蘆薈大黃素對衰老蛋雞卵泡氧化應激的緩解作用

胡哲煒，謝儲康，陳艷瓊，周 爍，張才喬

(浙江大學動物科學學院動物醫學系，杭州 310058)

商品雞在200 d左右產蛋率可達95%以上，在480 d后產蛋量快速下降。老年母雞產蛋量的下降主要是由于卵巢老化，伴隨著內分泌變化，卵黃合成和積累減少，以及進入排卵前階段的卵泡數量減少。

卵巢衰退的主要因素之一是細胞內活性氧(ROS)積聚引起的氧化應激。在正常細胞中，抗氧化防御系統來清除ROS，從而減輕氧化應激損傷。然而，由于在老化過程中抗氧化劑水平逐漸降低，活性氧生成和抗氧化系統之間的平衡可能會被破壞。ROS過度累積引起的氧化應激是家禽卵巢組織衰退主要因素。一定水平范圍的ROS有助于維持細胞的正常信號傳導，但是過量的ROS會導致氧化應激，進而損傷細胞和機體。在嚙齒動物類的研究表明，大鼠和小鼠卵泡閉鎖和卵泡顆粒細胞的凋亡由卵巢組織中ROS水平升高導致。肝抗氧化防御功能的降低是導致老齡母雞產蛋性能下降的原因。近幾年，研究人員常篩選天然植物提取物用于緩解氧化應激引起的組織損傷。天然植物提取物主要通過兩種途徑發揮抗氧化作用，一種是對自由基的直接清除，另一種是通過激活與抗氧化作用相關的信號通路調節抗氧化基因和蛋白表達的水平。Nrf2是一種重要的抗氧化基因細胞核轉錄調控因子，參與細胞內多種氧化應激防御系統的調控。Nrf2可以抑制炎癥發生，促進HO-1表達從而抑制細胞凋亡。在蛋雞衰老過程中，蛋雞卵巢抗氧化能力下降，同時Nrf2/HO-1信號通路活性降低。但激活Nrf2/HO-1信號通路是否能夠增強衰老蛋雞卵巢抗氧化能力仍鮮有報道。

目前，對衰老的研究多采用建立實驗性衰老模型，在國內應用最多的是D-半乳糖(D-galactose，D-gal)誘導的衰老模型。D-gal誘導衰老模型特征與自然衰老特征相似，表現為氧化還原失衡、細胞凋亡增加、細胞增殖減少和細胞退行性變化等。實驗室先前的研究也驗證了D-gal誘導的卵巢衰老模型與動物機體正常衰老相似。

蘆薈大黃素(aloe-emodin, AE)，一種天然的蒽醌衍生物，廣泛應用于掌跖、虎杖、何首烏等中草藥中。蘆薈大黃素作為中藥已被用作中藥已有2000多年的歷史，目前仍存在于各種中藥制劑中。蘆薈大黃素具有廣泛的藥理作用，包括抗癌、保肝、抗炎、抗氧化和抗菌等。本研究通過給580日齡(D580)蛋雞注射AE比較母雞肝中卵黃前體的形成和卵泡氧化應激水平，以闡明AE對衰老蛋雞產蛋性能的緩解作用，再通過建立體外卵泡衰老模型，揭示AE通過Nrf2/HO-1信號途徑緩解衰老蛋雞卵泡的氧化應激。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

衰老海蘭白蛋雞(D580)購買自嘉興鑫源旺綠色生態蛋雞養殖場。將D580蛋雞隨機分為4組，分別經腹腔注射5、10和20 mg·kgAE或等量的生理鹽水(對照組)。

