛、頭痛、頭暈、蕁麻疹、腹痛、過敏、貧血、虛弱、水腫、體溫升高、白細胞減少、血小板減少、消化不良、感覺異常、混亂狀態，成分化學結構相似藥物的不良反應可能性熱圖見圖6。

2.3.3 基于基因表達的不良反應預測 運用SEP-L1000數據庫檢索黃連解毒湯基因表達相似藥物的不良反應，共檢索到地昔帕明、布坦本、地西他濱、毒扁豆堿、布林佐胺、解磷定、托魯司特、山柰酚、地拉卓、氧化苯甲酮、氯咪唑、千里光堿、四咪唑、細胞松弛素B、托品、皮質酮、寡霉素、美加明、芬地林、MG-132共20種藥物的不良反應，按可能性分數的總和對不良反應進行排序，從高到低前20種不良反應為惡心、頭暈、頭痛、皮疹、嘔吐、疼痛、瘙癢、水腫、腹瀉、蕁麻疹、虛弱、體溫升高、過敏、腹痛、食欲減退、便秘、呼吸困難、消化不良、疲勞、失眠，基因表達類似藥物的不良反應可能性熱圖見圖7。

將基于成分結構和基因表達預測的可能性分數排名前10的不良反應取交集，預測黃連解毒湯在治療腦缺血中的不良反應為惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、頭暈、頭痛、疼痛、瘙癢、蕁麻疹。

3 研究整體流程和方法總結

本研究設計的預測中藥復方不良反應方法，基于化學結構和基因表達的不良反應預測流程見圖8。需要準備中藥復方治療某一疾病的基因表達譜，可以運用蛋白質組學、基因組學、轉錄組學等各種組學方法，本研究采用蛋白質組學獲取黃連解毒湯干預腦缺血模型大鼠的表達譜。結合PubChem、LINCS、CMap等數據庫比較中藥復方和臨床藥物在化學結構和基因表達2個維度的相似性，進而獲取化學結構相似和基因表達類似的藥物，檢索這些藥物的不良反應，進而預測中藥復方的不良反應。大體分為以下3個步驟：（1）比較中藥復方所含成分和臨床藥物的化學結構相似性，獲取化學結構相似藥物；（2）比較中藥復方和臨床藥物的基因表達譜，獲取基因表達類似藥物；（3）根據篩選得到的化學結構相似藥物和基因表達類似藥物預測中藥復方的不良反應。

圖6 黃連解毒湯成分結構相似藥物的不良反應可能熱圖

圖7 黃連解毒湯基因表達類似藥物的不良反應可能性熱圖

圖8 基于蛋白質組學和數據庫預測中藥復方不良反應的流程

4 討論

本研究設計了一種預測中藥復方不良反應的方法，以蛋白質組學實驗和現有LINCS數據庫的數據為基礎，化學結構相似性和基因表達類似度為標準，篩選與中藥復方成分結構相似和基因表達類似的臨床藥物，通過檢索臨床藥物的不良反應，預測中藥復方可能存在的不良反應。本研究首次將化學成分結構和基因表達譜結合，應用于中藥復方不良反應的預測中，并以黃連解毒湯為例探討該方法的可行性。

中醫認為，黃連解毒湯“苦寒直折”，方中君藥黃連清瀉心火兼中焦之火；臣藥黃芩瀉肺熱與上焦之火；黃柏瀉下焦之火，梔子瀉三焦之火，引熱下行，二者為佐藥。黃連解毒湯主治三焦火毒熱盛證，癥見大熱煩躁、口燥咽干、錯語不眠；或熱病出血、癰疽瘡瘍[29-30]，針對以風火痰瘀壅塞三焦、毒損腦絡為特點的腦缺血病理過程，發揮通三焦、解火毒的作用，達到“解毒通絡”的目的[31]。黃連解毒湯解三焦火毒與其藥性苦寒密不可分，傳統已有“苦寒傷胃”一說，即苦寒藥性寒涼，有傷胃之弊，不宜用于脾胃虛寒者，臨床應用這類藥物易出現腹痛等癥狀。目前相關研究表明，苦寒藥在較大劑量連續用藥后可致正常動物和脾胃虛寒模型動物的胃腸運動功能減退，“傷胃”之弊體現在消化系統的多個方面[32]，印證了傳統中醫的觀點。此外，在黃連解毒湯蛋白質組學實驗過程中，發現黃連解毒湯給藥組的大鼠便溏軟，是腹瀉癥狀的表現，可能與黃連、黃芩、黃柏、梔子藥性苦寒有關。根據文獻檢索結果，臨床上黃連解毒湯的不良反應較少且發生頻率低，僅有腹瀉、惡心、腹痛等幾個不良反應的報道[23-25,33-34]，與本研究的預測結果相符。所有這些結果表明，基于化學結構相似性聚類以及基因表達譜比較，挑選中藥復方的類似臨床藥物為依據推測不良反應，是預測中藥復方不良反應的有效方法。

