過表達非洲豬瘟病毒D1133L蛋白的MA-104細胞系建立及其初步應用

張 婷，楊 博，崔卉梅，袁興國，趙登率，楊金柯，郝 雨，陳學輝，閆文倩，申超超，史喜絹，張大俊，楊 行，劉湘濤，鄭海學，張克山

(中國農業科學院蘭州獸醫研究所，蘭州大學動物醫學與生物安全學院 家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730000)

非洲豬瘟(African swine fever， ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染家豬和野豬引起的一種嚴重的出血性傳染病，ASF的流行傳播對養豬業造成重大的經濟損失，目前沒有商業化的疫苗和抗病毒藥物。ASFV感染豬的靶細胞主要為單核細胞和巨噬細胞，肺泡巨噬細胞(pulmonary macrophages， PAMs)用于ASFV的感染機制和病毒復制動力學的研究。目前，非洲豬瘟活病毒的檢測依賴PAMs，但分離PAMs的過程復雜、耗時。源于非洲綠猴的商業化細胞系MA-104可用于替代PAMs感染ASFV，但其感染ASFV后病毒的復制能力并不高。

ASFV編碼150～167個開放閱讀框，ASFV編碼包括50多種結構蛋白和100多種非結構蛋白，其中，ASFV編碼包括5種解旋酶，分別為D1133L、Qp509L、Q706L、B962L和A859L，在病毒轉錄過程發揮作用，這些基因對病毒復制過程中的轉錄階段發揮重要的功能，其中，1133L基因與牛痘病毒的D6R具有相似的結構域，與病毒轉錄起始階段有關。

目前，常利用慢病毒(lentivirus)構建穩定表達細胞系來研究病毒的功能。如小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus， PPPRV)的結構蛋白N蛋白在Vero細胞系中穩定表達，在BHK細胞系穩定表達藍舌病病毒(bluetongue virus，BTV)的VP6蛋白，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的GP2和N蛋白在MARC-145細胞系上穩定表達，穩定表達基因的BHK-21細胞系的構建及其對新城疫病毒(Newcastle disease virus， NDV)增殖效果的評價等。本實驗室前期已明確了1133L的基因序列分析、蛋白結構預測及亞細胞定位。前期研究提示，ASFV編碼的解旋酶D1133L對于病毒復制十分重要，為進一步研究1133L基因功能，本試驗利用慢病毒系統，構建了過表達D1133L的MA-104細胞，并比較評價了病毒增殖能力。本文通過該方法構建過表達D1133L細胞系來探究此基因對ASFV復制能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與病毒 MA-104細胞由蘭州獸醫研究所口蹄疫流行病實驗室保存，非ASFV CN/GS/2018分離株、缺失MGF360-9L基因(ASFV-G-Δ40)和同時缺失ASFV-110-9L、ASFV-505-7R兩個基因的 (ASFV-G-Δ20-53)重組毒株均由蘭州獸醫研究所非洲豬瘟區域實驗室構建并保存。

1.1.2 試劑和抗體 胎牛血清(FBS)和0.25%EDTA-Trypsin(Gibco)購自偉博鑫生物科技有限公司，青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液(三抗)和PBS緩沖液購于北京索萊寶公司，大腸桿菌Trans5a感受態、LADNA聚合酶、限制性核酸內切酶Ⅰ和Ⅰ、T4 DNA 連接酶、均購于寶生物工程大連有限公司，RPIM1640培養基和高糖DMEM培養基購自購自Thermo Fisher Scientific公司，鼠抗β-actin單克隆抗體和TRizol Reagent購自英濰捷基(上海)貿易有限公司，HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，Goat Anti-Mouse，蛋白marker購自Proteintech公司,Western一抗稀釋液、Western Bright ECL 化學發光底物和硝酸纖維素膜NC膜(0.22 μm)購于碧云天有限公司，預混型定量用反轉錄試劑盒和TB Green染料法標準型定量試劑盒購于上海百賽生物技術股份有限公司。

