基于NLRP3炎癥小體研究白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌定植下小鼠潰瘍性結腸炎的作用機制

王亞東，徐志慶，夏 丹，張夢翔，汪天明, 3，邵 菁, 3，汪長中, 3*

? 藥理與臨床 ?

基于NLRP3炎癥小體研究白頭翁湯正丁醇提取物對白念珠菌定植下小鼠潰瘍性結腸炎的作用機制

王亞東1, 2，徐志慶1, 2，夏 丹1, 2，張夢翔1, 2，汪天明1, 2, 3，邵 菁1, 2, 3，汪長中1, 2, 3*

1. 安徽中醫藥大學中西醫結合學院，安徽 合肥 230012 2. 安徽省中醫藥科學院 中西醫結合研究所，安徽 合肥 230012 3. 安徽中醫藥大學 中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012

研究白頭翁湯正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction，BAEB）對白念珠菌異常定植下的葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導的小鼠潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）的治療作用，以及對Dectin-1/脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）/NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）信號通路的影響。將105只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、DSS組、DSS＋白念珠菌組及BAEB低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg）組和美沙拉嗪（200 mg/kg）組。對照組小鼠每日自由飲水；DSS組予3% DSS溶液，自由飲用連續7 d；其他組在DSS組基礎上，在第1、3、5、7天ig白念珠菌（1×108CFU/只）。第8天開始分別ig相應藥物，1次/d，連續7 d。每天稱定小鼠質量，觀察一般狀態，收集糞便，采用平板培養法檢測糞便真菌載荷。末次給藥次日，處死小鼠，測量結腸長度，蘇木素-伊紅（HE）染色法進行結腸組織學分析；ELISA法檢測結腸組織炎癥因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18水平；免疫組化法檢測結腸組織Occludin和閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）表達；Western blotting檢測結腸組織Dectin-1、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Syk、凋亡相關微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cystein-asparate protease-1，cleaved Caspase-1）和NLRP3蛋白表達。與對照組和DSS組比較，DSS＋白念珠菌組小鼠糞便培養出更多的白念珠菌（＜0.01）；結腸黏膜損傷程度嚴重（＜0.01）；結腸組織炎癥因子IL-1β、IL-18水平明顯升高（＜0.01）；結腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達明顯下降（＜0.05）；結腸組織NLRP3、NF-κB和Dectin-1蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），ASC、cleaved Caspase-1和Syk蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。與DSS＋白念珠菌組相比，BAEB組小鼠腸道白念珠菌顯著減少（＜0.01）；結腸組織中IL-1β、IL-18水平下降（＜0.05、0.01）；結腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達均顯著升高（＜0.05、0.01）；BAEB低劑量組Syk蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）；BAEB中劑量組ASC和Syk蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），NLRP3和NF-κB蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）；BAEB高劑量組NF-κB蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），ASC蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）。BAEB可能通過抑制白念珠菌異常定植下Dectin-1/Syk通路所介導的NLRP3炎癥小體過度活化，進而阻斷IL-1β與IL-18的產生來發揮抗UC作用。

白念珠菌；潰瘍性結腸炎；白頭翁湯正丁醇提取物；NLRP3炎癥小體；Dectin-1/Syk信號通路

白頭翁湯（白頭翁15 g、黃柏12 g、黃連6 g、秦皮15 g）出自《傷寒論》，為中華中醫藥學會脾胃病分會推薦治療UC的方藥[3]。臨床研究表明，白頭翁湯對UC具有良好的療效。體外實驗也證明白頭翁湯正丁醇提取物（butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction，BAEB）對白念珠菌具有明顯抑制作用[13-14]。本課題組前期也進行了大量的實驗，發現BAEB對于白念珠菌定植下的UC小鼠有著顯著的治療效果。然而，白頭翁湯對白念珠菌定植下的UC的作用機制尚不清楚。故本研究擬從腸道白念珠菌的過度定植角度出發，通過檢測Dectin-1/Syk通路、NLRP3炎癥小體相關指標的變化以及反映腸黏膜屏障功能的Occludin和閉鎖連接蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）蛋白表達情況，探討BAEB對UC的作用機制，以期為可能將BAEB開發為作用機制新穎、臨床療效顯著的抗UC藥物奠定堅實的理論基礎和實驗依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性KM小鼠105只，6～8周齡，體質量18～22 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，動物合格證號SCXK（皖）2017-001，安徽省實驗動物質量合格證號No.340729210100005024。小鼠于動物房適應性飼養1周，明暗交替12 h/12 h，室溫維持20～26 ℃，相對濕度維持40%～70%，自由進食飲水。動物實驗經安徽中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號AHUCM-2021007）。

