基于網絡藥理學分析桑葉增強雞抗氧化功能的作用機制

劉魏魏，張宇欣,2，李秀梅，王秀敏，周煒煒，戴小楓*

(1.中國農業科學院飼料研究所 農業農村部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081;2.哈爾濱商業大學藥學院，哈爾濱 150028)

當機體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生與機體清除ROS或修復其造成的損傷之間不能達到平衡時便會出現氧化應激。集約化養殖、飼糧更換與污染、雞舍溫度與通風條件、強制換羽、運輸轉群等多種因素均會引發雞的氧化應激，使雞群受到不同程度的氧化損傷。氧化應激會危害雞的健康，導致采食量下降、新陳代謝失常、免疫力下降，還會引發雞的多種炎癥反應，產生病理損傷，降低雞的生產性能，給養雞生產造成嚴重的經濟損失，及時地給雞補充一些抗氧化生物活性物質可有效預防或修復氧化損傷。

桑葉是一種藥食同源的多功能植物，具有抗炎、抗氧化、降血脂、治療糖尿病和心血管疾病等多種功能。2013年，桑葉被農業農村部列為可飼用天然植物，近年來作為新型飼料資源用于畜禽養殖，不僅能有效緩解我國飼料資源的短缺，其所含的豐富營養物質和生物活性物質還能緩解畜禽的氧化損傷，提高生產性能。多項研究表明，日糧中添加桑葉或桑葉提取物，能顯著提高雞的抗氧化能力。桑葉中含有黃酮類、生物堿類、多糖類和植物甾醇類等多種活性成分。然而，桑葉對雞的抗氧化作用功效的物質基礎及其機制仍不明確。

網絡藥理學以系統生物學理論為指導，整合了生物信息學、多向藥理學、計算機科學等多學科技術，整體性和系統性地研究藥物和疾病間相互作用。將網絡藥理學用于中藥藥效物質和作用機理的研究，與中藥多成分、多靶點、多途徑、系統調控的特點相符，成為中藥研究的新方法。中獸醫學和中醫學同宗同源，有相同的整體觀念。近年來已有少許報道將網絡藥理學用于研究飼用天然植物在畜禽上的作用機理。本研究通過網絡藥理學方法，分析桑葉在雞氧化應激中理論上起作用的功效物質及潛在的關鍵作用靶點，并通過功能和通路富集分析得到桑葉增強雞抗氧化作用的相關信號通路和代謝途徑，為桑葉在雞生產中的應用提供相關啟示。

1 材料與方法

1.1 桑葉活性成分及其靶點的篩選

通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索桑葉的化學成分，篩選條件設置為化合物口服利用度(oral bioavailability, OB)≥30%，類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18。并查閱文獻，補充不符合篩選條件卻是桑葉主要功效成分或已報道的具有抗氧化作用的化合物，作為有效活性成分。進一步通過TCMSP平臺，收集有效活性成分的靶點，其中，綠原酸在TCMSP中無靶點，但有報道稱其是桑葉的主要抗氧化成分之一，因此，通過herb平臺(http://herb.ac.cn/)收集其靶點。通過Uniprot平臺(https://www.uniprot.org/)對收集到的靶點名稱進行標準化校正。利用Cytoscape3.7.2軟件構建桑葉化合物-靶點網絡圖。

1.2 桑葉與雞(抗)氧化蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建

在NCBI數據庫的gene平臺(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)內輸入檢索詞“”和“antioxidant”/“antioxidative”/“antioxidation”/“oxidative stress”/“oxidative”/“oxidation”/“oxidant”，盡量多地收集雞(抗)氧化相關基因，其中，輸入“”和“antioxidative”/“antioxidation”時沒有檢索結果，將其余詞條檢索到的基因整理去除重復，然后與桑葉的化合物相關靶點一起上傳至STRING數據庫(version 11.0, https://string-db.org/)，研究物種選擇為“”，最低互作分值(minimum required interaction score)設置為高可信(high confidence 0.7)，得到桑葉作用于雞(抗)氧化的PPI網絡圖，并將數據導入Cytoscape 3.7.2軟件作進一步分析。

1.3 靶點的GO富集和KEGG通路富集分析

將桑葉作用于雞(抗)氧化的靶點蛋白基因上傳至DAVID數據庫(version6.8，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)，物種選擇為“”，進行GO(gene ontology)功能富集和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析，設置所有偽發現率(false discovery rate，FDR<0.01)，對結果進行篩選分析。