本研究所用的鼠抗ASFV p30單克隆抗體，兔抗ASFV p72多克隆抗體和鼠抗1133L單克隆抗體由中國農業科學院蘭州獸醫研究所口蹄疫與新發病流行病學團隊提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設計和質粒構建 根據NCBI數據庫中ASFV1133L基因 (ID:59226965)，以慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro進行構建，根據1133L的基因CDS序列和載體的MCS位點，設計特異性PCR primers，設計的引物序列見表1，雙酶切酶為RⅠ和Ⅰ，酶切后重連插入到慢病毒載體 Lv-PCDH 的 MCS 區，命名為pCDH-CMV-D1133L-EF1-CopGFP-T2A-Puro。

表1 D1133L特異性PCR引物序列

1.2.2 ASFV病毒感染 ASFV毒株(MOI=1.5)感染MA-104/D1133L細胞系和野生型MA-104，48 h后收取病毒液。將MA-104/D1133L和MA-104細胞消化后鋪于12孔板中，置于37 ℃、5%CO培養箱中，待細胞融合度至 70%～90%時，用無血清的DMEM 將細胞清洗2次，以去除細胞中殘留的血清；用無血清的DMEM 將ASFV稀釋至適當的濃度，之后將稀釋好的毒液按照適當的體積加入到細胞中，置于37 ℃、5%CO培養箱孵育2 h 之后，棄去毒液，換成 2%FBS DMEM 維持液，繼續培養。

1.2.3 RNA的提取及反轉錄 采用 Trizol 裂解法提取細胞的總 RNA，并反轉錄為 cDNA，用于Real-time qPCR，反轉錄體系 20 μL：4 μL 5×反轉錄酶，6 μL DEPC 水，10 μL模板 RNA。反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

1.2.4 實時定量 PCR(quantitative real-time PCR) 實時熒光定量PCR(Real-time qPCR，RT-qPCR)的反應體系(10 μL)：5 μL SYBR Permix ExⅡ，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，3 μL DEPC 水和1 μL cDNA。反應程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火和延伸 34 s，共 40 個循環，這些基因的相對mRNA水平歸一化為豬mRNA水平，引物序列見表2。以ASFV72基因為靶點進行實時定量PCR，檢測ASFV基因組DNA的拷貝數。采用QIAamp DNA Mini Kits(Qiagen，Germany)提取樣品DNA。ASFV-72-R: 5′-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3′；ASFV-72-F: 5′- GATACCACAAGATCAGCCGT-3；探針: 5′-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3′；5′-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-3，擴增條件：95 ℃預熱30 s， 95 ℃預熱5 s，58 ℃預熱30 s， 循環40次。用標準曲線計算ASFV基因組的數量，并以每微升基因組拷貝數表示。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達 MA-104/D1133L和MA-104細胞以每孔1×10細胞量接種于12孔板，感染ASFV(MOI=1.5)。不同時間點收取細胞裂解蛋白，用PBS洗滌后加入100 μL 1×loading蛋白上樣緩沖液裂解細胞，取20 μL蛋白上樣量進行SDS-PAGE，電泳結束后用100 V恒壓轉印至NC膜1.5 h，用TBST配制5%的脫脂奶粉室溫封閉2.5 h，抗體稀釋液稀釋按照比列稀釋一抗D1133L單克隆抗體(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)、p30(1∶1 000)和p72(1∶1 000)，4 ℃過夜孵育，1×TBST配制HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，Goat Anti-Mouse(1∶10 000)室溫孵育2 h，用Western Bright ECL 化學發光底物全自動化學發光成像分析。

表2 引物序列信息

1.2.6 ASFV病毒滴度測定 參考文獻[19-20]方法來測定ASFV的HAD或TCID，利用ASFV熒光重組毒感染長滿單層MA-104細胞和MA-104/D1133L細胞，36 h后收取，置于-80 ℃病毒反復凍融3次后，收集上清，1 200 r·min離心10 min， 取0.1 mL上清液進行10～10倍梯度稀釋，接種長滿PAM細胞的96孔細胞培養板，測定HAD，每孔加入25 μL的1%豬紅細胞，每個稀釋度接種8個孔，0.1 mL·孔，培養箱中37 ℃培養5～7 d，逐日觀察記錄細胞形成玫瑰花環數，而TCID根據出現的熒光數量并記錄，用Reed-Munch 法計算。

