氧化應激通過Fas/FasL信號通路調控奶牛子宮內膜細胞凋亡

靳 青，張相倫，魏 晨，劉桂芬，劉曉牧，張冬梅，譚秀文*

(1.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，濟南 250100；2.鄒城市畜牧業發展中心，濟寧 273500)

胚胎早期死亡及流產給奶牛繁殖率和產奶量帶來嚴重影響，造成極大的經濟損失。關于奶牛的早期胚胎死亡很早就有報道，Ulberg等發現，輸精后60～90 d約有40%胚胎死亡。Sreenan和Diskin對25年文獻中奶牛胚胎死亡進行分期評估，發現受精卵估測為90%，平均產犢率為55%，表明胚胎死亡率為35%；從受精到妊娠第8天胚胎損失很少，胚胎死亡明顯增加是發生在授精后的第8～16天之間(27%～31%)。進入21世紀后，盡管在奶牛養殖中采用更科學的方法和手段，但大量文獻證實妊娠損失仍主要發生在輸精后8～17 d，尤其在高密度集約化養殖場中，這種情況更加明顯。這一時期正好處于早期胚胎向子宮內膜附植之前或附植過程中，即囊胚滋養層細胞與母體子宮內膜細胞之間逐步建立組織和生理上聯系的過程。以往研究表明，子宮內膜的生理狀態對妊娠的建立和維持至關重要。因此，有必要探討奶牛養殖中影響子宮內膜生理狀態的可能機制。

奶牛養殖中應激的發生幾乎不可避免，各種應激狀況都會造成大量氧自由基(reactive oxygen species, ROS)產生，導致氧化應激。研究發現，氧化應激與子宮內膜細胞凋亡密切相關。Hoelker等和Hailemariam等發現，患子宮內膜炎的奶牛其子宮內膜炎癥反應的信號通路與凋亡基因網絡、生物功能等方面交互在一起。Piras等利用脂多糖(LPS)處理奶牛子宮內膜細胞72 h后進行差異蛋白組學分析，發現LPS組28個蛋白表達上調，10個蛋白表達下調，這38個差異表達蛋白與細胞凋亡、氧化應激密切相關，其中部分差異表達蛋白參與胚胎附植過程中激活的通路。然而迄今為止，氧化應激如何調控奶牛子宮內膜細胞凋亡并未見報道，因此有必要進行深入研究。

近年來研究發現，死亡受體Fas在細胞凋亡信號通路中起關鍵性作用。Fas又稱APO-1或CD95，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞質區含有一段由80個氨基酸殘基構成的、6個反向平行的α-螺旋形成的高度保守序列，稱為死亡區(DD)，該區域對于凋亡信號的傳導具有重要作用。配體是FasL又稱CD95L，屬于Ⅱ型跨膜蛋白，可被金屬蛋白酶裂解形成可溶性形式。Fas通過與三聚化的FasL結合而被激活，激活的Fas可通過其DD結合并聚集銜接蛋白Fas相關死亡結構域，導致FADD(Fas-associated death-domain)構象改變，此時的FADD可通過其自身的死亡效應結構域與具備同源結構的Caspase 8，形成由FasL、Fas、FADD、Caspase 8組成的死亡誘導復合物(death inducing signaling complex，DISC)，該復合物具有裂解并激活凋亡蛋白酶Caspase 3的能力，引發細胞凋亡過程的級聯反應，導致細胞凋亡。

因此，本研究利用HO構建奶牛子宮內膜細胞氧化應激損傷模型，在此基礎上，探討氧化應激通過Fas/FasL信號通路影響子宮內膜細胞凋亡的可能作用機制，旨在為解決生產中奶牛早期胚胎流產難題提供理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12培養基、0.25%Trypsin-EDTA購自Gibco公司；胎牛血清FBS、三抗混合液購自Biological Industries公司；血清白蛋白BSA、HO購自Sigma公司；Annexin V凋亡試劑盒、SOD試劑盒、CAT試劑盒、2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)試劑盒、總谷胱甘肽含量(GSX)試劑盒、氧化型谷胱甘肽(GSSG)試劑盒、細胞周期試劑盒購自碧云天生物公司；引物購自濟南鉑尚生物公司；FasL酶標試劑盒購自Scientific公司；TRIzon Reagent購自康為世紀公司；Hiscript ⅡQ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)、Cham QTM SYBR Color qPCR MasterMix購自南京諾唯贊公司。

1.1.2 主要儀器 倒置相差顯微鏡(Nikon)、流氏細胞儀(BD)、高速冷凍離心機(Eppendorf)、酶標儀(伯騰)、CO細胞培養箱(Thermo)、熒光定量PCR儀(Roche)、化學發光凝膠成像系統(Invitrogen)。

