SRSF10對山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響

劉珂含，王 永，李艷艷，王重洋，朱江江，熊 燕，李 安，林亞秋*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041； 2.青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部/四川省重點實驗室，成都 610041)

肉質(zhì)性狀是動物的重要經(jīng)濟性狀，肌內(nèi)脂肪(IMF)含量又是影響肉質(zhì)性狀的關(guān)鍵因素，脂肪含量過低會導致肉風味的下降。基于此，畜牧工作者對動物IMF形成的分子調(diào)控網(wǎng)絡尤為關(guān)注。脂肪細胞分化過程包括多潛能干細胞-前體脂肪細胞-脂肪細胞，其中前體脂肪細胞具有體積小、呈梭形、間質(zhì)少、胞漿內(nèi)不含脂滴的特點，且在體內(nèi)和體外都可以在多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下激活脂肪組織相關(guān)基因，并在這些基因的順序性調(diào)控下，經(jīng)一系列復雜步驟分化為成熟脂肪細胞，此過程伴隨著胞漿內(nèi)脂滴聚集。前體脂肪細胞分化是脂肪細胞脂質(zhì)蓄積的過程，是影響動物肌內(nèi)脂肪沉積的重要途徑之一，此生物學過程涉及諸多激素分泌和基因表達的相互調(diào)控，例如過氧化物酶體增殖物激活受體(proxisome proliferator-activated receptors， PPARs)、CCAAT 增強子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBPs)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白異形體1(sterol regulatory element binding protein isoform 1，SREBP1)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)和前脂肪細胞因子1(preadipocyte factor-1，Pref-1)等。由于肌內(nèi)脂肪細胞分散在肌肉組織中，肌內(nèi)脂肪的沉積不僅取決于肌內(nèi)脂肪細胞的分化和增殖，而且還受肌肉生長率及其代謝活動的影響，因此肌內(nèi)脂肪細胞與其他脂肪細胞相比具有特殊的增殖和分化模式。最近研究發(fā)現(xiàn)，可變剪接(alternative splicing, AS)在脂肪細胞分化中發(fā)揮著重要作用，闡明關(guān)鍵的可變剪接因子對脂肪細胞分化的調(diào)控作用及構(gòu)建動物肌內(nèi)脂肪細胞分化的分子機制具有重要的理論與實際意義。

含絲氨酸/精氨酸剪接因子(serine/arginine-rich splicing factor 10,SRSF10)也稱為SRp38，是一種非典型富含絲氨酸/精氨酸剪接因子(serine/arginine-rich splicing factor,SRSF)，作為基因表達調(diào)控機制的可變剪接體在生物體內(nèi)普遍存在。研究發(fā)現(xiàn)，10作為可變剪接因子在mRNA可變剪接調(diào)控和葡萄糖、脂肪、膽固醇等代謝過程皆有重要作用，即作為序列特異性剪接因子與外顯子剪接增強子結(jié)合、參與器官發(fā)育和癌細胞轉(zhuǎn)化等。Li等研究發(fā)現(xiàn)，10缺陷的小鼠白色脂肪組織發(fā)育嚴重受損，進一步研究發(fā)現(xiàn)，10可通過抑制lipin1α的產(chǎn)生促進脂肪細胞分化，為脂肪細胞分化所必需。但尚未見在山羊等家畜中的研究報道。

本實驗室前期通過高通量測序發(fā)現(xiàn)，10是山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化前后的上調(diào)因子，推測其可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本研究旨在明確山羊10基因的生物學特性及揭示山羊10在肌內(nèi)脂肪細胞分化中的調(diào)控作用，為進一步闡明10基因的生物學功能以及完善山羊肌內(nèi)脂肪沉積過程中的分子調(diào)控網(wǎng)絡提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品采集 供試動物是3只1周歲簡州大耳公羊(四川省簡陽大哥大牧業(yè)有限公司)，3只 公羊生理狀態(tài)良好、飼養(yǎng)條件為舍飼圈養(yǎng)。合理屠宰試驗動物，將肝組織剪成小塊，焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡清洗，無菌錫箔紙包裹，最后分裝到冷凍管中并做好標記放于液氮罐中保存。本試驗中所用的山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞來自于本實驗室前期凍存的7日齡羔羊的前體脂肪細胞。