1.2 菌株

白念珠菌標準株SC5314由中國人民解放軍第二軍醫大學藥學院姜遠英教授惠贈。

1.3 藥材

白頭翁、黃柏、黃連、秦皮購自安徽中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，并經安徽中醫藥大學高家榮主任藥師鑒定分別為毛茛科植物白頭翁(Bge.) Regel的干燥根、蕓香科植物黃皮樹Schneid的干燥樹皮、毛茛科植物黃連Franch的干燥根莖和木犀科植物苦櫪白蠟樹Hance的干燥枝皮。

1.4 藥品與試劑

美沙拉嗪腸溶片（批號10402226，0.25g/片）購自葵花藥業；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium salt，DSS，批號S3045）購自美國MP Biomedicals公司；小鼠IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒（批號分別為01/2021、01/2021）購自上海酶聯生物科技有限公司；β-葡聚糖ELISA試劑盒（批號202101）購自上海科興生物科技有限公司；核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65抗體、凋亡相關微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC）抗體、山羊抗兔IgG抗體（批號分別為ATTNO2501、ATSAP1701、ATSAP0901）購自美國Abbkine公司；ZO-1抗體、Occludin抗體、F4/80抗體、ECL超敏發光試劑盒、山羊抗小鼠IgG抗體、β-actin抗體（批號分別為44h7470、53t8241、44k4122、1824c03、19z2345、54o2802）購自美國Affinity公司；NLRP3抗體、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cleaved cystein-asparate protease-1，cleaved Caspase-1）抗體（批號分別為15101S、4）購自美國CST公司；Syk抗體（批號104032427）購自沈陽萬類生物科技有限公司；Dectin-1抗體（批號E0317）購自美國Santa Cruz生物技術公司；RIPA細胞裂解液（強）、預染蛋白Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號分別為AUKJH、AUKPW、SPHNU）購自山東思科捷生物技術有限公司；法國科瑪嘉念珠菌顯色培養基（批號P002076）購自上海欣中生物工程有限公司；聚山梨酯20（批號20CS1808）購自北京金克隆生物技術有限公司；牛血清白蛋白（批號EZ5679A168）購自德國Biofroxx公司。

1.5 儀器

H1-16kr型高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；K3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific）；RM2016型組織切片機（德國Leica公司）；DYY-6C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Tanon 5200型全自動化學發光成像分析系統（上海天能科技有限公司）。

2 方法

2.1 BAEB的制備

按照文獻方法[9]制備BAEB，在提取過程中，通過檢測白頭翁皂苷B4、秦皮甲素、小檗堿含量，并注意有機溶劑濃度、有機溶劑用量、提取時間、提取次數4個因素進行質量控制[15]。BAEB中主要成分含量見表1。

4) 時間。當浸提時間<60 min時，隨著浸提時間的延長，火龍果果皮甜菜苷類色素提取量呈快速上升趨勢；浸提時間為60 min時，甜菜苷類色素有提取量最高，為4.09 mg/100g；之后呈緩慢下降趨勢。因此，浸提時間以60 min最優。