1.2 方法

1.2.1 奶牛子宮內膜細胞培養和處理 奶牛子宮內膜細胞系(BEND)購自上海冠導生物工程有限公司，取自美國拉勒米懷俄明州發情第14天的荷斯坦奶牛子宮內膜。按照常規方法將復蘇的細胞放入完全培養液(含10%胎牛血清、1%三抗的DMEM/F12培養液)中，置于38.5 ℃、100%濕度、5% CO的培養箱內培養。待細胞貼壁至80%～90%時用0.25%胰酶(含0.05% EDTA)消化，加入完全培養液調整細胞密度為1×10個·mL。根據不同試驗目的，分別接種到6孔培養板或T25培養瓶中，置于38 ℃、5% CO、飽和濕度的培養箱內培養。待細胞貼壁80%～90%時，分別用100、200、300 μmol·LHO處理6 h，對照組為未添加HO組。

1.2.2 細胞內ROS檢測 用PBS漂洗細胞，加入0.25%胰酶消化3～5 min，待細胞脫落下來后加入含10% FBS的培養液終止消化， 300×、5 min離心，棄掉上清液；加入5 μmol·LDCF-DA輕輕吹打混勻，置于38 ℃、5% CO、飽和濕度的培養箱內培養30 min；用PBS離心洗滌兩次，流式細胞儀上機檢測。

1.2.3 SOD和CAT活性檢測 用PBS漂洗細胞后，消化、離心收集細胞，加入蛋白裂解液超聲波作用5 min, 4 ℃、12 000×離心10 min收集上清液；按照SOD和CAT試劑盒說明書要求進行活性檢測；采用BCA蛋白質檢測試劑盒測定平行樣品蛋白濃度；樣品酶活即為樣品總的酶活性與蛋白濃度的比值，以“單位·mgprotein”表示。

1.2.4 GSH和GSSG檢測 用PBS漂洗細胞后，消化、離心收集細胞，加入蛋白裂解液超聲波作用5 min, 4 ℃、12 000×離心10 min收集上清液；按照GSX和GSSG說明書要求，分別檢測GSX和GSSG含量；采用BCA蛋白質檢測試劑盒測定平行樣品蛋白濃度；樣品中GSH含量為GSX與GSSG的差值；樣品GSX、GSSG、GSH濃度即為每個指標總含量與蛋白濃度比值。

1.2.5 細胞周期檢測 用PBS漂洗細胞后，消化、離心收集細胞，加入70%冷乙醇4 ℃固定30 min；離心收集細胞并用冷PBS于300×、5 min離心洗滌兩次；棄掉上清液收集細胞沉淀，于含PI、Triton X-100和RNaseA的PBS液中4 ℃孵育1 h；流式細胞儀上機檢測。

1.2.6 細胞凋亡檢測 待測細胞培養板用PBS液洗兩次，加入胰酶37 ℃消化5 min，待大部分細胞脫落時加入含10% FBS的細胞培養液輕輕吹打，收集細胞懸液到1.5 mL離心管中，300×離心5 min， 去掉上清液，加入195 μL緩沖液輕輕重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC并輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，再加入10 μL PI染液輕輕混勻，室溫避光孵育5 min，流式細胞儀上機檢測。

1.2.7 FasL含量檢測 參考張辰等的方法，在酶標板孔中分別加入100 μL標準品或待測樣品，然后每孔加入100 μL酶結合物工作液，37 ℃避光孵育60 min，洗板5次；每孔加入100 μL生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min，洗板5次；加入100 μL顯色底物，37 ℃避光孵育15 min；最后加入100 μL終止液，酶標儀測定450 nm處吸光度，經空白校準后繪制標準曲線并計算每個樣品的蛋白濃度。

1.2.8 熒光定量RT-PCR 1)引物設計：利用Primer 5.0軟件設計PCR引物(表1)。2)Real-time PCR：利用試劑盒進行細胞總RNA提取，并通過A260∶A280比值和瓊脂糖電泳檢測RNA純度和完整性。采用試劑盒進行cDNA合成，-20 ℃保存備用。Real-time PCR采用20 μL反應體系：SYBR Premix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddHO 6 μL；擴增條件為：95 ℃預變性30 s； 95 ℃變性10 s，60 ℃ 30 s，反應40個循環；95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。設置內參-表達量作為參照，采用2法計算mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物序列參數