1.1.2 主要試劑 轉(zhuǎn)染試劑(Lipo-fectamineRNAIMAX Reagent)購自Invitrogen；2ⅹGC-Rich PCR Mix酶、007VS連接試劑盒、感受態(tài)細胞DH5α購自TSINGKE；限制性內(nèi)切酶(d Ⅲ、Ⅰ)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)購自Thermo Fisher Scientific；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Tiangen；TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒、動物RNA提取試劑購自TaKaRa；焦碳酸二乙酯、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、油酸購自Sigma；雙抗、PBS、胰蛋白酶購自Hyclone。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 液氮中研磨肝組織，向1.5 mL EP管中加入適量研磨產(chǎn)物，按Trizol法提取RNA并利用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2 山羊10基因克隆 通過NCBI和Primer Primer5.0軟件查找山羊10的預測序列(Gene ID：102179247)并設計特異性引物(表1)。以山羊肝組織為模板，應用RT-PCR技術(shù)和10 g·L瓊脂糖凝膠電泳進行克隆和產(chǎn)物檢測。在膠圖中找出正確條帶，利用DNA回收試劑盒進行回收，將回收到的基因片段在金屬浴中連接至pClone007 Versatile Simple Vector載體，冰上溶解DH5α感受態(tài)細胞后，水浴熱激再轉(zhuǎn)化，隨后接種到已凝固的含有抗生素AMP和LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)箱過夜，將形狀良好的分散菌落挑取至LB液體培養(yǎng)基中，待菌液渾濁進行菌液PCR檢測并測序。對所獲得的山羊10基因序列進行生物信息學分析，生物信息學分析內(nèi)容及相應分析工具見表2。

1.2.3 山羊10基因時序表達譜的構(gòu)建 設計1對特異性引物用于qPCR檢測，以作為內(nèi)參基因矯正基因的相對表達水平(表1)，檢測10基因在山羊肌內(nèi)脂肪細胞誘導分化過程中0～120 h每間隔12 h的表達水平。

1.2.4 山羊10過表達載體構(gòu)建和干擾序列合成 根據(jù)山羊10基因CDS區(qū)553 bp的序列和pcDNA3.1載體，利用BioXM2.6找出適宜的酶切位點(d Ⅲ、Ⅰ)，并設計亞克隆引物(表1)。利用d Ⅲ 和Ⅰ對pcDNA3.1載體和亞克隆獲得的完整山羊10基因 CDS 區(qū)序列進行雙酶切。雙酶切體系：pcDNA3.1：d Ⅲ、Ⅰ 各1 μL，相應Buffer 2 μL，ddHO 補至20 μL； 目的片段：d Ⅲ 和Ⅰ各1 μL，Buffer 2 μL， ddHO 補至20 μL；37 ℃金屬浴30 min。利用實驗室試劑盒進行純化，T4酶連接純化產(chǎn)物，隨后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，接種、挑菌及測序方法同“1.2.2”，最后使用限制性內(nèi)切酶d Ⅲ 和Ⅰ對重組的pcDNA3.1-10質(zhì)粒進行酶切后電泳，即雙酶切鑒定。山羊siRNA序列和Negative control序列由廣州吉賽生物科技股份有限公司合成，見表3。siRNA經(jīng)12 000 r·min離心10 min，并溶解于125 μL DEPC水，最終濃度為20 μmol·L。

1.2.5 山羊肌內(nèi)脂肪細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 37 ℃水浴解凍本實驗室凍存的山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞，將細胞接種于裝有雙抗及10 mL· L胎牛血清的DEME/F-12培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，待F3代細胞生長至80%時，將細胞接種至12和24孔板中，每孔細胞生長至80%時轉(zhuǎn)染。山羊10過表達組設置pcDNA 3.1-10組和pcDNA3.1陰性對照組。按轉(zhuǎn)染試劑的說明書配制預混液，即pcDNA 3.1-10質(zhì)粒1 μg，轉(zhuǎn)染試劑4 μL及200 mL的無血清培養(yǎng)基，輕微震蕩混勻后，室溫孵育15 min。將孵育好的預混液均勻滴加到細胞中，振蕩混勻并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，使用油酸誘導細胞分化，2 d后利用TRizol收集12孔板的細胞，提取細胞RNA后反轉(zhuǎn)錄，將cDNA置于-20 ℃冰箱保存。山羊10干擾組設置siSRSF10-1、siSRSF10-2和Negative control(陰性對照組)，轉(zhuǎn)染方法同過表達組。