腦缺血臨床藥物與黃連解毒湯成分結構聚類圖顯示，黃連解毒湯成分與目前臨床應用廣泛的治療藥物結構相似，它們之間具備相似官能團，尤其阿司匹林、曲克蘆丁、尼莫地平、依達拉奉、氯吡格雷、呋塞米、辛伐他汀，不僅與成分的結構相似度高，而且臨床應用廣泛，因此依據臨床藥物的藥效機制能夠推測黃連解毒湯的藥理作用和不良反應。阿司匹林有解熱、鎮痛、抗炎的藥理作用，對血小板的聚集有抑制作用，其腸溶片可作為“中風”的二級預防[35]。藥理研究顯示，阿司匹林腸溶片可促使血小板環氧化酶乙酰化，抗血小板聚集；尼莫地平則促進腦血管擴張，調節腦組織血流量，降低鈣水平，避免神經元損傷；辛伐他汀調節血液流速及血液黏稠度，調節血脂，聯合阿司匹林增強治療缺血性腦病的療效[36-38]。動物實驗表明，曲克蘆丁對腦缺血再灌注損傷具有保護作用，與減輕脂質過氧化反應、增加自由基的清除能力等有關[39]，這說明曲克蘆丁通過抗氧化損傷保護腦組織。依達拉奉具有抗炎作用，在治療腦缺血再灌注損傷中能顯著降低炎性反應，可能與Wnt家族分泌蛋白/β-連環蛋白通路（canonical Wnt/β-catenin pathway）通路激活有關[40-41]。此外，研究顯示，呋塞米通過腎外作用顯著降低了腦阻抗，發揮抗水腫作用，改善腦缺血損傷[42]。黃連解毒湯的成分與上述腦缺血臨床藥物結構相似，基于這種無監督的化學結構聚類方法和已有研究[43-46]，組學大數據預測和驗證的黃連解毒湯具有以下藥理作用：抑制血小板凝集（阿司匹林）、抵抗氧化損傷（曲克蘆丁）、抑制炎癥反應（阿司匹林、尼莫地平、依達拉奉）、減少膽固醇合成（他汀類），其成分還可能具有利尿的作用（呋塞米），說明黃連解毒湯多途徑、多作用保護腦組織和神經元細胞，對抗腦缺血損傷。

基于黃連解毒湯干預腦缺血的蛋白質組學數據，本研究篩選了71個上調基因和88個下調基因，以基因靶標為基礎可以深入挖掘黃連解毒湯治療腦缺血的作用機制。以蛋白組學的差異表達基因，篩選得到地昔帕明、布坦本、地西他濱、布林佐胺、解磷定、山柰酚、氯咪唑、千里光堿、四咪唑、細胞松弛素B、托品、皮質酮等30個藥物與黃連解毒湯基因表達類似，目前黃連解毒湯能夠治療腦缺血，上述藥物能否在腦缺血治療中發揮作用有待驗證，其中山柰酚已經證實具有改善腦缺血功能。藥理研究顯示，山柰酚能抑制炎癥，保護血腦屏障，改善慢性腦缺血誘導的大鼠認知功能障礙、四肢平衡能力障礙及病理損傷，作用機制可能與抗氧化、抑制炎癥通路激活有關[47-48]。地昔帕明、普托品、皮質酮也被證明與腦缺血的病理損傷相關[49-52]。因此，通過比較藥物基因表達的相似度，由已知的毒效作用推測未知的毒效作用具備可行性。本研究篩選的與黃連解毒湯基因表達譜類似藥物，可以研究與腦缺血損傷和治療機制的關系，為藥物藥理作用的發現提供新思路。