1.2 樣品采集

對D580蛋雞進行稱重，并在下次排卵前12 h翅下靜脈采血進行血清的分離。對所有蛋雞頸部脫臼致死，一部分取出的肝組織于4%多聚甲醛(PFA)中固定用于石蠟組織切片，另一部分保存于液氮中用于RNA提取及逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)；取卵巢組織稱重，采集等級前卵泡，按直徑分為大黃卵泡(large yellow follicle，LYF，8～10 mm)、 小黃卵泡(small yellow follicle，SYF，6～8 mm)、 大白卵泡(large white follicle，LWF，4～6 mm) 和小白卵泡(small white follicle，SWF，2～4 mm)， 同時采集等級卵泡(F1～F6),分別稱取等級卵泡質量和各級卵泡數量，取一部分SWFs于4%PFA中固定，用于石蠟組織切片，另一部分保存于液氮中，用于RNA提取及RT-PCR試驗。

1.3 SWF培養

將采集的SWFs用磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)清洗，洗凈表面的紅細胞并轉移至含有1%雙抗的DMEM中。將SWFs用無菌PBS清洗3～5次。在24孔培養板的孔內放入0.45 μm的濾紙片和卵泡，然后加入含有5%FCS、100 IU·mL青霉素、100 μg·mL鏈霉素、2 mmol·L谷氨酰胺和1×ITS(ITS: 30 nmol·L亞硒酸鈉，5 μg·mL轉鐵蛋白和10 μg·mL胰島素)的完全培養基，同時添加不同劑量D-gal(0.1、1.0、10.0 mL·mg)。將24孔板置于38.5 ℃的CO培養箱培養72 h后，觀察SWFs形態變化、細胞凋亡率和增殖率，篩選最佳D-gal 濃度用于建立體外衰老卵泡模型。隨后，在建立的體外衰老卵泡模型中添加不同濃度(5、10、20 μg·mL) 的AE，通過卵泡組織形態觀察、細胞增殖率和凋亡率測定，選擇適宜的AE處理濃度。在組織培養過程中，用D-gal、AE、Nrf2激活劑DMF(3 μmol·L)或抑制劑ML385(6 μmol·L)單獨或聯合處理培養的卵泡，72 h后進行形態觀察、生化指標測定、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)、蛋白質印跡法(Western blot)和免疫熒光檢測。

1.4 組織切片制作和組織染色

固定24 h后的組織，用酒精逐級脫水、石蠟包埋和切片，經蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)或原位末端凋亡法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL)染色后觀察。培養的卵泡組織在體外培養48 h后，在添加10 μg·mL5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)的培養基中繼續培養24 h，然后收集組織制作石蠟切片。用酒精逐級脫水、石蠟包埋和切片，經小鼠抗BrdU抗體(RT1081，HUABIO，杭州)染色后觀察。

1.5 RT-PCR檢測組織mRNA

采集衰老蛋雞的肝組織和培養后的卵泡，研磨后置于冰盒上，Trizol法提取總RNA。提取的RNA通過反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR試驗，反應體系為15 μL。參照GenBank中蛋雞及內參-的基因序列，通過Primer Premier 5.0進行引物設計(表1)。基因引物均由上海生工合成。每個RT-PCR均進行至少9個重復，使用2-ΔΔ法以-為內參基因測定相對mRNA表達水平。

1.6 Western blot

將樣品研磨后至于離心管中，管內加入500 μL RIPA和5 μL PMSF，60 Hz勻漿15 s，12 000 r·min離心15 min。離心后的樣品吸取上清液至新的離心管中，根據說明書用BCA試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定上清液中蛋白濃度。按4∶1的比例混合22 μg蛋白與5×SDS-PAGE loading buffer，99 ℃ 變性10 min。經10% SDS-PAGE電泳45 min后，將蛋白轉移到PVDF膜上，4%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，加一抗孵育。所用的一抗包括：兔抗PCNA(R1306-5, 1∶500 稀釋)、兔抗Caspase 3(ER1802-42, 1∶500稀釋)、兔抗Nrf2(ER1706-41，1∶1 000稀釋)、兔抗phospho-Nrf2(ET1608-28，1∶500稀釋)、兔抗phospho-NQO1(ET1702-50，1∶500稀釋)、兔抗phospho-HO-1(ER1802-73，1∶500稀釋)、小鼠抗phospho-β-肌動蛋白(EM21002，1∶10 000稀釋，HUABIO, 杭州)，在4 ℃ 孵育過夜。次日室溫搖床復溫1 h，用TBST(每升含2.45 g Tris、8.77 g NaCl和20% Tween-20)洗膜后，二抗室溫搖床孵育(HRP標記鼠二抗，1∶10 000 稀釋；HRP標記兔二抗，1∶10 000稀釋)1 h，用TBST洗膜后，用ECL化學發光液(弗德生物)進行顯色。蛋白條帶用Image J軟件進行灰度分析。

