三烏膠提取物水凝膠的制備及其對類風濕性關節炎治療作用研究

肖素蕓，羅才琴，呂 冬，王承瀟，崔秀明, 3*

·藥劑與工藝·

三烏膠提取物水凝膠的制備及其對類風濕性關節炎治療作用研究

肖素蕓1, 2，羅才琴1, 2，呂 冬1, 2，王承瀟1, 2，崔秀明1, 2, 3*

1. 昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500 2. 云南省三七資源可持續利用重點實驗室，云南 昆明 650500 3. 國家中藥材產業技術體系昆明綜合試驗站，云南 昆明 650500

制備三烏膠提取物水凝膠并進行表征及考察其對類風濕性關節炎的治療作用。采用Franz池法考察三烏膠提取物中二苯乙烯苷、苯甲酰新烏頭堿、8-去乙酰滇烏堿、去乙酰粗莖烏頭堿甲、草烏甲素和大黃素的體外滲透效果，制備出三烏膠提取物水凝膠并對其理化性質進行表征；同時，建立膠原誘導的類風濕性關節炎（collagen-induced rheumatoid arthritis，CIA）大鼠模型，研究經皮遞送模式下三烏膠提取物對類風濕性關節炎的治療作用。制備的三烏膠提取物水凝膠在常規情況下始終保持凝膠狀態；并且其三維交聯網狀結構可使藥物更好的持續性地釋放，從而達到緩釋效果。體內藥理實驗表明，三烏膠提取物水凝膠顯著降低CIA大鼠的足厚度、足體積、關節炎指數水平和血清中類風濕因子（rheumatoid factor，RF）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）和B細胞淋巴瘤因子-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）的水平及升高Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）水平；與口服相比，水凝膠能降低谷氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、肌酐和尿素氮水平和臟器病變程度。采用經皮遞送的局部給藥模式，三烏膠提取物在保留治療作用的同時降低了由于口服給藥引起的臟器毒性，為今后三烏膠提取物外用制劑的研究提供了可能性。

三烏膠提取物；水凝膠；經皮藥物遞送；體外滲透；類風濕性關節炎；生物毒性；二苯乙烯苷；苯甲酰新烏頭堿；8-去乙酰滇烏堿；去乙酰粗莖烏頭堿甲；草烏甲素；大黃素；類風濕因子；C反應蛋白；B細胞淋巴瘤因子-2；Bcl-2相關X蛋白；谷氨酸轉氨酶；丙氨酸轉氨酶；肌酐；尿素氮

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜增生和慢性炎癥為特征的慢性全身性自身免疫性疾病[1]。RA的主要癥狀是炎癥、關節腫脹、伴隨關節軟骨進行性損傷，甚至功能障礙[2-4]。目前臨床上RA的主要治療藥物是疾病修飾抗風濕藥物（disease modifying antirheumatic drugs，DMARDs），但是副作用較為明顯，長期或大劑量服用會損傷胃腸道和產生過敏反應，甚至肝腎功能異常和骨髓抑制[5-6]，因此，開發抗RA的天然藥物尤為重要。

臨床上常用烏頭類中藥及炮制品治療風濕類疾病。三烏膠丸是云南黑藥的代表品種之一，由黃草烏Kom、川烏Debx.、何首烏Thunb、附片（黑順片）Debx和白附子Engl組成；其主要用于風寒濕邪、風痰、瘀血引起的風濕麻木、中風偏癱、口眼歪斜及風濕性關節炎、RA等[7-8]。有關研究表明，三烏膠丸中烏頭堿類成分能夠影響細胞的增殖和凋亡，且具有免疫調節特性，可能是治療自身免疫性疾病的潛在有效藥物[9-10]，但其原料藥對臟器具有毒性作用[11-13]。因此，為提高三烏膠丸用藥安全性，對其傳統口服給藥治療方式進行改良，針對其局部病癥的特點，尋找一種能維持血藥濃度相對穩定的給藥方式具有重要意義。