2 結 果

2.1 桑葉活性成分及其靶點篩選

通過TCMSP數據庫檢索桑葉所有化學成分，共269個。通過口服利用度和類藥性的篩選；另外，加上1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)、紫云英苷(astragalin)、異槲皮素(isoquercitrin)、蘆丁(rutin)、綠原酸(chlorogenic acid)這5個化合物，它們雖然不符合篩選條件，但卻是桑葉主要功效成分；最后剔除沒有對應靶點的化學成分，共得到符合條件的化合物30個(表1)，共收集到靶點蛋白221個。利用Cytoscape3.7.2構建桑葉活性化合物-靶點網絡圖，如圖1所示，網絡圖共包含251個節點，550條邊。從化合物方面看，網絡中每個化合物平均與16.8個靶點相連，連接靶點≥10的化合物有13個(表2)。槲皮素(quercetin)的度值最高，能與145個靶點蛋白相互作用，其次為山柰酚(kaempferol)、花生四烯酸(arachidonic acid)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)等(表2)。從靶點角度看，網絡中每個靶點平均與2.3個化合物相連，連接化合物≥10的靶點蛋白有8個(表3)。前列腺素合酶G/H 2(PTGS2)的度值最高，其次為前列腺素合酶G/H 1(PTGS1)、熱休克蛋白90(HSP90AA1)、凝血因子Xa(F7)、過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)等。

表1 桑葉有效活性成分

(轉下頁 Carried forward)

圓圈代表化合物，正方形代表靶點，形狀大小與度值成正比The circles represent compounds and squares represent targets, the shape size is proportional to the degree value圖1 桑葉活性化合物-靶點網絡Fig.1 Compound-target network of Mori Folium

表2 桑葉中度≥10的活性成分

表3 桑葉中度≥10的靶點

2.2 桑葉作用靶點與雞(抗)氧化的PPI網絡構建及分析

在NCBI的gene數據庫中得到與雞(抗)氧化相關的基因共120個，利用STRING數據庫構建桑葉作用于雞(抗)氧化的PPI網絡，去除無相互作用的節點，得到的網絡共有220個節點(氧化相關靶點60個，化合物靶點151個，共同靶點9個)，661條邊(圖2)。根據節點的度值繪制前10個靶點蛋白的條形圖(圖3)，其中白細胞介素6(IL-6)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、表皮生長因子(EGF)、胰島素(INS)、過氧化氫酶(CAT)、胱天蛋白酶3(CASP3)、細胞周期蛋白D1(CCND1)等度值較大。為了更加直觀地顯示桑葉與雞(抗)氧化蛋白的關系，將PPI網絡圖數據導入Cytoscape 3.7.2軟件，分析篩選與雞(抗)氧化直接作用的桑葉化合物靶點蛋白，并構建PPI圖(圖4)。進一步分析可知，桑葉化合物靶點中IL-6、CASP3、CAT、PTGS2、白細胞介素1 beta(IL-1B)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)等可直接作用于雞(抗)氧化蛋白且度值較高，其中PTGS2是桑葉化合物和(抗)氧化的共同靶點。

圖2 桑葉作用于雞(抗)氧化靶點的PPI網絡圖Fig.2 The PPI network of Mori Folium interacting with (anti)oxidant targets in Gallus gallus

圖3 PPI網絡中關鍵靶點的度Fig.3 The degree of key targets in PPI network

正方形代表化合物靶點，圓圈代表雞(抗)氧化相關靶點，三角形代表桑葉化合物和雞(抗)氧化的共同靶點，形狀大小與度值成正比The squares represent the compound targets, the circles represent the chicken (anti)oxidation related targets, and the triangles represent the common targets of Mori Folium compound and chicken (anti)oxidation, the shape size is proportional to the degree value圖4 桑葉中直接作用于雞(抗)氧化的靶點網絡圖Fig.4 The network of Mori Folium directly interacting with (anti)oxidant targets in Gallus gallus

2.3 GO功能分析和KEGG通路分析

用DAVID數據庫對桑葉作用于雞(抗)氧化PPI網絡中的靶點蛋白進行GO功能富集和KEGG通路分析，對GO富集結果中FDR<0.01的條目進行可視化。如圖5所示，其中分子功能(molecular function)有3條，涉及亞鐵紅素結合活性(heme binding)、核染色質結合活性(chromatin binding)、過氧化物酶活性(peroxidase activity)；生物過程(biological process)有7條, 主要涉及炎癥反應(inflammatory response)、氧化應激反應(response to oxidative stress)、細胞氧化還原平衡(cell redox homeostasis)、RNA 聚合酶II啟動子轉錄的正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)等；細胞組成(cellular component)有6條，主要涉及細胞外間隙(extracellular space)、過氧化物酶體(peroxisome)、細胞質基質(cytosol)、線粒體(mitochondrion)等。KEGG 通路分析共得到37條相關通路，表4列出了結果中FDR<0.01的24通路，其中具有代表性的通路有NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路(PPAR signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)、細胞凋亡(Apoptosis)等。