表1 引物信息

1.7 肝和血清指標

采集的全血分離出血清，保存于-20 ℃，依據試劑盒說明書測定血清激素指標(Abbott，Lisnamuck, Ireland)，包括谷胱甘肽(glutathione，GSH)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽S-轉移酶(GSH-ST)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和過氧化氫(hydrogen peroxide，HO)。

肝組織與生理鹽水按1∶100混合后充分研磨，3 000 r·min離心15 min，取上清，-20 ℃保存，用于總膽固醇(total cholesterol，TC)的測定。按照試劑盒說明書進行TC的酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定。所用試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.8 數據分析

2 結 果

2.1 不同劑量藥物處理后卵巢質量、卵泡數量和體重的變化

注射10 mg·kgAE后，母雞體重降低了11.54%。同時，LYF、SYF、LWF和SWF數量分別上升了32.00%、34.62%、50.00%和54.21%(圖1)。本文選擇10 mg·kgAE進行后續試驗。

A. 體重；B. 卵巢質量；C. 排卵前卵泡質量；D. 大黃卵泡、小黃卵泡、大白卵泡和小白卵泡數量。字母不同表示有顯著差異，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001A. Body weight; B. Ovarian weight; C. Preovulatory follicle weight; D. Number of large yellow, small yellow, large white and small white follicles. Different letters represent significant differences, *. P<0.05, **.P<0.01, ***.P<0.001圖1 不同劑量AE對衰老蛋雞體重、卵巢質量和卵泡數量的影響Fig.1 Effects of different doses of AE on body weight, ovarian weight and follicle number of aging layers

2.2 AE對抗氧化能力變化的影響

與對照組相比，注射10 mg·kgAE組顯著升高了蛋雞卵泡GSH、T-SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT和GSH-ST水平(分別提高了46.73%、25.08%、9.61%、37.44%、18.90%和31.18%)。并且注射10 mg·kgAE可以使蛋雞卵泡中MDA和HO水平分別降低49.41%和72.58%。另外，注射10 mg·kgAE蛋雞卵泡中E水平升高了34.14%，同時P水平提高6.8倍。注射10 mg·kgAE處理還可以顯著升高肝組織中TG水平(71.52%)。此外，注射10 mg·kgAE處理后D580蛋雞卵泡ERα和ERβ表達量顯著升高(圖2)。

2.3 AE對肝卵黃合成和沉積相關基因表達的影響

采用RT-PCR方法檢測肝卵黃合成和脂肪酸合成相關基因，如圖3所示，注射10 mg·kgAE可以明顯提高蛋雞肝卵黃合成相關基因(、、、、)表達水平，但是基因表達水平明顯下降(<0.05或<0.01)。同時，注射10 mg·kgAE還可以提高卵黃沉積相關基因Ⅱ、Ⅱ、、和表達水平(<0.05或<0.01)。

2.4 D-gal誘導衰老卵泡模型建立

D-gal(0.1、1.0和10.0 mg·mL)體外處理D280蛋雞SWF。培養72 h后，H&E染色結果顯示，對照組SWF形態正常，顆粒細胞排列規則；0.1 mg·mLD-gal處理后，部分顆粒細胞出現排列松散、不規則，卵泡基本維持在原來的形態；1 mg·mLD-gal處理后，大部分顆粒細胞排列松散且不規則，出現核固縮。10 mg·mLD-gal處理后，SWF和顆粒細胞受損嚴重，幾乎所有的顆粒細胞呈現不規則排布，SWF發生凋亡并出現空洞(圖4A)。TUNEL染色顯示，對照組只有極少量的細胞出現凋亡現象，D-gal誘導卵泡組織細胞凋亡呈劑量依賴性增多(圖4A)。Western blot 結果顯示，在D-gal誘導衰老卵泡中，細胞增殖相關蛋白PCNA的表達量顯著下調，同時細胞凋亡相關蛋白Caspase3的表達量顯著上調，這些變化呈D-gal劑量依賴性(圖4B)。