2.2 白念珠菌懸液的配制

將白念珠菌接種于裝有液態沙氏培養基的錐形瓶中，置于37 ℃恒溫搖床中培養12 h。取出，離心收集后將菌液濃度調整至1×109CFU/mL備用。

表1 BAEB中主要成分含量

Table 1 Contents of main active components in BAEB

成分質量分數/(mg·g?1) 小檗堿315.26 白頭翁皂苷B4174.81 秦皮甲素46.91 黃連堿19.60 黃柏堿16.78 表小檗堿12.66 藥根堿9.92 秦皮乙素2.39

2.3 白念珠菌異常定植下的小鼠UC模型建立與藥物干預

參考馬克龍等[16]與Choteau等[17]方法，采用DSS自由飲用結合ig白念珠菌的方法構建白念珠菌定植小鼠UC模型。小鼠隨機分為對照組、DSS組、DSS＋白念珠菌組及BAEB低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg）[18]組和美沙拉嗪（200 mg/kg）組，每組15只。對照組小鼠自由飲用蒸餾水；DSS組小鼠自由飲用3% DSS溶液，連續7 d；DSS＋白念珠菌組及各給藥組小鼠自由飲用3% DSS溶液，同時隔日ig 0.1 mL白念珠菌，連續4次。第8天，各給藥組ig相應藥物，對照組和DSS組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續7 d。

2.4 小鼠一般體征觀察和疾病活動指數（disease activity index，DAI）計算

每日觀察小鼠的精神、飲食、活動和毛發等一般狀況，記錄小鼠體質量、大便性狀和便血情況，對小鼠DAI進行評分，評分標準見表2。

表2 DAI評分標準

Table 2 Scoring criteria of DAI

得分體質量下降率（a）大便性狀肉眼血便 0≤1%顆粒和硬度均適中無異常 11%＜a≤5%顆粒成形，較軟，不黏附肛門糞便有暗紅色斑點 25%＜a≤10%顆粒軟且黏附于肛門糞便有暗紅色斑點，肛門可見出血 3＞10%不成形，黏附肛門，腹瀉糞便深紅色，肛門周圍有血液黏附

2.5 結腸長度、黏膜損傷指數、組織病理形態學觀察及評分

小鼠麻醉后眼球取血，離心獲取血清，?20 ℃冰箱保存備用。頸椎脫臼處死小鼠，無菌操作下迅速剖開腹腔，切取小鼠結腸，測量結腸長度，觀察結腸水腫、潰瘍等損傷程度，并進行結腸黏膜損傷指數（colon mucosa damage index，CMDI）評分，評分標準：組織無損傷，0分；局部充血、無潰瘍，1分；局部充血、腸壁增厚、無潰瘍，2分；有潰瘍、直徑＜1 cm，3分；潰瘍直徑1～2 cm、腸管與外周無粘連，4分；潰瘍直徑約1～2 cm、腸管增厚、與外周臟器黏連，5分。切取一部分結腸，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，4 μm連續切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡下觀察結腸病理學變化，按照文獻方法[19]進行評分，評分標準見表3。剩余結腸組織于?80 ℃冰箱保存，用于后續實驗。

表3 結腸組織病理學評分標準

Table 3 Scoring criteria of colonic histopathology

得分炎癥程度炎癥范圍隱窩損失程度 0無無無 1輕度固有層基底1/3受損 2中度黏膜和黏膜下層基底2/3受損，表面上皮完整 3重度透壁整個隱窩和上皮丟失

2.6 腸道白念珠菌載荷量評估

收集各組小鼠第1、5、9、13天的糞便，干燥、稱定質量后，重懸于預冷的PBS中，涂布在含有雙抗的科瑪嘉顯色固體培養基上，于37 ℃恒溫培養24 h，計數平板上白念珠菌微菌落的數量。

2.7 免疫組化檢測結腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達

腸組織石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫封閉10 min，檸檬酸鹽緩沖液微波輻射抗原修復，羊血清封閉。分別加入Occludin（1︰100）、ZO-1（1︰100）抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗，37 ℃孵育30 min，加入SABC和DAB顯色劑后，經蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，封片。于顯微鏡下觀察，棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為陽性細胞。