1.2.7 數據分析 用GraphPad Prism 軟件進行統計學分析并作圖，采用獨立樣本檢驗進行顯著性分析，*.<0.05 說明數據間有顯著差異，**.<0.01 說明數據間有極顯著差異。

2 結 果

2.1 MA-104/D1133L細胞系的構建

為構建1133L基因過表達MA-104細胞系，利用慢病毒表達質粒與病毒包裝輔助質粒共轉染MA-104細胞，轉染48 h后。慢病毒Lv-PCDH、Lv-D1133L分別感染MA-104細胞，8 h后終止。加入3 μg·mL的puromycin對各組細胞系進行藥篩培養，48 h后更換培養基并傳代，維持培養，收集各組細胞系，提取各組細胞RNA，進行RT-qPCR驗證，D1133L在該細胞系中能夠高效、穩定表達。經測序后將獲得的過表達D1133L穩定傳代的細胞系命名為MA-104/D1133L。

2.2 MA-104/D1133L細胞系鑒定

利用慢病毒包裝后Lv-PCDH、Lv-D1133L感染D1133L細胞后細胞形態均正常，藥物篩選后能夠正常的傳代培養，將篩選出的陽性克隆細胞系連續傳代15代后，用TRizol法提取細胞中的總RNA，反轉錄為cDNA，用RT-qPCR檢測細胞系中的1133L的基因轉錄水平，Western blot鑒定細胞系中D1133L蛋白是否穩定表達。利用RT-qPCR檢測了D1133L的轉錄水平表達(圖1A)，MA-104/D1133L 細胞系中的D1133L顯著高于野生型MA-104(<0.05)；Western blot結果(圖1B)顯示，細胞系連續傳代15代后仍能穩定表達D1133L蛋白，以上表明該細胞系連續傳代后仍能穩定轉錄和表達D1133L。RT-qPCR試驗結束后，利用核酸電泳技術對RT-qPCR的產物進行檢測，結果如圖2所示：對于1133L基因，MA-104/D1133L細胞系的RT-qPCR擴增產物的條帶與MA-104細胞系相比，差異顯著；對于-基因，兩個細胞系的RT-qPCR擴增產物的條帶基本相當。

2.3 MA-104/D1133L細胞中ASFV基因表達檢測

將MA-104/D1133L和MA-104細胞接種于12孔板，待細胞密度長至70%，ASFV(MOI=1.5)感染兩種細胞，在12、24 h時收取的樣品，利用RT-qPCR測定MA-104/D1133L細胞中30、72/mRNA表達量顯著(<0.001)高于野生型MA-104細胞中30、72/mRNA表達量(圖3A、3B)。即MA-104/D1133L細胞系與野生型MA-104細胞系相比在12、24 h均能促進ASFV30和72基因轉錄水平的表達。同時用Western blot檢測p72蛋白表達，MA-104/D1133L細胞中p72蛋白表達量顯著高于野生型MA-104細胞中p72表達量(圖3C)。同樣ASFV重組熒光毒株感染MA-104和MA-104/D1133L細胞，36 h后收取樣品，檢測p72和p30的表達量，與上述結果一致(圖3D)，MA-104/D1133L細胞系中p30和p72的高于野生型MA-104細胞中。綜上所述，ASFV在MA-104/D1133L細胞中的復制能力強于MA-104。

A. RT-qPCR鑒定D1133L基因轉錄水平；B. Western blot鑒定D1133L蛋白水平。與Mock相比，*.P<0.05A. Identification of D1133L gene transcription level by RT-qPCR; B. Western blot identification of D1133L protein level.Compared with Mock,*.P<0.05圖1 連續傳代至15代，MA-104/D1133L細胞系中D1133L穩定性鑒定Fig.1 Identification of D1133L stability in MA-104/D1133L cell line of successive generations to 15 generations