經皮給藥系統（transdermal drug delivery，TDDS）具有避免肝腸首過效應、提高用藥安全、提高患者依從性和維持血藥濃度穩定性等特點，其中新型載體水凝膠不僅能夠滿足三烏膠提取物的給藥需求，而且能增加水難溶性藥物的溶解度，其交聯的網狀結構能延長藥物滯留時間，從而達到緩釋作用[14-15]。據此，本研究首先考察了三烏膠提取物中6種指標性成分的體外滲透能力，以皮膚透過量為指標，對三烏膠提取物溶劑種類和促滲劑用量進行篩選；基于此，制備三烏膠提取物水凝膠并對其進行表征，同時采用膠原誘導型RA大鼠為模型，進一步評估三烏膠提取物水凝膠經皮遞送對RA的治療效果和生物毒性，為三烏膠丸后續深入研究提供新的研究思路和策略。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-2030Plus型高效液相色譜儀，日本島津公司；梅特勒AL-104型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RYJ-12B型Franz擴散試驗儀，上海黃海藥檢儀器有限公司；UPT-I-20T型優普系列超純水器，成都超純科技有限公司；RCT基型磁力攪拌加熱器，德國艾卡有限公司；SM600型酶標儀，上海永創醫療器械有限公司；DMO-412型低速離心機，美國Scilogex公司；SU8100型掃描電子顯微鏡（SEM），日本Hitachi公司。

1.2 藥品與試劑

三烏膠提取物是參照云南金烏黑藥制藥有限公司優化后的煎煮制備流程，并按照三烏膠丸處方比例，將9 g黃草烏、6 g川烏、1.5 g黑順片、4.5 g何首烏和3 g生白附子提取制備成干浸膏，相當于原生藥1.71 g/g；對照品二苯乙烯苷（2,3,5,4′- tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside，TSG，批號Yz021521）、苯甲酰新烏頭堿（benzoylmesaconine，BMA，批號wkq20041701）、8-去乙酰滇烏堿（8- deacetylyunaconitine，8-DCA，批號Yz0201221）、草烏甲素（crassicauline A，批號Yz042122）、大黃素（emodin，批號Yz080920），質量分數均為98%，購自南京源植生物科技有限公司；對照品去乙酰粗莖烏頭堿甲（sinapic acid crassicauline，SAC，批號19112201），質量分數為98%，購自成都普菲德生物技術有限公司；二甲基甲酰胺（,- dimethylformamide，DMF，批號D111999）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號），均購自上海百舜生物科技有限公司；聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG），批號8598479，購自武漢卡諾斯科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP），批號20190404，購自天津市大茂化學試劑廠；羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na），批號20180718，購自天津市致遠化學試劑有限公司；甲氨蝶呤（批號RH221275）、牛II型膠原蛋白（CII，批號L22S11C125306）購自上海源葉生物科技有限公司；完全弗氏佐劑（CFA，批號SLCH4887）購自美國Sigma-Aldrich公司；類風濕因子（rheumatoid factor，RF，批號202109）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP，批號202109）、B細胞淋巴瘤因子2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批號202109）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax，批號202109）的試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；谷氨酸轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST，批號C010-2-1）、丙氨酸轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT，批號C009-2-1）、肌酐（批號C011-2-1）和尿素氮（批號C013-2-1）的試劑盒購自南京建成生物工程研究所；所用的化學藥品和試劑都是分析純級別。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019- 0004，體質量160～200 g。動物在恒定的室溫（25 ℃，相對濕度70%～75%）下飼養。所有動物研究經昆明理工大學動物實驗倫理委員會批準，批準號為PZWH（滇）K2021-0004。

2 方法與結果

2.1 提取物中6種指標性成分分析方法的建立

2.1.1 色譜條件 參考本課題組前期發表的文獻方法[16]。色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.2%二乙胺（磷酸調節pH為4.0）水溶液-乙腈，流動相梯度為0～15 min，10%～20%乙腈；15～45 min，20%～40%乙腈；45～55 min，40%～70%乙腈；55～70 min，70%乙腈；體積流量為1.0 mL/min；進樣量為25 μL；檢測波長為245 nm；柱溫為30 ℃；理論塔板數按照所有峰計算均不低于3000。