2.8 ELISA檢測結腸組織IL-1β、IL-18水平

取各組小鼠結腸組織，稱定質量，加適量PBS，勻漿，離心，收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-18水平。

2.9 Western blotting法檢測結腸組織NLRP3、Dectin-1、Syk、NF-κB、ASC和cleaved Caspase-1蛋白表達

取結腸組織，加液氮后用研缽研碎，根據組織蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白樣品。BCA法對蛋白進行定量，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，封閉后，以TBST漂洗，分別加入Dectin-1（1∶1000）、NF-κB（1∶2000）、Syk（1∶10 000）、ASC（1∶2000）、cleaved Caspase-1（1∶1000）、NLRP3（1∶1000）和β-actin（1∶1000）抗體，4 ℃孵育過夜；TBST漂洗后，加入HRP標記的二抗（1∶1000），室溫孵育2 h，漂洗后加入ECL化學發光液顯色，采用凝膠成像系統觀察結果，并進行灰度分析。

2.10 統計學分析

所有實驗數據用SPSS 20統計分析軟件進行處理，數據用表示。采用單因素方差（One-way ANOVA）分析和LSD檢驗（方差不齊時用Dunnett’s3檢驗）對組間變量進行多重比較。

3 結果

3.1 BAEB對小鼠一般狀態和DAI的影響

對照組小鼠毛發色澤、飲食、精神、大便均正常；DSS組小鼠在自由飲用DSS溶液3 d后，出現行動遲緩、食欲減退和稀便，且隨著時間延長，癥狀逐漸加重，出現黏液便和血便，DAI逐漸增大（表4）；DSS＋白念珠菌組小鼠的癥狀和體征與DSS組相似，但出現稀便和血便的時間更早，DAI升高更明顯，與同時間點對照組相比有顯著差異（＜0.01）；第8天，經BAEB和美沙拉嗪治療，上述癥狀均得到不同程度的改善，隨著治療時間的延長，DAI開始下降，與同時間點DSS＋白念珠菌組相比有顯著差異（＜0.05）。在治療組中，BAEB中、高劑量組DAI下降較明顯，效果優于BAEB低劑量組。BAEB中、高劑量組之間無差別。說明BAEB可以降低白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠DAI評分，并且隨劑量增加而降低，但當劑量達到一定程度后，效果不再增加。

3.2 BAEB對小鼠結腸長度、CMDI、組織病理學和評分的影響

如表5所示，與對照組相比，DSS＋白念珠菌組小鼠結腸長度明顯縮短（＜0.01）；BAEB組和美沙拉嗪組結腸長度明顯長于DSS＋白念珠菌組（＜0.05、0.01）；DSS＋白念珠菌組結腸黏膜水腫、潰瘍和糜爛，黏膜下見大量炎性浸潤，上皮細胞破損，杯狀細胞核腺體減少或排列不整齊（圖1），CMDI和組織病理學評分升高，與對照組相比有明顯差異（＜0.01）；BAEB治療后，小鼠結腸黏膜水腫、糜爛和潰瘍明顯減輕，上皮細胞破損明顯減少，杯狀細胞核腺體排列不整齊明顯改善，CMDI和組織病理學評分降低，與DSS＋白念珠菌組相比有顯著差異（＜0.05、0.01）。BAEB可以明顯改善白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠的結腸長度及CMDI評分，且呈劑量相關性，其中BAEB中、高劑量組效果優于美沙拉嗪組。組織病理學評分以BAEB中劑量組降低最明顯，說明BAEB可以改善白念珠菌定植的DSS誘導UC，并隨劑量增加而增加，但當劑量達到一定程度后，效果不再增加。

表4 BAEB對白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠DAI評分的影響(, n = 15)