經過本研究設計的不良反應預測流程（圖8），預測黃連解毒湯不良反應為惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、頭暈、頭痛、疼痛、瘙癢、蕁麻疹。惡心、嘔吐、腹瀉、藥疹、疼痛、頭痛等不良反應已有報道，出現頻次較低且反應不劇烈，不良反應的發生可能與其藥性苦寒傷胃相關。由此說明，本研究設計的不良反應預測方法具有價值和可行性。但這些不良反應是基于臨床藥物推測的，臨床化學藥的不良反應通常較多，反應劇烈，而黃連解毒湯臨床上雖然有報道腹瀉等不良反應，但出現頻率低、反應數量少、程度輕微，黃連解毒湯與臨床藥物相比不良反應癥狀減輕、頻率下降，是否與中藥的配伍減毒作用相關有待研究。中藥復方在治療疾病中有其獨特優勢，不良反應發生率少，廣泛運用中醫藥大勢所趨。

5 結論

本研究探討了一種中藥復方不良反應預測的方法，將中藥復方的成分化學結構、基因表達與臨床藥物結合，建立化學結構、基因靶標與不良反應之間的聯系，篩選中藥復方類似藥物，預測中藥復方的不良反應，為中藥不良反應研究提供新的策略和方法。然而，本研究受限于數據量等因素，具有一定的局限性，希望今后豐富數據、完善方法。總之，基于蛋白質組學和LINCS數據庫，本研究探討了一種預測中藥復方不良反應的方法，并以黃連解毒湯為例說明該方法具備可行性，可能有助于闡明傳統醫學的獨特機制，為不良反應研究提供新的策略。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 王文杰, 陳賽貞, 徐紅燕, 等. 黃連解毒湯抗腦缺血研究進展及展望 [J]. 江西中醫藥, 2018, 49(11): 70-74.

[2] 廖國平, 孫德貴, 尹新生, 等. 黃連解毒湯的抗炎作用研究進展 [J]. 大家健康: 學術版, 2015, 9(10): 277-278.

[3] 張志辰, 張允嶺, 曹曉嵐, 等. 基于數據挖掘的急性腦梗死血壓、體溫聯動變化與毒損腦絡證候特點相關性分析 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2011, 34(5): 309-312.

[4] 趙錫艷, 仝小林, 趙林華, 等. 黃連復方及其制劑不良反應現代研究進展 [J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(4): 546-547.

[5] 李春楠. 中藥梔子不良反應與肝腎毒性機制研究 [D]. 南昌: 江西中醫藥大學, 2020.

[6] 李春霞, 謝志虹, 徐文艷, 等. 黃柏聯合益生菌治療妊娠37周后細菌性陰道炎孕婦的療效及安全性 [J]. 河北醫藥, 2019, 41(5): 721-723.

[7] 康雨菲. 復方黃芩“水膜”濕敷聯合健脾化濕湯治療亞急性濕疹的療效觀察 [D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2021.

[8] Bender A, Scheiber J, Glick M,. Analysis of pharmacology data and the prediction of adverse drug reactions and off-target effects from chemical structure [J]., 2007, 2(6): 861-873.

[9] Dafniet B, Cerisier N, Audouze K,. Drug-target-ADR network and possible implications of structural variants in adverse events [J]., 2020, 39(12): e2000116.

[10] Weinstock M. Bradford’s law [J]., 1971, 233(5319): 434.

[11] Wi?niewski J R, Zougman A, Nagaraj N,. Universal sample preparation method for proteome analysis [J]., 2009, 6(5): 359-362.

[12] Ritchie M E, Phipson B, Wu D,. Limma Powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies [J]., 2015, 43(7): e47.

[13] Ito K, Murphy D. Application of ggplot2 to pharmacometric graphics [J]., 2013, 2(10): e79.

[14] Ru J L, Li P, Wang J N,. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines [J]., 2014, 6: 13.

[15] 雷洋, 茍夢秋, 邊原, 等. 《2021 AHA/ASA指南：卒中和短暫性腦缺血發作患者的卒中預防》解讀 [J]. 醫藥導報, 2022, 41(1): 8-11.

[16] 中華醫學會神經病學分會, 中華醫學會神經病學分會腦血管病學組. 中國急性缺血性腦卒中診治指南2018 [J]. 中華神經科雜志, 2018, 51(9): 666-682.

[17] Kim S, Chen J, Cheng T J,. PubChem in 2021: New data content and improved web interfaces [J]., 2021, 49(D1): D1388-D1395.

[18] Lovriu0107 M, Molero J M, Kern R. PySpark and RDKit: Moving towards big data in cheminformatics [J]., 2019, 38(6): e1800082.