紅色條形表示分子功能，藍色條形表示生物過程，綠色條形表示細胞組成The red bars represent the molecular function, the blue bars represent the biological process, and the green bars represent the cell composition圖5 桑葉對雞(抗)氧化靶點蛋白的GO富集結果Fig.5 GO enrichment results of Mori Folium on chicken (anti)oxidant targets

表4 桑葉對雞(抗)氧化靶點蛋白的KEGG富集結果

3 討 論

桑葉是農業部規定的可飼用天然植物，蛋白含量高，且含有多種生物活性物質，在我國古時就已作為飼料用于桑蠶養殖，近年來作為非常規蛋白飼料越來越多地用于動物生產。在限抗禁抗的政策下，桑葉因含有種類豐富、生物功能多樣的天然活性物質被逐漸開發為功能性飼料添加劑。桑葉在飼用中顯示出良好的抗氧化效果，但其作用機理尚不明確。本研究采用網絡藥理學方法，分析了桑葉的化學成分、靶點與雞氧化應激之間的關系。

通過桑葉作用靶點與雞(抗)氧化的PPI網絡的構建及分析可知，桑葉作用于雞(抗)氧化的關鍵靶點有IL-6、VEGFA、EGF、INS、CAT、CASP3、CCND1、PTGS2、IL-1B和MMP9等。IL-6是一個多效性的細胞因子，既可作為重要的促炎因子參與炎癥反應，又有抗炎作用。研究表明，ROS可以活化核因子κB(NF-κB)進而誘導IL-6的表達。VEGFA屬于血管內皮生長因子家族，可以通過激活核因子E2相關因子2(Nrf2)信號通路保護細胞抵抗氧化應激，并形成正反饋通路增加自身表達量。EGF能減輕炎癥或氧化應激等對腸黏膜上皮細胞的損傷，并能促進黏膜上皮的修復。研究顯示，EGF可以促進斷奶仔豬小腸絨毛的發育以及上皮細胞的分化，保護斷奶仔豬的腸道屏障，提高平均日增重。INS不僅在維持機體的葡萄糖穩態中發揮重要功能，越來越多的研究表明，其在保護細胞和器官免受氧化損傷方面也有重要功能，它可以通過胰島素信號通路調節多種抗氧化酶，還能與抗氧化酶轉錄有關的因子如Nrf2和NF-κB互作，從而抑制ROS的產生并促進清除已有的ROS。CAT是機體內主要的抗氧化酶之一，其經典功能是清除體內的ROS，CAT可將超氧化物歧化酶(SOD)催化生成的過氧化氫轉變成水，維持機體的氧化還原穩態。CAT作為一種新型酶制劑用于動物養殖，具有抗氧化損傷、增強免疫力、抑菌抗炎等多種功能。在飼糧中添加 CAT 能提高肉雞的抗氧化能力，改善生長性能和腸道形態。氧化應激會損傷細胞，促進細胞凋亡，CASP3是細胞凋亡反應的最終效應蛋白之一，研究顯示，低氧會增強人髓核來源間充質干細胞中CASP3的活性，促進細胞凋亡。CCND1調控細胞周期從G0到G1期的轉變，氧化損傷會影響CCND1蛋白的表達，使細胞周期阻滯，促進細胞凋亡。PTGS2又稱環加氧酶2(COX-2)，是一種促炎因子，在介導炎癥反應中有重要作用。ROS會促進炎癥反應，誘導COX-2的產生，有研究表明，腎小球系膜細胞線粒體來源的ROS會激活NF-κB的活性、誘導COX-2 mRNA和其蛋白的表達。IL-1B和IL-6一樣，也是典型的炎癥介質。另一方面，研究顯示IL-1B可以抑制星形膠質細胞氧化損傷中ROS的增加，其機制可能是通過NF-κB信號途徑，增加了星形膠質細胞中谷胱甘肽(GSH)的產生。MMP9屬于基質金屬蛋白酶(MMPs)家族，可降解細胞外基質成分。MMPs的細胞外基質降解活性可被氧化應激和炎癥狀態激活，作為炎癥介質促進炎癥反應。