Table 4 Effect of BAEB on DAI score in UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)DAI評分 第1天第4天第7天第10天第13天 對照—00000 DSS—01.20±0.452.50±0.711.71±1.111.25±0.50 DSS＋白念珠菌—01.00±03.63±1.19##2.33±0.58#1.33±0.58# BAEB2001.14±0.383.57±1.812.00±0.00*1.25±0.50* 4001.00±0.293.00±0.821.57±0.79*1.00±0* 8001.43±0.533.30±1.341.33±0.52*1.00±0* 美沙拉嗪20001.00±03.50±1.222.00±1.41*1.33±0.58

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01；與DSS＋白念珠菌組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

#< 0.05##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01DSS +s group, same as below tables

表5 BAEB對白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠結腸長度、CMDI評分和組織病理學評分的影響(, n = 15)

Table 5 Effect of BAEB on colon length,CMDI scores and histopathological score in UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)結腸長度/cmCMDI評分組織病理學評分 對照—11.6±0.400 DSS—10.3±0.7##2.25±1.26##2.50±0.24## DSS＋白念珠菌—9.5±0.9##2.00±1.41##2.67±0.33## BAEB2010.4±0.3*2.33±1.150.78±0.19* 4010.9±0.3**1.00±1.00*0.44±0.19** 8011.4±0.6**0.67±0.58**0.56±0.19** 美沙拉嗪20010.6±0.7*2.33±1.151.11±0.38

A-對照組 B-DSS組 C-DSS＋白念珠菌組 D-美沙拉嗪組 E-BAEB低劑量組 F-BAEB中劑量組 G-BAEB高劑量組，下圖同

3.3 BAEB對小鼠腸道白念珠菌載荷的影響

收集小鼠第1、5、9、13天的糞便，在科瑪嘉的培養板上培養，長出的藍色光滑菌落是白念珠菌。如表6所示，DSS＋白念珠菌組小鼠糞便白念珠菌增多，與對照組相比有顯著差異（＜0.01）；第8天給予BAEB后，白念珠菌在腸道定植能力下降，菌落形成單位（colony forming units，CFU）隨著治療時間延長逐漸減小，各治療組與同時間點DSS＋白念珠菌組相比有明顯下降（＜0.01）；第13天BAEB中、高劑量組與DSS＋白念珠菌組相比CFU明顯下降（＜0.01）。因此，BAEB降低DSS誘導UC小鼠結腸CFU，呈劑量相關性。

表6 BAEB對白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠腸道白念珠菌載荷的影響(, n = 15)

Table 6 Effect of BAEB on intestinal Candida albicans load in UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)CFU 第1天第5天第9天第13天 對照—0000 DSS—0000 DSS＋白念珠菌—0233.50±8.32##328.67±17.82##66.00±1.73## BAEB200268.00±32.11193.67±25.04**58.33±14.84 400246.00±45.21173.33±11.18**53.50±2.83** 800266.50±27.78128.00±22.02**40.33±10.05** 美沙拉嗪2000277.00±39.88202.75±16.62**60.17±5.01

3.4 BAEB對結腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達的影響

如圖2、3所示，Occludin和ZO-1的表達定位于腸黏膜上皮細胞的細胞膜，鏡下呈棕色。DSS＋白念珠菌組Occludin和ZO-1陽性表達均降低。給予BAEB治療后，Occludin和ZO-1陽性表達上升，以BAEB低、中劑量組效果明顯（＜0.05、0.01）。說明BAEB低劑量下可明顯促進Occludin和ZO-1的表達，且效果與美沙拉嗪相似。

3.5 BAEB對小鼠結腸組織中IL-1β和IL-18水平的影響

如表7所示，與對照組相比，DSS組與DSS＋白念珠菌組小數結腸組織中促炎因子IL-1β、IL-18水平明顯升高（＜0.01）；與DSS＋白念珠菌組相比，BAEB各劑量組小鼠結腸組織中IL-1β、IL-18水平均明顯降低（＜0.05、0.01）。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與DSS＋白念珠菌組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 BAEB對白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠結腸組織Occludin蛋白表達的影響(×200)

表7 BAEB對白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠結腸組織IL-1β和IL-18水平的影響(, n = 15)