[19] Stathias V, Turner J, Koleti A,. LINCS Data Portal 2.0: Next generation access point for perturbation-response signatures [J]., 2020, 48(D1): D431-D439.

[20] Yang K, Dinasarapu A R, Reis E S,. CMAP: complement map database [J]., 2013, 29(14): 1832-1833.

[21] Hurle M R, Yang L, Xie Q,. Computational drug repositioning: From data to therapeutics [J]., 2013, 93(4): 335-341.

[22] Wang Z C, Clark N R, Ma'ayan A. Drug-induced adverse events prediction with the LINCS L1000 data [J]., 2016, 32(15): 2338-2345.

[23] 高炎. 黃連解毒湯治療阿爾茨海默病的臨床觀察及實驗研究 [D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2021.

[24] 梁瑞景, 梁瑞凱. 黃連解毒湯聯合復方蓯蓉益智膠囊、多奈哌齊片對阿爾茨海默癥患者尿AD相關神經絲蛋白水平的影響 [J]. 陜西中醫, 2021, 42(4): 446-448.

[25] 楊青. 黃連解毒湯聯合鹽酸多奈哌齊片治療阿爾茨海默病(心肝火旺型) 的臨床療效觀察 [D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2020.

[26] 岳新, 史素琴. 黃連解毒湯加減聯合耳穴埋針輔助治療2型糖尿病胰島素抵抗的效果 [J]. 慢性病學雜志, 2021, 22(7): 993-995.

[27] 劉亞榮, 孫婧. 黃連解毒湯對頸動脈粥樣硬化作用觀察及部分機制探析 [J]. 世界中醫藥, 2019, 14(10): 2688-2692.

[28] 王星, 陳康寅, 賈忠偉, 等. 黃連解毒湯合五味消毒飲治療急性感染性心內膜炎的臨床觀察 [J]. 中國中醫急癥, 2016, 25(6): 1226-1228.

[29] 李冀. 方劑學 [M]. 北京: 中國中醫藥出版社, 2006: 112.

[30] 劉磊, 姜鵬, 竇圣姍, 等. 黃連解毒湯的化學及藥理學研究進展[J]. 中草藥, 2008, 39(6):935-938

[31] 寧為民, 李國順. 試論三焦氣化與中風 [J]. 中國中醫急癥, 2020, 29(11): 1989-1992.

[32] 李飛艷. 從苦寒藥傷胃看常用苦寒藥一般毒性及對胃腸運動影響的實驗研究 [D]. 長沙: 湖南中醫藥大學, 2005.

[33] 時晶, 倪敬年, 田金洲, 等. 清熱解毒法治療阿爾茨海默病的系統評價 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2019, 42(8): 667-672.

[34] 李根龍. 辨證分型治療老年癡呆120例臨床觀察 [J]. 實用中醫內科雜志, 2013, 27(7): 9-10.

[35] 中華醫學會神經病學分會腦血管病學組, 缺血性腦卒中二級預防指南撰寫組. 中國缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發作二級預防指南2010 [J]. 中國實用鄉村醫生雜志, 2015(6): 2-4.

[36] 董歌. 瑞舒伐他汀鈣聯合阿司匹林腸溶片、尼莫地平治療短暫性腦缺血發作的療效 [J]. 檢驗醫學與臨床, 2021, 18(19): 2894-2897.

[37] 他汀類藥物預防缺血性卒中/短暫性腦缺血發作專家組. 他汀類藥物預防缺血性卒中/短暫性腦缺血發作的專家建議 [J]. 中華內科雜志, 2007, 46(1): 81-83.

[38] 田亮, 胡成伍, 鄢圣娟. 辛伐他汀聯合阿司匹林治療腦血栓形成的療效及對神經功能缺損的影響 [J]. 中國醫院用藥評價與分析, 2018, 18(12): 1649-1650.

[39] 張蕓榕, 何麗, 李笑曉, 等. 曲克蘆丁對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響 [J]. 華西藥學雜志, 2018, 33(2): 169-171.

[40] 楊士超. 依達拉奉輔助治療對腦缺血再灌注損傷患者神經功能及MRS評分的影響 [J]. 哈爾濱醫藥, 2021, 41(5): 95-96.

[41] 謝明, 朱俊德, 周璐, 等. 依達拉奉對大鼠腦缺血再灌注損傷后氧化應激及凋亡的影響 [J]. 神經解剖學雜志, 2021, 37(4): 418-424.