2.5 不同劑量AE對D-gal誘導小白卵泡衰老的保護作用

經不同劑量AE對10 mg·mLD-gal體外誘導衰老保護的D280蛋雞小白卵泡HE染色結果顯示，AE對小白卵泡衰老的保護作用呈劑量依賴性增加后下降。與對照組相比，低劑量AE(5 μg·mL)組，出現輕微好轉，部分顆粒細胞出現排列松散、不規則，卵泡基本維持在原來的形態。在中劑量AE(10 μg·mL)組，生長卵泡形態相對正常，顆粒細胞規則排布。高劑量 AE(20 μg·mL)組，保護效果不如中劑量組，顆粒細胞排列較松散。通過BrdU檢測不同劑量AE對10 mg·mLD-gal體外誘導衰老D280蛋雞SWF細胞凋亡保護的影響，結果顯示，與對照組相比，隨著AE劑量的加大直至10 μg·mL時，小白卵泡中增殖細胞逐漸增多。而20 μg·mL的AE處理后，細胞增殖率反而下降(圖5A)。Western blot結果顯示，在AE保護D-gal誘導衰老卵泡中，細胞增殖相關蛋白PCNA的表達量隨著AE劑量增加至中劑量AE(10 μg·mL)時顯著上調，同時細胞凋亡關蛋白Caspase3的表達量顯著下調，這些變化在高劑量AE(20 μg·mL)時反而不如中劑量組顯著(圖5B)。

A. 抗氧化能力；B. 氧化指標；C. 血清激素水平和肝TG水平；D. ERs表達水平。*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001A. Antioxidant capacity; B. Oxidation index; C. Serum hormone level and liver TG level; D. The expression level of ERs. *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001圖2 AE對衰老蛋雞SWF抗氧化能力和肝三酰甘油合成能力的影響Fig.2 Effects of AE on antioxidant capacity of ovary and triglyceride synthesis of liver in aging laying hens

β-actin 為內參基因，各組數據均為β- actin is an internal reference gene, and the data of each group are the mean±standard error (n=9). *.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001圖3 AE對衰老蛋雞肝卵黃合成和沉積相關基因的影響Fig.3 Effects of AE on genes related to yolk synthesis and deposition in liver of aging laying hens

A. 熒光染色，標尺：20 μm；HE染色，標尺：50 μm；B. 體外培養72 h后280日齡蛋雞小白卵泡組織通過Western blot檢測PCNA和Caspase3表達的變化。不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Immunofluorescence staining, scale bar: 20 μm; HE staining, scale bar: 50 μm; B. The expression of PCNA and Caspase3 in 280-day-old laying hens were detected by Western blot after 72 h culture. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖4 D-gal誘導卵泡衰老模型的建立Fig.4 Establishment of follicular aging model induced by D-gal

A. 熒光染色，標尺：20 μm；HE染色，標尺：50 μm；B. 體外培養72 h后280日齡蛋雞小白卵泡組織通過Western blot檢測PCNA和Caspase3的表達變化。不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Immunofluorescence staining, scale bar: 20 μm; HE staining, scale bar: 50 μm; B. Expression of PCNA and Caspase3 in 280-day-old laying hens were detected by Western blot after 72 h culture. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖5 不同劑量AE對D-gal誘導小白卵泡衰老的保護作用Fig.5 Protective effects of different doses of AE on aging of small white follicles induced by D-gal