Table 7 Effect of BAEB on IL-1β and IL-18 levels in colon tissue of UC mice induced by DSS with C. albicans colonization (, n = 15)

組別劑量/(mg·kg?1)IL-1β/(pg·mg?1)IL-18/(pg·mg?1) 對照—0.68±0.060.72±0.04 DSS—1.24±0.09##1.22±0.09## DSS＋白念珠菌—1.28±0.04##1.23±0.25## BAEB201.15±0.07*1.06±0.05* 401.18±0.06*1.12±0.04* 801.08±0.06**1.04±0.08* 美沙拉嗪2001.02±0.05**1.02±0.06*

3.6 BAEB對小鼠結腸組織Dectin-1、NF-κB、Syk、ASC、cleaved Caspase-1和NLRP3蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組相比，DSS＋白念珠菌組小鼠結腸組織NLRP3、NF-κB和Dectin-1蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01），ASC、cleaved Caspase-1和Syk蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01），且DSS＋白念珠菌組的變化較DSS組明顯；與DSS＋白念珠菌組相比，BAEB低劑量組Syk蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）；BAEB中劑量組ASC和Syk蛋白表達水平顯著升高（＜0.05、0.01），NLRP3和NF-κB蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）；BAEB高劑量組ASC蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），NF-κB蛋白表達水平顯著降低（＜0.01）。

4 討論

目前公認UC的發病機制與腸道菌群失衡及腸道免疫功能紊亂密切相關。近年來研究發現，UC患者腸道內菌群多樣性明顯降低，白念珠菌比例顯著增加[20]，白念珠菌在腸道過度定植與UC病情程度呈強相關性。但是目前對腸道真菌菌群的研究相對較少[21]。

圖4 BAEB對白念珠菌定植的DSS誘導UC小鼠結腸組織NLRP3、Syk、NF-κB、Dectin-1、ASC和cleaved Caspase-1蛋白表達的影響(, n = 5)

本研究中，通過飲用DSS結合ig白念珠菌構建白念珠菌異常定植下的小鼠UC模型。結果顯示，DSS＋白念珠菌組小鼠糞便培養出的白念珠菌遠多于對照組和DSS組，且小鼠結腸黏膜損傷程度、血清和組織炎癥因子水平均明顯高于對照組和DSS組，與文獻報道一致[9]。給予BAEB治療7 d后，小鼠的便溏便血、體質量下降和結腸長度縮短等體征得到顯著改善，DAI評分明顯下降，結腸黏膜的炎性細胞浸潤、上皮細胞損傷、腺體紊亂和消失的現象有所減輕，腸道白念珠菌CFU數明顯減少，反映腸黏膜屏障功能的Occludin和ZO-1蛋白表達增加。結果提示，BAEB對白念珠菌定植的UC小鼠具有抑制腸道白念珠菌增殖、保護腸道黏膜屏障、減輕腸道炎癥損傷的作用。

腸道白念珠菌過度定植時，白念珠菌通過轉位激活腸黏膜組織內巨噬細胞NLRP3的表達、Caspase-1的活化和IL-1β、IL-18的分泌[22]，以NLRP3炎性小體依賴性方式誘導初級巨噬細胞成熟并分泌IL-1β、IL-18[23]。炎癥小體是一類由胞質內模式識別受體參與組裝的多蛋白復合體，能夠識別病原體表面的病原相關分子模式或者宿主來源的危險信號分子。當免疫細胞受到刺激時，炎癥小體各組分結合成復合物，隨后經過一系列酶解反應，產生和釋放大量促炎性細胞因子IL-1β和IL-18。其中，對炎癥小體的研究目前以NLRP3為最多[24]。