1.2.9 Western blot 參考張辰等的方法，細胞用預冷的PBS洗兩次，加入蛋白裂解液反復吹打，收集裂解液4 ℃高速離心吸取上清液；將所有樣品的總蛋白濃度調節至1 mg·mL；向樣品離心管中加入緩沖液，混勻后置于水中煮沸5 min，使蛋白質變性；制備5%濃縮膠和12%分離膠，將蛋白樣品加入點樣孔中，濃縮膠和分離膠電泳電壓分別為90 和120 V；70V電壓下轉膜30 min；將PVDF膜取出置于含3%BSA的TBST中室溫封閉1 h；取出將PVDF膜置于一抗中4 ℃過夜，TBST洗膜；將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液室溫孵育2 h，TBST洗膜；取出PVDF膜，加入化學發光液室溫避光孵育2 min，使用凝膠成像系統拍照并進行灰度分析，計算蛋白相對表達量。

1.2.10基因RNAi 設計干擾Fas基因的shRNA序列(GAT CCG GAA CGA GTA CAC AGA CAA GAT TCA AGA GAT CTT GTC TGT GTA CTC GTT CCT TTT TTA)，并使用亂碼序列作為陰性對照。將子宮內膜細胞以1×10個·mL接種于6孔培養板，置于38 ℃、5% CO、飽和適度的培養箱內培養12～16 h，直至貼壁約30%～40%；加入shRNA-Fas-慢病毒(Lv-shFas)或 shRNA-control-慢病毒(Lv-shCon)感染24 h；棄掉含病毒的培養液，更換新鮮培養液繼續培養48 h；200 μmol·LHO處理細胞6 h， 收集細胞用于細胞凋亡和蛋白檢測。試驗分為4組，分別為：HO和慢病毒未處理組(A組)、HO處理慢病毒未處理組(B組)、HO和Lv-shCon慢病毒處理組(C組)、HO和Lv-shFas慢病毒處理組(D組)。

1.3 數據分析

所有試驗都重復3次以上。試驗數據采用SPSS19.0統計軟件的ANOVA模塊進行分析，數據先經LSD轉換后進行單因素方差分析，<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 不同濃度H2O2對子宮內膜細胞氧化損傷的影響

不同濃度HO處理子宮內膜細胞6 h，利用流式細胞儀、酶標儀分別進行細胞內ROS水平、抗氧化酶SOD和CAT活性以及非酶性抗氧化物質GSH/GSSG比值檢測。結果(圖1)表明， 100 和200 μmol·LHO處理組中ROS熒光探針強度都顯著高于對照組(<0.05)，然而當HO處理濃度達到300 μmol·L時，流式細胞儀檢測到大量細胞碎片，說明已有部分細胞出現碎裂。SOD、CAT酶活性以及GSH/GSSG比值都以HO濃度依賴性降低。上述結果表明，200 μmol·LHO處理子宮內膜細胞6 h構建氧化應激模型。

A. ROS陽性細胞比例；B. SOD酶活性；C. CAT酶活性；D. GSH水平；E. GSSG水平；F. GSH/GSSG比值A. Percentage of ROS positive cells；B. SOD activity；C. CAT activity；D. Levels of GSH；E. Levels of GSSG；F. Ratio of GSH/GSSG圖1 不同濃度H2O2對子宮內膜細胞氧化損傷的影響Fig.1 Effects of different concentrations of H2O2 on oxidative damage of endometrial cells

2.2 氧化應激對子宮內膜細胞生長周期和凋亡的影響

選擇200 μmol·LHO處理子宮內膜細胞6 h，分別進行生長周期和凋亡檢測。結果(圖2)表明，與對照組相比，200 μmol·LHO處理組顯著提高細胞凋亡比例(<0.05)和降低細胞處于S期比例(<0.05)。

A．細胞周期中S期比例；B. 細胞凋亡比例A. Percentage of S phase in cell cycle distribution；B. Percentage of cell apoptosis圖2 氧化應激對子宮內膜細胞生長周期和凋亡的影響Fig.2 Effects of oxidative stress on cell cycle and apoptosis of endometrial cells

2.3 氧化應激對Fas/FasL凋亡通路關鍵基因表達的影響

選擇200 μmol·LHO處理子宮內膜細胞6 h，利用qRT-PCR和Western Blot分別檢測Fas/FasL凋亡通路關鍵基因的mRNA和蛋白表達。結果(圖3)表明，與對照組相比，200 μmol·LHO處理組顯著提高、8、3基因的mRNA表達水平(<0.05)；培養液中FasL濃度以及Fas、Caspase 8、Caspase 3基因的蛋白表達水平也都顯著升高(<0.05)。

2.4 Fas干擾對細胞凋亡及Fas/FasL通路關鍵基因表達的影響

為進一步驗證Fas/FasL通路參與氧化應激誘導子宮內膜細胞凋亡，利用慢病毒對Fas基因進行RNA干擾，結果(圖4)發現，細胞Fas干擾后再經HO處理6 h，細胞凋亡率顯著低于HO處理組，培養液中FasL 濃度以及Fas、Caspase 8、Caspase 3蛋白表達水平也顯著降低。以上結果說明，Fas/FasL凋亡通路參與氧化應激誘導的子宮內膜細胞凋亡。