2.6 AE對體外培養卵泡氧化應激損傷的緩解作用

選取10 mg·mLD-gal和10 μg·mLAE進行AE緩解卵泡氧化應激損傷對比試驗。HE染色結果顯示，對照組卵泡組織內生長卵泡形態正常，顆粒細胞規則排布。D-gal組SWF和顆粒細胞受損嚴重，幾乎所有的顆粒細胞呈現不規則排布，SWF發生凋亡并出現空洞。而在D-gal+AE組，這一現象得到了緩解，僅有部分顆粒細胞出現排列松散、不規則。AE組生長卵泡形態正常，顆粒細胞規則排布，與對照組相比有促進作用。通過BrdU檢測細胞凋亡或增殖的影響，結果顯示，D-gal組只有極少量細胞增殖現象。在D-gal+AE組，小白卵泡中增殖細胞顯著增多，甚至超過對照組。AE組細胞增殖明顯，超過對照組。說明AE能緩解卵泡氧化應激損傷(圖6A)。Western blot結果顯示，D-gal組PCNA的表達量顯著下調，同時細胞凋亡相關蛋白Caspase3的表達量顯著上調，而在D-gal+AE組這一現象緩解，且AE組與對照組相比有促進作用，細胞增殖相關蛋白PCNA的表達量顯著上調(圖6B)。

A. 熒光染色，標尺：20 μm；HE染色，標尺：50 μm；B. 體外培養72 h后280日齡蛋雞小白卵泡組織通過Western blot檢測PCNA和Caspase3的表達的變化。各組數據均為不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Immunofluorescence staining, scale bar: 20 μm; HE staining, scale bar: 50 μm; B. Expression of PCNA and Caspase3 in 280-day-old laying hens were detected by Western blot after 72 h culture. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖6 AE對卵泡氧化應激損傷的緩解作用Fig.6 Alleviating effect of AE on ovarian oxidative stress damage

2.7 AE對體外培養卵泡抗氧化能力變化的影響

AE處理可以明顯提高蛋雞卵泡體外培養中GSH-Px、T-AOC、GSH、GSH-ST水平，并且AE處理可降低卵泡中MDA和HO水平(圖7)。

2.8 AE對Nrf2/HO-1通路活性及相關基因表達的影響

結果顯示，與對照組相比，D-gal誘導衰老卵泡pNrf2/Nrf2、HO-1和NQO1的表達量顯著下調，AE單獨處理組和D-gal與AE聯合處理組 Nrf2、2和-1的表達水平與對照組無顯著差異(圖8A)。RT-PCR結果顯示，D-gal處理顯著下調2和-1基因的表達水平，同時添加AE處理可有效緩解2和-1基因的表達水平的降低。與對照組相比，單獨使用AE處理能顯著上調-1基因的表達水平，D-gal與AE聯合處理顯著上調2基因的表達水平(圖8B)。對2-1下游幾種抗氧化基因表達水平的檢測結果顯示，與對照組相比，、、和基因的轉錄水平顯著下調，同時添加AE處理不同程度的緩解這些基因轉錄水平的下調；、、和基因在AE單獨處理組以及D-gal和AE聯合處理組SWF中的表達水平顯著高于對照組(圖8B)。D-gal下調SWF中Nrf2/HO-1通路活性，添加AE處理，Nrf2/HO-1通路活性得到有效緩解。

A. 抗氧化能力；B. 氧化指標。各組數據均為不同字母表示差異顯著(P<0.05)A. Antioxidant capacity; B. Oxidation index. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖7 AE對衰老蛋雞體外卵泡抗氧化能力的影響Fig.7 Effect of AE on antioxidant capacity of ovary in aging layers in vitro