NLRP3炎癥小體復合物由識別分子NLRP3、接頭分子ASC和效應分子Caspase-1等組成。當免疫細胞被細菌、真菌、病毒等病原體的病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），以及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、尿酸晶體、β淀粉樣纖維等損傷相關分子模式分子（damage-associated molecular patterns，DAMPs）刺激時，NLRP3炎癥小體被激活。隨后NLRP3自身寡聚化，招募并活化ASC，ASC活化形成大分子的二聚體，招募并活化Caspase-1前體。活化的Caspase-1剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，產生IL-1β和IL-18并釋放，引起宿主炎癥反應[25]。本研究中，DSS＋白念珠菌組小鼠結腸組織促炎因子IL-1β和IL-18水平明顯高于對照組，說明在DSS誘導的基礎上伴有白念珠菌的定植會加重UC的炎癥反應，可能與激活結腸黏膜組織內巨噬細胞，觸發NLRP3炎癥小體活化，釋放大量炎性因子IL-1β和IL-18，造成結腸黏膜組織炎性損傷有關。白念珠菌異常定植可能參與這一過程。給予BAEB治療后，小鼠結腸組織中IL-1β、IL-18水平降低，結腸黏膜組織炎性損傷有所減輕，推測BAEB可能是通過阻斷NLRP3炎癥小體活化及相關信號通路，進而抑制IL-1β、IL-18釋放并抑制白念珠菌定植，從而發揮作用。

真菌感染時，巨噬細胞內Dectin-1/Syk通路得以激活，并介導NLRP3炎癥小體活化，產生IL-1β、IL-18，但大量IL-1β、IL-18的產生會引起相應組織的炎性損傷。為證實BAEB可能通過靶向Dectin-1/Syk通路及其介導的NLRP3炎癥小體從而抑制IL-1β、IL-18釋放以緩解UC的作用機制，檢測Dectin-1/Syk通路中相關蛋白與NLRP3炎癥小體的表達。白念珠菌細胞壁成分β-1,3-葡聚糖作為PAMP被宿主免疫細胞，特別是巨噬細胞上的模式識別受體Dectin-1識別。Dectin-1是膜相關C型凝集素受體家族的最重要成員。當Dectin-1結合β-1,3-葡聚糖后，其胞內的免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）中的酪氨酸首先被Src家族激酶磷酸化，繼而招募Syk，Syk磷酸化后可激活磷脂酰肌醇特異性磷脂酶Cγ2（phospholipase Cγ2，PLCγ2）/Ca2+，促使蛋白激酶Cδ（protein kinase Cδ，PKCδ）活化，誘導Ca2+/活化T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）/NLRP3炎癥小體的合成，即白念珠菌β-1,3-葡聚糖可通過Dectin-1/Syk信號通路活化NLRP3炎癥小體，進而產生大量IL-1β與IL-18。因此，該信號通路被視為白念珠菌感染引起NLRP3炎癥小體活化造成免疫炎癥性損傷的一個重要干預靶標[12]。本研究發現，給予BAEB治療后，Dectin-1、NF-κB、NLRP3表達呈不同程度地降低，ASC、Syk和cleaved Caspase-1表達上升。結果表明，BAEB可能通過抑制Dectin-1、NF-κB、NLRP3等蛋白的表達，抑制ASC二聚體化及Syk磷酸化等，抑制Dectin-1/Syk通路介導的NLRP3炎癥小體過度活化，進而阻斷IL-1β與IL-18的產生來發揮抗UC作用。本研究發現，不同劑量的BAEB治療效果存在差異。綜合各項指標，以BAEB中劑量的作用效果較明顯且穩定。說明BAEB在治療白念珠菌異常定植下的小鼠UC時，治療效果無劑量相關性，其作用效果有一個最佳藥物劑量。

綜上所述，BAEB通過抑制白念珠菌定植，促進黏膜上皮修復，減輕結腸黏膜損傷與炎性細胞浸潤，減少促炎因子IL-1β和IL-18的分泌，從而發揮對白念珠菌異常定植下的UC的治療作用，其作用機制可能與BAEB抑制巨噬細胞Dectin-1/Syk通路介導的NLRP3炎癥小體過度活化有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction on ulcerative colitis in mice colonized bybased on NLRP3 inflammasome