1.2.6 油紅O染色和Bodipy染色 用于染色的細胞接種于24孔板，處理方式同“1.2.5”。10 mL·L甲醛固定誘導2 d的細胞30 min，在固定細胞前后各用PBS緩沖液清洗，油紅O染色：利用適量油紅O工作液染色30 min，PBS洗去油紅O工作液，使用顯微鏡觀察脂滴情況并拍照，拍照結(jié)束后，每孔加入1 mL異丙醇溶解油紅O，混合均勻后迅速放于酶標儀中檢測吸光度(OD)。Bodipy染色：向1 mL PBS中加入1 μL Bodipy染料配置成Bodipy工作液，每孔加入200 μL，避光染色20 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 qPCR檢測過表達和干擾效率及脂肪細胞分化標志基因的表達 以“1.2.5”中得到的cDNA作為模板，利用qPCR檢測山羊10過表達和干擾的轉(zhuǎn)染效率以及脂肪細胞分化標志基因的表達差異，以基因作為內(nèi)參基因。qPCR引物信息見表1。

表1 引物信息

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 以與作為內(nèi)參基因，采用2法對qPCR數(shù)據(jù)進行分析。使用SPSS 20.0軟件中的One-way ANOVA方法分析數(shù)據(jù)差異顯著性，Duncan法對時序數(shù)據(jù)進行多重比較，使用GraphPad Prism5.0繪制表達譜，參照Duncan 法分析結(jié)果對數(shù)據(jù)進行差異顯著性標記。

2 結(jié) 果

2.1 山羊SRSF10基因克隆

RT-PCR擴增獲得10基因的目的條帶(圖1A)。分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10基因由1 026 bp 的核苷酸序列組成，其中包括CDS區(qū)552 bp， 5′UTR序列99 bp，3′UTR序列398 bp，共編碼183個氨基酸(圖1B)。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫得到山羊10基因的GenBank登錄號為MZ055377。

表2 分析內(nèi)容及相應分析工具

表3 山羊SRSF10基因的siRNA序列

2.2 SRSF10的生物信息學分析

2.2.1 基本理化性質(zhì)分析 在線網(wǎng)站(表2)預測山羊SRSF10 蛋白的基本理化性質(zhì)，預測結(jié)果見表4。

2.2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 Conserved Domains預測發(fā)現(xiàn)SRSF10具有超家族RRMSF結(jié)構(gòu)(圖2A)。根據(jù)ExPASy預測SRSF10二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其包含了α螺旋(Hh)、延伸鏈(Ee)、β轉(zhuǎn)角(Tt)及無規(guī)卷曲(Cc)4種結(jié)構(gòu)，組成這些結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)及占比分別為42(23.50%)、25(13.66%)、12(6.56%)及103(56.28%)(圖2B)；利用SWISS-MODEL預測SRSF10三級結(jié)構(gòu)，獲得由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲四者交替出現(xiàn)的結(jié)構(gòu)圖，結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預測一致(圖2C)；使用STRING對SRSF10進行蛋白互作分析并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)，結(jié)果顯示，SRSF10可能與SRSF1、SRSF4、SFPQ、RBM24、RBM25、MBNL1和PHGDH等蛋白存在互作關(guān)系(圖2D)。

2.3 山羊SRSF10基因時序表達譜的構(gòu)建

山羊10基因在誘導分化的0～120 h肌內(nèi)脂肪細胞中均存在表達，且在誘導分化96 h后表達水平最高，極顯著高于未誘導分化之前表達水平(<0.01，圖3)。

2.4 山羊SRSF10對肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響

2.4.1 基因過表達載體構(gòu)建 瓊脂糖凝膠電泳圖中出現(xiàn)兩條符合pcDNA3.1(5 427 bp)和10(553 bp)長度的條帶(圖4)，測序結(jié)果與預期一致，即過表達載體構(gòu)建成功。