為進一步探究AE對D-gal誘導衰老卵泡氧化應激的緩解作用是否通過Nrf2/HO-1信號通路的激活實現，本試驗選取ML385和DMF分別作為Nrf2/HO-1信號通路的阻斷劑和激活劑，檢測激活和抑制Nrf2/HO-1信號通路后，AE是否仍發揮抗氧化應激的作用。Western blot結果顯示，3 μmol·LDMF單獨處理72 h后，SWF中pNrf2/Nrf2和HO-1的表達量顯著高于對照組；與對照組相比，D-gal單獨處理顯著降低HO-1和pNrf2/Nrf2的表達水平；D-gal與DMF聯合處理可使SWF中pNrf2/Nrf2的表達量恢復至對照組水平；D-gal與AE聯合處理組SWF中HO-1的表達量與對照組均無顯著差異(圖9)。單獨使用ML385(6 μmol·L)處理72 h后，SWF中pNrf2/Nrf2和HO-1的表達量顯著高于對照組；與對照組相比，D-gal單獨處理顯著降低pNrf2/Nrf2和HO-1的表達水平；D-gal與DMF聯合處理，使SWF中pNrf2/Nrf2的表達量恢復至對照組水平；D-gal與AE聯合處理組SWF中HO-1的表達量與對照組均無顯著差異(圖9)。

A.Western blot; B.RT-PCR。不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)A.Western blot; B.RT-PCR. Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖8 AE對Nrf2/HO-1通路活性及相關基因表達的影響Fig.8 Effects of AE on Nrf2/HO-1 pathway

不同字母代表有顯著性差異(P<0.05)Different letters indicate significant difference (P<0.05)圖9 Nrf2激活劑和阻斷劑對蘆薈大黃素對D-gal誘導衰老卵泡氧化應激緩解作用的變化Fig.9 Effects of Nrf2 activators and inhibitors on the alleviating effect of AE on oxidative stress on aging follicles induced by D-gal

3 討 論

母雞在達到性成熟后，卵巢中存在大量生長緩慢的直徑在2～6 mm的卵泡以維持產蛋進程，機體每天會篩選出1個直徑6～8 mm卵泡進入快速發育階段。在等級前卵泡中，肝合成大量的卵黃蛋白原(vitellogenin,VTG)和載脂蛋白(apolipoprotein，APO)，經血液循環運送至卵巢，在卵泡中沉積。越來越多的證據表明，隨著年齡的增長，雌性小鼠和人類在卵泡儲備和卵母細胞質量方面都有一定程度的下降。卵巢衰老的主要原因是ROS在卵巢中逐漸積累引起的氧化應激。在衰老過程中，ROS發生積聚，同時，機體內抗氧化物質水平降低，氧化還原水平失衡，最終導致器官功能失常。6和12月齡大鼠小腦組織中SOD、CAT和GSH水平顯著高于18月齡大鼠。卵巢衰老影響了母禽的商業價值。然而，關于蛋雞卵巢衰老引起的卵泡質量下降機制的研究很少。闡明卵巢內卵泡衰老和緩解氧化應激的機制可延長母禽產蛋周期，從而提高產蛋性能。

蛋雞產蛋量在500日齡后急劇下降。因此，了解老化過程中蛋雞產蛋性能下降的機理，能夠采取有效措施緩解卵巢衰老，從而提升母雞的經濟價值。越來越多的證據表明，補充食用抗氧化劑是減輕卵泡氧化應激的有效措施。蘆薈大黃素是一種蒽醌類多酚化合物，存在于一些傳統藥用植物中，如決明子、大黃和何首烏。蘆薈大黃素具有多種藥理作用。蘆薈大黃素可能是大黃和決明子的肝毒性成分之一。作為植物中有效的抗氧化劑之一，蘆薈大黃素被廣泛用于防止氧化應激介導的組織損傷。先前的研究已經證實蘆薈大黃素通過上調p53的表達、刺激p21/WAF1、下調calpain-2(CAPN2)和泛素蛋白連接酶E3A(UBE3A)來促進人肝癌細胞系的抗增殖和凋亡。然而，蘆薈大黃素在蛋雞卵巢衰老，特別是卵泡衰老中的抗氧化作用尚未明確闡明。在本研究中，腹腔注射AE顯著提高了D580蛋雞卵泡中GSH水平、T-SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC活性，且MDA和HO含量顯著降低，這說明AE可以提高衰老蛋雞卵泡抗氧化水平、血清E水平、肝TC水平以及參與蛋黃前體合成的關鍵基因轉錄。