2.1.2 線性關系考察 精密稱取TSG、BMA、8- DCA、SAC、草烏甲素、大黃素各適量，用酸性甲醇溶液制成質量濃度分別為700、800、700、800、500、200 μg/mL的混合對照品儲備液；分別精密移取混合對照品溶液加酸性甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對照品溶液。照“2.1.1”項色譜條件進行HPLC檢測，以進樣質量濃度為橫坐標（），峰面積值為縱坐標（），繪制標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程分別為TSG＝11 727 831.648 4－57 860.619 3，＝0.999 1，線性范圍0.007～70.000 μg/mL；BMA＝9 523 875.004 0－21 540.034 1，＝0.999 8，線性范圍0.008～80.000 μg/mL；8-DCA＝14 880 359.851 2－24 512.274 0，＝0.999 9，線性范圍0.007～70.000 μg/mL；SAC＝22 665 612.465 5－42 921.655 5，＝0.999 9，線性范圍0.008～80.000 μg/mL；草烏甲素＝30 000 947.232 9－42 758.540 0，＝0.999 8，線性范圍0.005～50.000 μg/mL；大黃素＝41 750 102.139 7－21 304.199 6，＝0.999 9，線性范圍0.002～20.000 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的配制 取各個時間點的透皮接收液，吹干，殘渣加甲醇定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得透皮供試品溶液。

2.1.4 精密度試驗 精密吸取6種指標性成分的混合對照品儲備液25 μL，照上述色譜條件測定，重復進樣6次，進行精密度試驗，結果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素峰面積的RSD分別為1.08%、1.19%、0.75%、1.06%、0.19%、0.49%，結果表明儀器系統精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 精密吸取6份同一時間點的透皮供試品溶液25 μL，照上述色譜條件測定，進行重復性試驗，結果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素質量濃度的RSD分別為0.80%、0.92%、0.70%、0.94%、1.25%、1.07%，結果表明該方法重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 取透皮供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、12、24 h進行HPLC測定，進行穩定性試驗，結果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素峰面積的RSD分別為0.77%、1.08%、1.66%、0.75%、1.75%、0.80%，結果表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 精密取6種指標性成分含量已測定的透皮供試品溶液25 μL，加入適量混合對照品儲備液，進HPLC測定6種指標性成分的總含量，計算得平均加樣回收率，結果TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素、大黃素的平均加樣回收率分別為96.96%、97.50%、96.43%、99.57%、96.71%、95.38%，RSD分別為2.44%、1.62%、1.74%、1.86%、1.35%、2.39%，結果表明該方法的加樣回收率良好。

2.1.8 樣品測定 精密吸取混合對照品儲備液、透皮供試品溶液、空白溶劑各25 μL，按“2.1.1”項色譜條件測定，結果表明該方法專屬性良好，HPLC圖見圖1。

1-TSG 2-BMA 3-8-DCA 4-SAC 5-草烏甲素 6-大黃素

2.2 數據處理與分析

2.3 提取物溶解度的測定

分別稱取1.2 g提取物加入5種不同的溶劑10 mL，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz、水溫40 ℃以下）2 h，放冷，12 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）10 min，取上清液，吹干，加入1 mL酸性甲醇，0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項色譜條件進行HPLC測定，考察5種不同溶劑對提取物中6種指標性成分溶解度的影響，結果如表1所示，TSG、8-DCA、SAC、草烏甲素和大黃素在10%乙醇中溶解度最高，BMA在水溶液中溶解度最高。綜合可知，提取物中6種指標性成分溶解度總和在10%乙醇中最高，分別為40.41、60.01、25.72、12.62、5.84、1.71 μg/mL。

2.4 體外透皮試驗

2.4.1 溶劑考察 分別取1.2 g提取物加入10 mL 5種不同的溶劑，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz、水溫40 ℃以下）2 h，放冷，12 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）10 min，取上清液，即得供給池溶液。參考有關文獻方法[17]進行離體鼠皮的制備和體外透皮實驗，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）為接收液，轉速約600 r/min，保持透皮儀內溫度恒定為37 ℃，接收池體積為7 mL，透皮擴散面積2.8 cm2。在24 h時取1.0 mL接收液樣品，離心、濾過，取上清液，通過“2.1”項下方法進行分析，根據6種指標性成分的峰面積，計算透皮供試品溶液中各成分藥物質量濃度，并按公式計算各時間點6種指標性成分的皮膚透過量（Δ）。

表1 不同溶劑下6種指標性成分的溶解度(, n = 3)

Table 1 Solubility of six index components in different solvents (, n = 3)