2.4.210的過表達和干擾效率檢測 qPCR檢測結(jié)果顯示，過表達10基因后的表達效率約為對照組的119.87倍(<0.01，圖5A)；干擾10(siSRSF10-1和siSRSF10-2)后其相對表達量均極顯著低于對照組(<0.01)，干擾效率分別為80.60%和67.03%(圖6A)。

A.山羊SRSF10基因擴增：M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1.SRSF10。B.山羊SRSF10基因核苷酸及推測的氨基酸序列：ATG為起始密碼子；*.終止密碼子；星形為蘇氨酸(Thr)磷酸化位點；圓形為絲氨酸(Ser)磷酸化位點；陰影框為功能結(jié)構(gòu)域A.Amplification of SRSF10 gene in Capra hircus: M.DL2000 DNA Marker; 1. SRSF10 gene. B.The nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of SRSF10 in goat: ATG is the start codon; *. The stop codon; The phosphorylation site of threonine(Thr)is star; Circles are the phosphorylation site of serine(Ser); The shadow box is functional domain圖1 山羊 SRSF10 基因克隆Fig.1 Cloning of SRSF10 in goat

表4 SRSF10基本理化性質(zhì)

2.4.3 形態(tài)學觀察 觀察油紅O和Bodipy染色發(fā)現(xiàn)，OESRSF10組熒光增多、脂滴積累增加(圖5C)；利用異丙醇提取并檢測兩組細胞，發(fā)現(xiàn)OESRSF10組與Negative Control組的OD值變化顯著(圖5B，<0.05)；干擾10后的結(jié)果與之相反(圖6B-C)。

A.SRSF10蛋白生物學功能的預測；B.山羊SRSF10蛋白二級結(jié)構(gòu)預測；C.山羊SRSF10蛋白三級結(jié)構(gòu)；D.山羊SRSF10蛋白互作分析A.Prediction of biological function of SRSF10 protein; B.Prediction of SRSF10 protein secondary structure in goats; C.Prediction of goat SRSF10 protein tertiary structure; D.Interaction analysis of SRSF10 protein in goat圖2 山羊 SRSF10蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structural analysis of goat SRSF10 protein

不同小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)Different lowercase letters indicate extremely significant difference(P<0.01)圖3 SRSF10基因在山羊肌內(nèi)前體脂肪細胞分化過程中的相對表達水平Fig.3 Relative expression level of SRSF10 during the differentiation of intramuscular preadipocytes in goat

2.5 過表達與干擾山羊SRSF10對脂肪細胞分化標志基因表達的影響

過表達山羊10后，脂肪細胞分化標志基因1、和基因的表達水平呈極顯著上升(<0.01)；1和表達量極顯著降低(<0.01)；相對表達水平顯著降低(<0.05，圖7A)；而干擾10后，分化標志基因表現(xiàn)為極顯著下調(diào)趨勢(<0.01，圖7B)。

1.pcDNA3.1-SRSF10；2.DNA Marker圖4 pcDNA3.1-SRSF10雙酶切鑒定Fig.4 Double digestion identification of pcDNA3.1-SRSF10

3 討 論

可變剪接作為一種調(diào)控基因表達的機制在動物脂肪細胞分化中也備受重視，研究發(fā)現(xiàn)與脂肪細胞分化有關(guān)的可變剪接因子有過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、脂肪與肥胖相關(guān)蛋白(FTO)和鋅指蛋白638(zinc finger protein 638, ZNF638)等。10作為本實驗室前期篩選出的山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化前后的差異因子，也屬于可變剪接因子。研究發(fā)現(xiàn)，可變剪接可通過調(diào)節(jié)動物脂肪代謝和甘油三酯代謝等生物學過程來影響豬、牛和雞等動物的肉質(zhì)。為了明確基因10對肌內(nèi)脂肪細胞分化的調(diào)控作用，本試驗通過RT-PCR克隆得到10基因，通過分析發(fā)現(xiàn)山羊10基因具有6個磷酸化位點和12個O-糖基化位點，這些位點有助于細胞轉(zhuǎn)錄和蛋白分子生物活性的表達，從而促進10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。此外，本試驗還發(fā)現(xiàn)山羊10具有RRM_SF超家族結(jié)構(gòu)，RRM結(jié)構(gòu)是SRs十二個成員(SRSF1-12)共有的一個結(jié)構(gòu)特征，存在于N端，具有附屬結(jié)構(gòu)域SR。RRM結(jié)構(gòu)域可以識別RNA并確定RNA與10的綁定特異性，而附屬結(jié)構(gòu)域SR則介導磷酸化調(diào)節(jié)的多種蛋白-蛋白互作和蛋白-RNA互作。