3 討 論

研究發現，異常高的氧化應激會在細胞內產生大量的氧化中間體(如ROS)，這些中間體是高活性自由基，其是否蓄積取決于氧化和抗氧化系統之間的平衡。如果細胞內氧化還原平衡被破壞，導致脂質、蛋白質和核酸發生氧化，造成細胞死亡。SOD和CAT是針對超氧自由基抗氧化防御的關鍵酶，它們在與氧化應激抗性相關的疾病中活性降低。GSH是一種非酶促抗氧化細胞因子，在ROS清除和活性物質淬滅中起重要作用。本研究選擇200 μmol·LHO作為氧化劑處理子宮內膜細胞6 h，發現細胞內大量ROS蓄積，SOD和CAT活性顯著降低，以及GSH的抗氧化系統受到嚴重破壞。說明子宮內膜細胞在此處理條件下受到氧化損傷，造成氧化應激。這與Toka?等、Mathachan等、Zhao等報道一致。然而，Harris和Denicola報道，當化學、物理或生物因素引起細胞應激的狀態下，ROS水平升高超出正常范圍，激活SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的表達和活性，清除過量的ROS，恢復細胞的ROS穩態。由此推測，這可能由于當細胞所受的應激強度較小或時間較短，抗氧化系統足以抵抗ROS的負面影響；而當細胞長期處于高濃度HO刺激時，抗氧化系統遭到破壞，導致SOD和CAT的活性都降低。

圖3 Fas/FasL凋亡通路關鍵基因的mRNA和蛋白表達水平Fig.3 Levels of mRNA and protein expression of key genes in Fas/FasL apoptosis pathway

A. H2O2和慢病毒未處理組；B. H2O2處理、慢病毒未處理組；C. H2O2和Lv-shCon慢病毒處理組；D. H2O2和Lv-shFas慢病毒處理組A. Neither treated with H2O2 or lentiviruse；B. H2O2 treated and lentiviruse untreated；C. Infected with Lv-shCon prior to treatment with H2O2；D. Infected with Lv-shFas prior to treatment with H2O2圖4 Fas基因RNAi對細胞凋亡及Fas/FasL凋亡通路關鍵基因的影響Fig.4 Effects of RNAi of Fas gene on apoptosis and protein expression of key genes in Fas/FasL apoptosis pathway

研究表明，氧化應激通過誘導細胞凋亡嚴重影響機體組織或器官的功能。ROS在氧化應激誘導的細胞凋亡中起重要作用，可以很容易地攻擊生物分子，最終導致細胞凋亡或壞死。本研究表明，200 μmol·LHO處理子宮內膜細胞6 h， 凋亡細胞比例顯著升高。以前研究表明，生理或病理性凋亡刺激對細胞周期進程有影響。因此，本研究有必要對細胞周期進行檢測。結果發現，HO處理降低子宮內膜細胞S期比例，進而抑制細胞增殖。由此我們推斷：氧化應激可能通過影響細胞周期進程，進而誘導子宮內膜細胞凋亡。

近年來研究發現，Fas/FasL信號通路是細胞和組織中非常重要的凋亡途徑。Fas在正常哺乳動物胸腺、心、肝、肺、睪丸和其他組織，而FasL存在于大網膜、睪丸、胎盤和其他器官中。Fas是細胞凋亡級聯反應最重要的上游信號分子，FasL可以作為膜分子或作為哺乳動物細胞表面的可溶性分子存在。Fas與FasL結合并伴隨著FADD的募集，引發下游的Caspase 8激活，隨后形成死亡誘導信號復合物 (DISC)進而激活Caspase 3，最終導致細胞凋亡。已有研究證明，在人卵巢顆粒細胞、成牙骨質細胞、小鼠腸上皮細胞中，氧化應激通過Fas/FasL通路誘導細胞凋亡。本研究發現，氧化應激提高奶牛子宮內膜細胞Fas、FasL的mRNA和蛋白表達水平，說明Fas/FasL信號通路被激活；隨后Caspase 8表達水平升高，這是Fas介導的Caspase依賴性細胞凋亡途徑的重要組成部分，然后募集到下游Caspase 3并誘導細胞凋亡。基因表達抑制后，在一定程度上降低HO誘導的細胞凋亡比例以及Fas/FasL通路凋亡相關基因表達，進一步說明Fas/FasL信號通路參與氧化應激誘導的子宮內膜細胞凋亡。

4 結 論

本研究結果表明，氧化應激通過激活Fas/FasL信號通路促進奶牛子宮內膜細胞凋亡，這為解釋氧化應激對子宮內膜細胞的不利影響提供了新的見解。