圖2 MA-104和MA-104/D1133L中RT-qPCR擴增產物的電泳條帶分析Fig.2 Electrophoretic band analysis of RT-QPCR products in MA-104 and MA-104/D1133L

2.4 MA-104/D1133L細胞中ASFV滴度及拷貝數測定

為進一步比較分析不同毒力毒株在MA-104/D1133L細胞中的增殖能力，ASFV強毒株ASFV CN/GS2018毒株和兩種弱毒株ASFV重組熒光缺失毒株，分別為ASFV-G-Δ20-53和ASFV-G-Δ40株，在MA-104/D1133L細胞系和野生型MA-104細胞中的增殖水平，利用 RT-PCR 方法檢測ASFV基因組，即病毒復制拷貝數。用HAD或TCID測定病毒滴度，在豬紅細胞存在的情況下，CD2v蛋白介導ASFV在感染細胞周圍的血液吸附，形成玫瑰花環，使用血液吸附試驗(HAD)計算ASFV CN/GS2018毒株感染細胞后的病毒滴度，由于本試驗構建的重組病毒均含有p72-eGFP啟動子，可替代CD2v基因，用熒光代替花環來統計，因此每個樣品的TCID是根據樣品稀釋后的eGFP熒光測定，統計熒光顯微鏡下熒光數量檢測病毒滴度。

2.4.1 ASFV滴度(HAD/TCID)測定 如圖4A所示，測定了強毒株ASFV CN/GS2018毒株HAD，即強毒株ASFV在MA-104/D1133L細胞系中的病毒滴度HAD(4.75和4.875)顯著高于野生型MA-104細胞系病毒滴度HAD(4.125和4.25)，同時也比較兩種重組弱毒株在MA-104/D1133L細胞系和野生型MA-104細胞上的增殖能力，在雙基因缺失毒株ASFV-G-Δ20-53中病毒滴度TCID，MA-104/D1133L細胞系病毒滴度TCID(3.50和4.00)比野生型MA-104細胞系增殖滴度TCID(2.875和2.875)ASFV的高(圖4B)，在單基因缺失毒株ASFV-G-Δ40中病毒滴度TCID，MA-104/D1133L細胞系病毒滴度TCID(3.25和3.50)比野生型MA-104細胞系增殖滴度TCID(2.625和2.750)ASFV的高(圖4C)。綜上結果表明MA-104/D1133L細胞系病毒增殖能力顯著高于野生型MA-104細胞(<0.05)。

A. ASFV p30的mRNA水平；B. ASFV p72的mRNA水平；C. 感染ASFV CN/GS2018毒株不同時間點ASFV p72蛋白水平；D. 感染ASFV重組毒株36 h后ASFV p30、p72蛋白水平。*. P<0.05；**.P<0.01；***. P<0.001A. ASFV p30 mRNA level; B. ASFV p72 mRNA level; C. different time points of infection with wild strain ASFV p72 protein level; D. AFSV P30 and ASFV p72 protein levels 36 h after infection with recombinant strains.*. P<0.05; * * P<0.01; ***. P<0.001圖3 MA-104、MA-104/D1133L細胞系感染ASFV后p30、p72轉錄和蛋白水平變化Fig.3 Changes in p30 and p72 transcription and protein levels of MA-104 and MA-104 /D1133L cell lines infected with ASFV

2.4.2 ASFV基因拷貝數測定 采用RT-qPCR方法測定不同毒力毒株中病毒復制拷貝數來評估病毒的復制差別。如圖5所示，ASFV CN/GS2018毒株、雙基因重組缺失病毒ASFV-G-Δ20-53和單基因缺失重組病毒復制拷貝數結果表明MA-104/D1133L的細胞系均顯著高于比野生型MA-104病毒拷貝數(<0.05)。綜上表明，ASFV毒株在MA-104/D1133L的復制能力均高于MA-104細胞。