[42] Oria de Suárez C, Eblen Zajjur A. Efectos extrarrenales de la furosemida en el tejido cerebral normal e isquémico de la[J]., 2001, 32(5): 414.

[43] 董穎, 劉保光, 許二平. 黃連解毒湯抗炎作用與臨床應用研究進展 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2021, 27(12): 245-250.

[44] 柴倩. 黃連解毒湯對MODS患者凝血功能影響的臨床研究 [D]. 廣州: 廣州中醫藥大學, 2015.

[45] 何信用, 鄭思成, 王群, 等. 基于網絡藥理學的黃連解毒湯治療動脈粥樣硬化的潛在分子機制研究[J]. 中草藥, 2020, 51(3): 687-696.

[46] 徐靜華, 于慶海, 李立志. 黃連解毒湯對腦缺血小鼠的抗氧化作用研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2002, 18(6): 2-4.

[47] 李偉瀚, 程笑, 楊瀅霖, 等. 山奈酚通過抑制神經炎癥及保護血腦屏障而改善大鼠腦缺血再灌注神經功能 [J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 2019, 33(9): 673.

[48] 張君, 程笑, 楊歡, 等. 山奈酚對慢性腦缺血大鼠學習記憶能力的影響及機制探討 [J]. 中國藥理學通報, 2017, 33(1): 39-44.

[49] 朱子濤, 張雪翔, 劉健, 等. 地昔帕明對大鼠短暫腦缺血致海馬CA1神經元自發放電的影響 [J]. 藥學學報, 1996(1): 35-38.

[50] 蔣麗萍, 韓曉建, 陳曉媛, 等. 普托品對腦缺血的保護作用 [J]. 中藥藥理與臨床, 2004, 20(1): 9-10.

[51] 李軍巖, 袁芳, 陳澤斌. 針刺預處理對腦缺血再灌注大鼠血清皮質酮含量的影響 [J]. 湖北中醫學院學報, 2008, 10(2): 9-11.

[52] 王嗣欣, 周麗宏, 滕春芳. 皮質激素在實驗性缺血性腦血管病中應用進展 [J]. 國外醫學神經病學神經外科學分冊, 2001, 28(3): 220-223.

Prediction of adverse reactions of traditional Chinese medicine compound based on proteomics and LINCS database: A case study of Huanglian Jiedu Decoction

SHANG Jin-feng, LI Qian-nan, JIANG Ting-yue, JIAO Jia-kang, BI Lei, WANG Jing-yi, LIU Xin

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China

To explore a method to predict the adverse reactions of traditional Chinese medicine (TCM) compound based on proteomics and LINCS database.Taking Huanglian Jiedu Decoction (黃連解毒湯) as an example, proteomics analysis was conducted on Huanglian Jiedu Decoction intervened cerebral ischemia rat model. LINCS database, Python and RStudio were used to screen clinical drugs with similar structure and gene expression to Huanglian Jiedu Decoction. Adverse reactions of drugs were retrieved and possible adverse reactions of Huanglian Jiedu Decoction were predicted.A total of 72 up-regulated proteins and 91 down-regulated proteins were screened via proteomics. The chemical structure of 11 clinical drugs, such as aspirin and troxrutin, were similar to that of Huanglian Jiudu Decoction, which showed rash, nausea, vomiting and diarrhea and other adverse reactions. The gene expression profiles of 30 clinical drugs, such as dixipramine and kaempferol, were similar to those of Huanglian Jiedu Decoction, which showed nausea, dizziness, headache and other adverse reactions. According to the above results, the possible adverse reactions of Huanglian Jiedu Decoction were predicted to be diarrhea, nausea, dizziness, headache, vomiting, etc.This study explores a new method to predict the adverse reactions of TCM compound, and takes Huanglian Jiedu Decoction as an example to illustrate the feasibility of the method and provide reference for clinical research.

proteomics; LINCS database; traditional Chinese medicine compound; Huanglian Jiedu Decoction; cerebral ischemia; adverse reaction

R285

A

0253 - 2670(2022)13 - 4053 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.019

2021-12-26

北京中醫藥大學基本科研業務費項目（重點攻關項目）（2020-JYB-ZDGG-039）

尚津鋒（2001—），男，碩士研究生，從事腦缺血作用特點及藥物干預研究。E-mail: sjf01qtdd@163.com

劉 欣，博士，副教授，碩士生導師，主要從事腦缺血作用特點及藥物干預研究。Tel: (010)53912127 E-mail: xinliu1011@126.com

[責任編輯 潘明佳]