溶劑溶解度/(μg?mL?1) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 水37.01±0.84b60.77±0.45a24.46±0.18a12.16±0.73a5.69±0.17ab1.68±0.07a141.76±0.61b 10%乙醇40.41±0.64a60.01±0.48a25.72±0.25a12.62±0.81a5.84±0.11a1.71±0.10a146.31±1.81a DMSO40.06±0.34a59.53±0.52a19.32±0.28b11.42±0.58a4.07±0.19d1.54±0.18b135.94±1.40c DMF39.36±0.95b51.43±0.49b17.50±0.22b12.38±0.69a5.11±0.16c1.53±0.12b127.31±1.19d PEG35.16±0.84c27.73±0.33c12.53±0.16c8.78±0.21b5.40±0.15bc1.54±0.12b91.14±1.75e

不同字母表示相同指標不同處理差異顯著（＜0.05），下表同

different letters indicate that the same index is significantly different from different treatments(< 0.05), same as below tables

Δ＝CV/e

C為某一時間點透皮接收液中的藥物質量濃度，為接收液的體積，e為擴散池的有效面積

由表2可知，提取物中6種指標性成分的皮膚滲透作用在不同溶劑中呈現不同的變化規律，如TSG、BMA、SAC和大黃素的Δ在10%乙醇中最多，而8-DCA在DMSO中最多；因此本研究以6種指標性成分Δ的總和來確定提取溶劑。結果表明采用10%乙醇作為溶劑時Δ最高，因此，選擇10%乙醇作為提取溶劑進行后續研究。

2.4.2 促滲劑用量考察 根據前期預試驗結果，選擇氮酮作為促滲劑。采用“2.4.1”項下方法，對氮酮用量進行考察。結果如表3所示，在3%氮酮作用下，有效成分的Δ均相對較高，比10%乙醇提高約2倍。根據上述研究，在10%乙醇作為溶劑和3%氮酮作為促滲劑的情況下，提取物具有較強的經皮滲透能力。

2.5 提取物水凝膠的制備

選擇以上條件制備水凝膠。參考文獻報道的方法[18]，取1.2 g提取物，加入10 mL 10%乙醇溶液，超聲離心，得上清液并濃縮為2 g，再加入氮酮0.06 g，即得提取物10%乙醇儲備液。精密稱取0.15 g PVP置于50 mL燒杯中，每份加入0.2 g CMC-Na，混合均勻后，加入0.5 g甘油，加入5 mL去離子水，室溫放置溶脹12 h后，制得空白基質；隨后取提取物10%醇儲備液，與空白基質混合均勻，補足去離子水至凝膠體系為10 g，即得提取物水凝膠，水凝膠制備流程圖見圖2-A，水凝膠示意圖見圖2-B。

表2 不同溶劑下6種指標性成分的ΔM(, n = 3)

Table 2 ΔM of six index components in different solvents (, n = 3)

溶劑ΔM/(μg?cm?2) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 水1.23±0.16ab2.15±0.30a0.31±0.10b0.29±0.02b0.16±0.02a0.22±0.03ab4.36±0.63b 10%乙醇1.56±0.32a2.20±0.13a0.38±0.07b0.58±0.03a0.17±0.01a0.27±0.04a5.16±0.56a DMSO0.82±0.22bc1.08±0.26b0.29±0.02a0.11±0.01c0.16±0.01b0.17±0.01ab2.63±0.47c DMF1.05±0.12cd0.89±0.12b0.78±0.04b0.18±0.01c0.13±0.01a0.22±0.01b3.25±0.10c PEG0.63±0.09a0.13±0.03c0.44±0.03b0.02±0.00d0.04±0.00c0.06±0.00c1.32±0.11d

表3 不同用量的氮酮對6種指標性成分的ΔM(, n = 3)

Table 3 ΔM of six index components by different concentrations of azone (, n = 3)

用量/%ΔM/(μg?cm?2) TSGBMA8-DCASAC草烏甲素大黃素總和 11.20±0.07a4.83±0.05c0.46±0.01d0.98±0.07bc0.35±0.06b0.20±0.06b8.02±0.13b 21.31±0.04a5.22±0.07ab0.53±0.04c0.95±0.06c0.43±0.06ab0.25±0.06b8.69±0.16b 31.53±0.08a5.83±0.77a0.68±0.06a1.41±0.11a0.51±0.11a0.32±0.06a10.28±0.90a 41.49±0.09b5.19±0.73b0.61±0.01b1.09±0.04b0.44±0.04ab0.24±0.07b9.06±0.91b 51.43±0.02b5.23±0.66b0.56±0.03bc1.07±0.05bc0.23±0.05c0.25±0.02b8.77±0.65b