WANG Ya-dong1, 2, XU Zhi-qing1, 2, XIA Dan1, 2, ZHANG Meng-xiang1, 2, WANG Tian-ming1, 2, 3, SHAO Jing1, 2, 3, WANG Chang-zhong1, 2, 3

1. School of Integrated Traditional and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 2. Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui Academy of Chinese Medicine, Hefei 230012, China 3. Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China

To observe the therapeutic effect of butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction (BAEB) on ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS) stimulated by abnormal colonization ofin mice and Dectin-1/spleen tyrosine kinase (Syk)/NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3) signaling pathway.A total of 105C57BL/6 mice were randomly divided into control group, DSS group, DSS +group and BAEB low-, medium- and high-dose (20, 40, 80 mg/kg) groups and mesalazine (200 mg/kg) group. Mice in control group were given free access to water every day; DSS group was given 3% DSS solution for seven consecutive days; Other groups were ig(1×108CFU) on 1st, 3rd, 5th, and 7th days on basis of DSS group. On 8th day, mice were ig corresponding drugs, once a day for seven consecutive days. Body weight of mice was weighed every day, general state was observed, feces were collected, and fecal fungal load was detected by plate culture method. The day after last administration, mice were sacrificed, colon length was measured, and hematoxylin-eosin (HE) staining was used for colon histological analysis; ELISA was used to detect the inflammatory factor interleukin-1β (IL-1β) and IL-18 levels in colon tissue; Immunohistochemistry was used to detect the expression of Occludin and zonula occludens-1 (ZO-1) in colon tissue; Western blotting was used to detect protein expressions of Dectin-1, nuclear factor-κB (NF-κB), Syk, apoptosis-associated speck-like protein containing CARD (ASC), cleaved cystein-asparate protease-1 (cleaved Caspase-1) and NLRP3 in colon tissue.Compared with control group and DSS group, morewere cultured in feces of mice in DSS +group (< 0.01); Degree of colonic mucosal injury was severe (< 0.01); Inflammatory factors IL-1β and IL-18 levels in colon tissue were significantly increased (< 0.01); Occludin and ZO-1 protein expressions in colon tissue were significantly decreased (< 0.05); NLRP3, NF-κB and Dectin-1 protein expressions in colon tissue were significantly increased (< 0.01), ASC, cleaved Caspase-1 and Syk protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01). Compared with DSS +group, number of colony-forming units (CFU) ofin intestinal tract of mice in BAEB group was decreased (< 0.01); Levels of IL-1β and IL-18 in colon tissue were decreased (< 0.05, 0.01); Occludin and ZO-1 protein expressions in colon tissue were increased (< 0.05, 0.01); Syk protein expression in low-dose BAEB group was significantly decreased (< 0.01); ASC and Syk protein expressions in BAEB medium-dose group were significantly increased (< 0.05, 0.01), NLRP3 and NF-κB protein expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.01); NF-κB protein expressions in BAEB high-dose group was significantly decreased (< 0.01), ASC protein expression was significantly increased (< 0.01).BAEB may exert anti-UC effect by inhibiting the overactivation of NLRP3 inflammasome mediated by Dectin-1/Syk pathway under abnormalcolonization, thereby blocking the production of IL-1β and IL-18.

; ulcerative colitis; butyl alcohol extract of Baitouweng Decoction (BAEB); NLRP3 inflammasome; Dectin-1/Syk signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)13 - 3997 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.013

2022-03-07

國家自然科學基金資助項目（81774034）；國家自然科學基金資助項目（81573725）；安徽省自然科學基金資助項目（1808085QH286）；安徽中醫藥大學重點項目（2019zrzd04）；安徽省教育廳重點項目（KJ2017A301，KJ2018A0276）

王亞東（1980—），男，碩士研究生，研究方向為中藥抗感染與免疫。Tel: 13855102327 E-mail: 13855102327@qq.com

汪長中，博士生導師，主要從事中醫藥抗感染與免疫研究。E-mail: ahwcz63@sina.com

[責任編輯 李亞楠]