由桑葉直接作用于雞(抗)氧化的靶點網絡圖可知，IL-6、CASP3、CAT、PTGS2、IL-1B、INS、MMP9是可以直接作用于雞(抗)氧化的桑葉化合物靶點且度值較高，通過桑葉活性化合物-靶點網絡圖將這些靶點對應到相應的桑葉化合物。IL-6和IL-1B對應的桑葉化合物均為蘆丁和槲皮素；CASP3對應槲皮素、蘆丁、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素和花生四烯酸；CAT對應蘆丁；MMP9對應槲皮素；INS對應蘆丁；PTGS2對應槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素和花生四烯酸等21個化合物，體現了中草藥發揮作用時多成分、多靶點的特點。有研究表明，桑葉黃酮能提高動物氧化應激能力，槲皮素是桑葉中主要黃酮類之一，可以抑制DNA氧化損傷而發揮抗氧化作用，還可以增加一些蛋白的表達以消除自由基的損傷。槲皮素在雞生產中已有較多應用，在日糧中添加槲皮素可以提高蛋雞的抗氧化能力，血清總抗氧化能力(T-AOC)、SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均顯著提高，產蛋率顯著提高、料蛋比顯著下降。蘆丁是槲皮素的配糖體，能與自由基結合從而抑制自由基鏈式反應并能提高CAT、SOD等抗氧化酶活性。蘆丁作為一種綠色飼料添加劑用于動物生產，不僅能提高雞的生長性能，對魚類、反芻動物生長性能和產品品質的提升也有促進作用。山柰酚能夠誘導Nrf2-抗氧化反應元件(ARE)通路中ARE的表達，使受Nrf2調控的基因表達量提高，從而促進自由基的清除，并可以和槲皮素、紫檀芪協同作用，增強抗氧化功能。花生四烯酸在水產飼料添加劑中研究較多，是魚類的必需脂肪酸之一，在一定濃度范圍內具有正向生理功能，促進魚的生長、存活和繁殖，提高抗氧化能力。在蛋雞中研發富含花生四烯酸的雞蛋，為人類提供必需的不飽和脂肪酸以預防心腦血管疾病，具有廣闊的市場需求。β-谷甾醇是一種植物甾醇，植物甾醇被用于畜禽、水產養殖，具有抗氧化、調節免疫力、促進動物生長、提升畜產品品質等功能。在肉雞飼糧中添加植物甾醇，其總超氧化物歧化酶活性顯著提高、血清總膽固醇顯著降低。日糧中添加β-谷甾醇可以提高肉雞腸道抗氧化水平，改善腸道形態，提高免疫力。β-胡蘿卜素是維生素A的前體物質，可以抑制脂質氧化并保護細胞的抗氧化系統以減少機體的氧化損傷。β-胡蘿卜素可作為飼料添加劑用于畜禽和水產養殖，用于肉雞可提高其生產性能及抗氧化能力；用于蛋雞不僅能提高蛋雞和雞蛋的抗氧化活性，還能沉積色素，改善蛋黃色澤。

本研究中，GO富集分析表明桑葉的活性成分可在細胞外間隙、過氧化物酶體、細胞質基質、線粒體等細胞的不同部位，通過發揮亞鐵紅素結合活性、核染色質結合活性、過氧化物酶活性等多種生物活性，在炎癥反應、氧化應激反應、細胞氧化還原平衡等不同的生物過程中發揮作用，從而在雞的抗氧化損傷中起作用。同時，KEGG通路富集分析顯示，與桑葉作用于雞氧化應激相關性較大的代謝通路有NOD樣受體信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡等。氧化應激會激活多種轉錄因子，進而引起炎癥信號通路相關基因表達量的變化，導致慢性炎癥。Toll樣受體和NOD樣受體為介導炎癥反應的代表性受體，被激活后均能通過介導經典的NF-κB通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路誘導炎癥因子的釋放。PPARs 屬于類固醇激素受體家族，有PPARα、PPARβ/δ和PPARγ 3種亞型。PPAR可行使多種生物學功能，涉及脂類代謝、脂肪形成、血糖控制、炎癥反應及氧化應激等。研究表明，PPARα對視網膜細胞凋亡和氧化應激有保護作用，部分原因可能是其通過下調低氧誘導因子-1alpha(HIF-1α)/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)信號通路以減輕視網膜細胞的氧化損傷。ROS作為第二信使在正常生理條件下參與多種信號通路的調節，然而在氧化應激中，過量的ROS會造成細胞內生物分子的損傷，引發細胞凋亡。ROS可以促進脂筏參與的信號轉導，激活死亡受體介導的細胞凋亡；還能激活B細胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)超家族的促凋亡蛋白使線粒體外膜的通透性增加，進而導致線粒體釋放凋亡激活劑，觸發細胞凋亡。

4 結 論

綜上所述，桑葉通過多種成分、多個靶點、多條通路協同作用增強雞的抗氧化功能，理論上，其關鍵靶點有IL-6、VEGFA、EGF、INS、CAT、CASP3、CCND1、PTGS2、IL-1B和MMP9等，通過槲皮素、蘆丁、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡蘿卜素和花生四烯酸等關鍵活性成分，NOD樣受體信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡等主要信號通路調控雞的氧化應激。下一步需要對分析得到的成分、靶點、通路進行試驗驗證，為桑葉在雞生產中的開發應用提供理論參考。