圖2 提取物水凝膠制備流程圖(A) 和示意圖(B)

2.6 提取物水凝膠中6種指標性成分含量的測定

按“2.5”項下方法制備3批提取物水凝膠溶解于10 mL超純水中，12 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）10 min，濾過，吹干，加入1 mL酸性甲醇，0.22 μm微孔濾膜濾過，進行HPLC檢測。結果表明，6種指標性成分TSG、BMA、8-DCA、SAC、草烏甲素和大黃素的質量濃度分別為（25.53±0.52）、（58.01±6.80）、（12.46±0.33）、（11.62±0.81）、（5.26±0.31）、（1.42±0.09）μg/mL。

2.7 提取物水凝膠的表征

2.7.1 pH值的測定 取3批提取物水凝膠，分別稱取1 g置于小燒杯中，并加入25 mL水稀釋，分別測定其pH值。結果pH值分別為5.60、5.65、5.55，與皮膚pH值相接近，刺激性較小，符合皮膚局部外用制劑對pH值的要求。

2.7.2 流變學測試

（1）振幅掃描：在凝膠線性黏彈區（linear viscoelastic region of gel，LVER）內進行動態振蕩試驗，其測試結果可得到凝膠結構被破壞所能承受的最大形變。在剪切應變（）為0.01%～100%，溫度為25 ℃、角頻率（）為1 rad/s的振幅掃描條件下測定樣品的LVER的結果。如圖3-A所示，＜45%，儲能模量（′）＞損耗模量（″），彈性占主體，即樣品表現出凝膠結構；當′＝″時，凝膠結構完全被破壞；當＞45%，′＜″，黏性占主體，表現出流體性質。證明控制在45%以內，提取物水凝膠呈凝膠狀態。

（2）頻率掃描：在非破壞性變形范圍內，樣品的時間相關特性用頻率掃描來描述。在為1%，溫度為25 ℃，為0.1～100 rad/s條件下對凝膠進行頻率掃描。如圖3-B所示。在整個頻率掃描中，′曲線始終高于″曲線，明顯表現出以彈性為主的特性，始終呈現凝膠狀態；且′較穩定，未出現顯著的頻率依賴性，表明該提取物凝膠具有穩定結構。

（3）溫度掃描：在動態模式下，固定為1 rad/s，為1%，樣品以2 ℃/min的速率加熱，溫度在20～50 ℃條件下對凝膠進行溫度掃描。如圖3-C所示，在20～50 ℃，隨著溫度升高，′一直大于″，呈凝膠狀態；但′和″呈不斷下降趨勢，這可能是由于溫度升高，分子熱運動程度加劇，高分子鏈之間網絡結構被破壞造成的，表明在常規溫度下，該凝膠始終保持凝膠狀態。

（4）時間掃描：在動態模式下，固定為1 rad/s，為1%，溫度25 ℃的條件下，在0～30 min內對凝膠進行時間掃描。如圖3-D所示，在0～30 min，隨著時間增加，′一直大于″，明顯表現出以彈性為主的特性，表明該凝膠始終呈凝膠狀態。

2.7.3 SEM測試 將提取物水凝膠真空冷凍干燥，取適量凍干粉末，噴金處理，利用SEM觀察凝膠微觀形貌。結果如圖4所示，凝膠內部為三維交聯網狀結構，這使其具有較好的延展能力及皮膚滯留特性，也為經皮遞送提供了穩定的物化環境，藥物可更好的持續性地釋放，從而達到緩釋效果。

2.7.4 初步穩定性考察 將4批提取物水凝膠分別置于不同溫度（4、25、35、45 ℃）下，考察0、5、10 d凝膠中6種指標性成分含量總和、pH值的變化情況，以確定提取物水凝膠最佳存放條件。由表4可知，溫度對提取物水凝膠的穩定性影響顯著，隨著時間的推移，提取物水凝膠中6種指標性成分含量不斷減少，且pH值也隨之增加。4 ℃的存放環境對提取物水凝膠的穩定性影響較小，因此，該凝膠貯藏于4 ℃為宜。