D-gal誘導的卵巢衰老模型顯示，卵巢形態結構異常，顯著下調細胞增殖相關蛋白PCNA的表達量，同時顯著上調細胞凋亡關蛋白Caspase3的表達量。在D-gal誘導衰老模型中，通常伴隨著因抗氧化酶活性降低和氧化產物增多引起的氧化應激。這說明D-gal誘導的衰老模型與氧化應激模型相關，因為抗氧化酶活性降低與氧化劑水平升高之間存在明確的關系。在本研究中，觀察到在D-gal誘導的衰老卵泡中，與對照組相比，GSH、T-AOC 的含量以及T-SOD、CAT和GSH-Px的活性顯著降低，而MDA和HO的水平顯著提高。同時，D-gal誘導衰老組織中，卵泡顆粒細胞出現形態損傷，這些現象在添加AE處理后得到緩解。本研究發現，D-gal誘導卵泡組織細胞凋亡率升高、細胞增殖率降低，同時添加AE處理，顯著緩解這些現象。通過體外試驗研究AE緩解卵泡氧化應激損傷發現，AE能緩解D-gal造成的卵泡結構異常，同時可以使細胞增殖相關蛋白PCNA的表達量顯著上調，細胞凋亡關蛋白Caspase3的表達量顯著下調。

Nrf2是一種氧化還原敏感的轉錄因子，對氧化應激具有細胞保護作用。CAT、SOD和HO-1的表達以及GSH的合成均受Nrf2調節。Nrf2/HO-1途徑的激活誘導小鼠腎中GSH、CAT和SOD水平升高。先前的研究表明，Nrf2表達及其靶基因表現出年齡依賴性下降。在本研究中，作者檢測自然衰老母雞卵泡中相關蛋白和基因的表達，研究了衰老與Nrf2/HO-1通路活性的影響。然后研究了蘆薈大黃素對D-gal誘導的衰老卵泡氧化應激的保護作用。此外，還證實了蘆薈大黃素對自然衰老卵泡氧化應激的潛在抑制作用。本研究表明，衰老過程中卵泡中Nrf2/HO-1通路的活性顯著降低。

Nrf2/HO-1途徑的激活可上調許多抗氧化基因的表達，并減輕組織中的氧化應激。Su等證明，Nrf2誘導HO-1需要轉錄阻遏物BACH1失活。AE對氧化應激的保護作用是通過激活Nrf2/HO-1或AKT/mTOR/MAPK信號途徑實現的。Abdellatef等報道，AE通過上調Nrf2介導的HO-1抑制TNFα誘導的信號通路的激活內皮細胞中的表達。在本研究中，D-gal處理顯著降低了Nrf2、pNrf2、HO-1的表達，同時補充AE緩解了這種下降的趨勢，與對照組相比，單獨使用AE顯著上調了Nrf2、HO-1和pNrf2的表達。為了闡明AE與氧化應激相關的保護作用機制，分別添加Nrf2的激活劑DMF和Nrf2的抑制劑，這些結果表明，AE對衰老卵泡氧化應激的保護作用與DMF相似，而ML385處理消除了AE對衰老卵泡氧化應激的保護作用。

AE提高D580母雞卵黃沉積能力，并通過激活Nrf2/HO-1途徑提高了D580母雞卵泡的體外抗氧化能力，并維持了細胞增殖和凋亡之間的動態平衡。

綜上所述，AE能夠緩解衰老母雞產蛋性能下降，提高蛋雞的經濟效益，為提高家禽的產蛋性能提供理論依據，為禽蛋的高質量生產具有實際意義。同時，采用中藥解決產蛋量下降問題的新思路為日后研究蛋雞的生產性能、禽蛋的產出等開拓了新方法。

4 結 論

AE可以提升血清E水平和卵黃遞質合成中的關鍵基因(Ⅱ、、Ⅱ、、、、、、Ⅰ和)，從而提高蛋黃前體的合成能力。AE通過激活衰老卵泡Nrf2/HO-1信號通路，提高衰老蛋雞卵泡的抗氧化能力，發揮其促進細胞增殖和抑制細胞凋亡的作用，從而延緩蛋雞卵巢衰退。