3 討 論

目前，一些商業化的傳代細胞可感染ASFV。ZMAC-4 豬巨噬細胞系可替代PAM細胞研究其復制動力學，MA-104細胞可替代肺泡巨噬細胞檢測ASFV。最新報道也發現ASFV 可以感染HEK293T細胞，但復制效率較低，有趣的是在HEK293T細胞中連續傳代，獲得了RT-qPCR測定MA-104/D1133L細胞中30、72/mRNA表達量顯著(<0.001)高于野生型MA-104細胞中30、72/mRNA表達量(圖3A、3B)。即MA-104/D1133L細胞系與野生型MA-104細胞系相比在12、24 h均能促進ASFV30和72基因轉錄水平的表達。同時用Western blot檢測p72蛋白表達，MA-104/D1133L細胞中p72蛋白表達量顯著高于野生型MA-104細胞中p72表達量(圖3C)。同樣ASFV重組熒光毒株感染MA-104和MA-104/D1133L細胞，36 h后收取樣品，檢測p72和p30的表達量，與上述結果一致(圖3D)，MA-104/D1133L細胞系中p30和p72的高于野生型MA-104細胞中。綜上所述，ASFV在MA-104/D1133L細胞中的復制能力強于MA-104。

A. ASFV CN/GS2018毒株 (WT) HAD50測定；B. ASFV-G-Δ20-53重組毒株TCID50測定；C. ASFV-G-Δ40重組毒TCID50測定A. ASFV CN/GS2018 HAD50 assay; B. TCID50 assay of ASFV-G-Δ20-53; C. TCID50 determination of ASFV-G-Δ40圖4 不同ASFV毒株感染MA-104、MA-104/D1133L細胞后病毒滴度測定Fig.4 Titer determination of different ASFV strain infected MA-104 and MA-104/ D1133L cells

A. ASFV CN/GS2018毒株 (WT) 病毒拷貝數；B. ASFV-G-Δ20-53重組毒株病毒拷貝數；C. ASFV-G-Δ40重組毒株病毒拷貝數A. CN/GS 2018 virulent strain (WT) virus copies number; B. Copies number of ASFV-G-Δ20-53 recombinant virus; C. Copies number of ASFV-G-Δ40 recombinant virus圖5 評估不同毒株感染MA-104、MA-104/D1133L細胞系的病毒拷貝數Fig.5 Evaluation of the copies number of different virus strains infected MA-104 and MA-104/D1133L cell lines

ASFV編碼1133L基因與病毒復制相關，其對病毒復制具有重要作用。利用D1133L蛋白解旋酶基序的特性，探究D1133L在病毒復制中發揮的作用是具有重要意義。本試驗構建穩定表達D1133L的MA-104/D1133L細胞系，評估了ASFV CN/GS2018分離株和ASFV基因缺失重組毒株在MA-104/D1133L細胞系的病毒復制水平和增殖能力，通過RT-qPCR和Western blot技術檢測了MA-104、MA-104/D1133L細胞系感染ASFV后，早期蛋白p30和晚期蛋白p72轉錄和蛋白水平之間的差異，測定病毒滴度HAD或TCID和病毒拷貝數在兩種細胞中ASFV的增殖水平和病毒復制，從數據可知ASFV在MA-104/D1133L細胞增殖能力高于MA-104。綜上所述，ASFV感染該細胞系后病毒增殖能力高于野生型MA-104，過表達D1133L蛋白能進一步促進ASFV復制。

4 結 論

D1133L在ASFV復制過程中扮演重要角色，本試驗通過慢病毒表達系統，成功構建過表達D1133L的MA-104/D1133L細胞系，不同毒力的ASFV毒株感染此細胞系，ASFV增殖能力強于野生型MA-104，本研究構建的D1133L過表達MA-104細胞系為研究1133L基因功能及針對該基因有效藥物的開發積累了生物材料。