圖4 不同放大倍數下提取物水凝膠SEM圖

表4 提取物水凝膠初步穩定性考察

Table 4 Stability investigation of extract-hydrogel

t/d6種指標性成分含量的總和/%pH值 4 ℃25 ℃35 ℃45 ℃4 ℃25 ℃35 ℃45 ℃ 0101.03±1.0399.90±2.3099.98±2.0699.83±3.885.59±0.025.67±0.015.63±0.025.77±0.02 598.47±3.9499.23±2.7798.89±2.9598.16±5.545.58±0.035.63±0.025.52±0.035.67±0.02 1094.84±11.2993.94±7.2294.35±3.8293.31±6.695.68±0.035.65±0.025.69±0.045.72±0.02

2.8 提取物水凝膠對RA治療作用的研究

2.8.1 RA模型的建立 參考相關文獻進行膠原誘導的類風濕性關節炎（collagen-induced rheumatoid arthritis，CIA）大鼠模型的建立[19]。將CII凍干粉溶解于0.1 mol/L的醋酸中，制成2 mg/mL的CII醋酸溶液，與等體積CFA置于冰上研磨乳化至滴入水中不散開為止，即得1 mg/mL乳劑I；同法與等體積IFA配成乳劑II。開始對每只大鼠進行尾根部皮內2個位點共注射配制好的乳劑I 0.1 mL，第21天，每只大鼠相同部位重復注射相同劑量的乳劑II以加強免疫（二次免疫），空白對照組大鼠在相同的部位每次注射相同體積的生理鹽水代替膠原蛋白混合物。

2.8.2 分組及給藥 第21天后，將造模成功大鼠隨機分為模型組（等劑量生理鹽水，ig），提取物灌胃組（1.05 g/kg，ig，根據三烏膠丸成人服用劑量換算成大鼠給藥劑量；以下簡稱口服組）、提取物水凝膠組（1 g/只，關節涂抹；以下簡稱水凝膠組），甲氨蝶呤（1 mg/kg，ig）組，每組6只。甲氨蝶呤組3 d/次，其余各組1次/d。二次免疫當天開始給藥，直到第48天，結束給藥。治療結束時，各組大鼠踝關節狀態見圖5。

2.8.3 關節炎療效的評估 將造模當天定為第0天，每隔4 d稱定大鼠體質量，右后肢的足厚度和足體積進行測定；參考有關文獻方法[19]每隔4 d對給藥后大鼠的關節炎程度進行臨床評分。處死大鼠，收集胸腺和脾進行稱定質量，計算各組臟器指數。并收集血液，取上清液按ELISA試劑盒說明書的操作測定RF、CRP、Bcl-2和Bax的含量。

實驗結果（圖6）表明，各組之間大鼠體質量無顯著性差異；與空白組相比，模型組大鼠足厚度和足體積顯著升高，表明造模成功。持續給藥一段時間后，甲氨蝶呤組可顯著降低足厚度、足體積和關節炎指數水平；提取物經過口服和經皮給藥均可降低降低足厚度、足體積和關節炎指數水平，且與甲氨蝶呤相比，無顯著性差異；表明采用局部經皮給藥的模式，未降低提取物對CIA大鼠的治療作用。

圖5 各組大鼠給藥結束后踝關節情況

與空白組比較：###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01

###< 0.001blank group;*< 0.05**< 0.01model group

Fig. 6 Effects of different treatments on the degree of arthritis in rats (,= 6)

同時進一步計算臟器指數，根據胸腺指數和脾臟指數評價提取物對RA的治療作用；結果（圖7）表明，與空白組相比，模型組胸腺和脾臟器指數均顯著升高。與模型組相比，各給藥組均能顯著降低胸腺和脾的臟器指數。隨后測定血清中炎癥相關因子RF及蛋白CRP，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的含量，與對照組比較，模型組大鼠血清中RF、CRP和Bcl-2的水平顯著升高，Bax的水平顯著降低；與模型組比較，甲氨蝶呤組可顯著降低RF、CRP和Bcl-2水平和升高Bax水平，口服和水凝膠組均可顯著降低RF、CRP和Bcl-2水平和升高Bax水平，且效果與甲氨蝶呤相比無顯著差異；這表明各給藥組可能通過降低炎癥，抑制滑膜組織的異常增生和增加凋亡來起到治療關節炎的作用。