A.SRSF10基因過表達效率，**為P<0.01，下同；B.油紅O染色檢測OD490 nm值，*為P<0.05，下同；C.油紅O(上圖)和Bodipy染色(下圖)分析(200×)A.The overexpression efficiency of SRSF10 gene,**.P<0.01， the same as below; B.The OD490 nm value detected by Oil red O staining,*.P<0.05， the same as below; C.Oil red O(up figure)and Bodipy staining analysis(down figure)(200×)圖5 過表達山羊SRSF10對肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響Fig.5 The effect of SRSF10 overexpression on differentiation of intramuscular preadipocyte in goat

A.SRSF10基因干擾效率；B.油紅O染色檢測OD490 nm值；C.油紅O(上圖)和Bodipy染色(下圖)分析(100×)A.The interference efficiency of SRSF10 gene; B.The OD490 nm value detected by Oil red O staining; C.Oil red O(up figure)and Bodipy staining analysis(down figure)(100×)圖6 干擾山羊SRSF10對肌內(nèi)前體脂肪細胞分化的影響Fig.6 The effect of SRSF10 interference on differentiation of intramuscular preadipocyte in goat

圖7 脂肪細胞分化標志基因表達水平Fig.7 Expression levels of adipocyte differentiation marker genes

本試驗進一步檢測了10在山羊肌內(nèi)脂肪細胞分化0～120 h的表達情況，發(fā)現(xiàn)在分化過程中均存在表達，且在誘導分化的96 h表達水平達到峰值，顯著高于未分化前體脂肪細胞中的表達水平。為了最終闡明山羊10基因?qū)?nèi)脂肪細胞分化的調(diào)控作用，本試驗利用過表達和干擾手段對其進行深入研究，油紅O染色和Bobipy染色結(jié)果均顯示，過表達10基因顯著促進山羊肌內(nèi)脂肪細胞的脂滴積聚，干擾10基因后脂滴積聚明顯減少，這與Li等在小鼠中的研究結(jié)果類似。為進一步闡明其作用方式及分子機制，對過表達和干擾10后山羊脂肪細胞分化標志基因變化進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，過表達和干擾10后，脂肪細胞分化標志基因1、和發(fā)生了相應的變化。和被認為是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子，1同為脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子，且為正調(diào)節(jié)脂肪細胞分化因子。然而研究發(fā)現(xiàn)，作為脂肪細胞分化標志基因的負調(diào)控因子1和正調(diào)控因子沒有發(fā)生相應的變化，有研究顯示在3T3-L1細胞中增加1的表達量可抑制和的表達，本試驗中出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是因為干擾時存在一種負反饋機制降低了1表達水平，具體作用機制需進一步研究。是脂肪生成早期的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪細胞分化過程中可激活和基因的表達，本試驗過表達山羊10時發(fā)現(xiàn)該基因表達水平下降，原因可能為三者之間存在負反饋機制。綜合過表達和干擾結(jié)果，山羊10基因可能通過上調(diào)1、和的表達，從而促進了脂肪細胞分化。但完全闡明山羊10調(diào)控肌內(nèi)脂肪細胞分化的分子機制仍需進一步利用高通量測序、雙熒光素酶報告系統(tǒng)等試驗進行詮釋。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到山羊10基因序列1 026 bp(GenBank登錄號為MZ055377)。山羊10在肌內(nèi)脂肪細胞誘導分化0～120 h均存在表達，在誘導分化96 h表達量達到峰值，顯著高于未誘導分化的前體脂肪細胞的表達水平。過表達和干擾山羊10基因分別會促進和抑制肌內(nèi)脂肪細胞脂滴積聚，并且這種作用可能是通過調(diào)控、和1的表達來實現(xiàn)的。