2.8.4 毒性評估 進一步研究各給藥組對大鼠毒性的影響，按照試劑盒說明書中使用標準測定大鼠血清中與肝毒性相關指標AST和ALT及腎毒性相關指標尿素氮和肌酐水平，從而評價不同給藥組對CIA大鼠的肝腎損傷情況。如表5所示，與空白組比較，模型組大鼠肝臟中ALT、AST、肌酐和尿素氮水平顯著升高；與模型組比較，持續口服甲氨蝶呤和提取物，ALT、AST、肌酐和尿素氮水平均升高；通過在炎癥部位進行提取物水凝膠局部給藥，ALT、AST、肌酐和尿素氮的升高趨勢均得到了有效抑制。與口服組相比，水凝膠組能顯著降低ALT、AST、肌酐和尿素氮水平，表明提取物水凝膠經皮給藥能通過降低ALT、AST、肌酐和尿素氮水平，減輕對CIA大鼠毒性作用。

同時，取各組大鼠心、肝、脾、肺、腎和胸腺組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察組織病理變化，見圖8。空白對照組大鼠各臟器組織的病理形態改變無明顯差異；如圖中圈出部分所示，模型組大鼠心臟組織斷裂、血管擴張瘀血；肝小葉中度水腫，脾小結內淋巴細胞增生、髓索增粗纖維化；肺泡間隔增厚，色素沉著，纖維結締組織增生；腎皮質內可見多發靜脈管腔擴張，瘀血，提示瘀血性疾病形成；胸腺相鄰小葉皮質之間纖維間隔明顯擴張，可見靜脈擴張瘀血。與模型組比較，甲氨蝶呤組和口服組對各臟器病理組織損傷程度有所緩和，而水凝膠組病變損傷程度最輕，表明提取物水凝膠對CIA大鼠毒性作用最小，經皮給藥可降低提取物的毒性。

與空白組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001 ****P＜0.000 1

表5 不同處理對CIA大鼠血清中ALT、AST、肌酐和尿素氮水平的影響 (, n = 6)

Table 5 Effects of different treatments on the levels of ALT, AST, creatinine and blood urea nitrogen in serum of CIA rats (, n = 6)

組別劑量ALT/(U?L?1)AST/(U?L?1)肌酐/(μmol?L?1)尿素氮/(mmol?L?1) 空白?27.32±2.4918.66±1.8343.88±2.187.72±0.69 模型?30.73±2.08#22.79±2.09#47.89±2.28#8.95±0.59# 甲氨蝶呤1 mg?kg?133.67±2.53*31.41±1.88***55.94±3.41***10.38±1.33* 口服1.05 g?kg?133.18±0.91*28.20±3.67*54.98±2.36***9.71±0.46* 水凝膠1 g?只?128.49±1.42*???20.14±0.70*???44.96±1.88*?8.11±0.53*??

與空白組比較：#＜0.05；與模型組比較：*＜0.05***＜0.001；與口服組比較：?＜0.05??＜0.01???＜0.001

#< 0.05blank group;*< 0.05***< 0.001model group;?< 0.05??< 0.01???< 0.001oral group

3 討論

三烏膠丸口服給藥方式具有復雜的體內代謝和整體的調控機制，這限制了其對局部關節炎的治療效果。而經皮給藥是指在皮膚或黏膜表面給藥，使藥物按恒定、接近恒定或需要的速率通過皮膚各層或黏膜，進入體循環，在全身和局部病灶維持有效的藥物濃度而產生治療作用，能夠避免口服給藥等引起的血藥濃度峰谷現象和有效解決生物大分子在體內易失活及半衰期短等問題的一種給藥方式[20]。因此，本研究改變傳統給藥途徑，通過局部經皮給藥模式，使藥物高效、迅速地在病變部位富集和積累，從而提高三烏膠提取物的用藥安全性，獲得減毒增效的治療效果。

圖8 不同處理對大鼠臟器HE病理學的影響 (×200)

三烏膠提取物活性成分多且復雜，因此選擇6種指標性成分進行系統考察，而不是單一成分。經皮給藥制劑關鍵在于提高藥物的透皮速率，藥物促滲透作用與選擇適宜的溶劑和促滲劑有密不可分的關系[21]，則本實驗以皮膚透過量為考察指標來篩選溶劑種類和氮酮用量，結果表明，以10%乙醇作為溶劑和3%氮酮作為促滲劑，6種活性成分的整體經皮滲透性最好。

考慮到無法采用溶液直接進行關節炎局部給藥，并且提取物中既有水溶性成分又有脂溶性成分，因此，利用水凝膠是具有三維網狀交聯結構的高分子體系，具有優越的生物相容性等特點[22]，選擇水凝膠為劑型載體進行經皮給藥。

本研究結果顯示，與模型組比較，水凝膠組與甲氨蝶呤陽性藥都可顯著降低CIA大鼠血清中RF、CRP和Bcl-2水平及顯著升高Bax水平，表明提取物水凝膠對RA具有治療作用；與口服組比較，水凝膠組可顯著性降低AST、ALT、肌酐和尿素氮水平并且各臟器病變程度更輕，表明其毒性有所降低。綜上，本實驗制備的提取物水凝膠具有良好滲透性能且在保證活性的同時能降低毒性，這為今后三烏膠提取物新劑型的開發和應用提供一定的理論參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of Sanwujiao extract-hydrogel and its therapeutic effect on rheumatoid arthritis

XIAO Su-yun1, 2, LUO Cai-qin1, 2, LYU Dong1, 2, WANG Cheng-xiao1, 2, CUI Xiu-ming1, 2, 3

1. School of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China 2. Key Laboratory ofResources Sustainable Development and Utilization, Kunming 650500, China 3. National Chinese Herbal Medicine Industry Technology System Kunming Comprehensive Test Station, Kunming 650500, China

To prepare and characterize Sanwujiao extract-hydrogel and investigate its therapeutic activity on rheumatoid arthritis.Franz cell method was used to investigate thepermeation effects of 2,3,5,4′-tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside, benzoylmesaconine, 8-deacetylyunaconitine, sinapic acid crassicauline, crassicauline A and emodin in the Sanwujiao extract. The Sanwujiao extract-hydrogel was prepared and its physical and chemical properties were characterized; At the same time, the CIA rat model was established to study the therapeutic activity of Sanwujiao extract on rheumatoid arthritis under percutaneous delivery mode.The Sanwujiao extract-hydrogel was always in the state of gel under normal conditions; And its three-dimensional cross-linked network structure can make the drug release better and continuously, so as to achieve the sustained-release effect. In vivo pharmacological tests showed that the Sanwujiao extract-hydrogel significantly decreased the foot thickness, foot volume, arthritis index level, RF, CRP and Bcl-2 levels in serum and increased Bax levels in CIA rats; It can also reduce the levels of AST, ALT, creatinine and blood urea nitrogen and the degree of organ lesions.Using the local delivery mode of percutaneous delivery, Sanwujiao extract can retain the therapeutic activity and reduce the organ toxicity caused by oral administration, which provides the possibility for the study of external preparations of Sanwujiao extract in the future.

Sanwujiao extract; hydrogel; transdermal drug delivery; topical application; rheumatoid arthritis; biological toxicity; 2,3, 5,4′-tetrahydroxy stilbene 2--β--glucoside; benzoylmesaconine; 8-deacetylyunaconitine; sinapic acid crassicauline; crassicauline A; emodin; rheumatoid factor; C-reactive protein; B-cell lymphoma-2; Bcl-2-associated X protein; aspartate aminotransferase; alanine aminotransferase; creatinine; blood urea nitrogen

R283.6

A

0253 - 2670(2022)13 - 3929 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.006

2022-01-13

國家重大科技專項（202002AA100004-2）；國家重大科技專項（202102AA310045）；國家重大科技專項（202002AA1000056）

肖素蕓（1997—），女，碩士研究生，研究方向為新型中藥制劑。Tel: 13766227297 E-mail: xsy13766227297@163.com

崔秀明（1963—），男，研究員，主要從事中藥資源研究。Tel: 18387186037 E-mail: sanqi37@vip.sina.com

[責任編輯 鄭禮勝]