畜禽消化道細菌群體感應及相關調控技術研究進展

郭海康，萬發春，沈維軍，王 祚

(湖南農業大學動物科學技術學院，長沙 410128)

群體感應(quorum sensing，QS)是微生物中的一種通訊系統，通過交換被稱為自誘導分子(autoinducer，AI)的化學信號分子來完成。在QS作用下，自誘導分子隨著細菌數量的增加而積聚，并將自誘導分子釋放到外環境中。當自誘導分子的濃度達到一定程度時，該細菌群體的一些特定基因便可以表達(圖1)。Fuqua等于1994年在其研究中首次提出了群體感應這一概念，此后便被廣泛采用。QS系統在微生物許多生命活動中發揮重要作用，如微生物發酵、生物膜生長發育以及耐藥性的產生等。但是由于各種自誘導分子的組成、功能以及不同QS系統間的關系十分復雜，目前只對少數幾種模式細菌有系統性研究，對于畜禽消化道細菌QS的研究更是少見。有鑒于此，本文綜述了近年來國內外關于畜禽消化道細菌QS的研究進展，并總結了細菌QS對于畜禽消化道菌群與畜禽的作用及其相關調控，以期為利用細菌QS系統提高畜禽生產水平提供理論參考。

圖1 細菌群體感應系統示意圖[3]Fig.1 Schematic of bacterial quorum sensing system[3]

1 細菌QS的種類及其作用層次

1.1 細菌QS的種類

根據細菌分泌信號分子的不同，主要分為幾類：1)酰基高絲氨酸內酯類信號分子(acyl-homoserine lactone，AHL)，多數存在于革蘭陰性菌QS系統。AHL是由細菌細胞中LuxI 型酶合成，在濃度達到適度閾值后激活LuxR蛋白，從而調控相關基因的表達。AHL的作用范圍主要包括：生物熒光的產生、質粒DNA轉移、毒力基因的表達、生物膜的形成等。2)被稱作自誘導肽的寡肽類分子(autoinducing peptides，AIP)，由革蘭陽性菌QS系統分泌，通過細胞膜上的ABC轉運系統(ATP binding cassette)運輸到胞外，再被雙組分磷酸蛋白激酶識別，激活體內RNAⅢ的轉錄，進而誘導致病因子表達。其功能包括促進毒力基因表達、產生抗微生物復合物等。3)呋喃糖基硼酸二酯(furanosyl-borate-diester)類化合物信號分子，也稱自體誘導物2(autoinducer-2，AI-2)，革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均可分泌，由細菌細胞中LuxS型酶合成其前體物質4，5-二羥基-2，3-戊二酮(DPD)，進一步修飾生成AI-2，可參與細菌種內和種間的信號交流。

1.2 細菌QS的作用層次

QS相應的作用層次主要分為細胞內QS全細胞調控機制、不同模式的種內細菌QS調控機制以及種間的QS調控機制3個層次。1)已完成的基因組分析表明，多數細菌的QS系統是以一種全細胞水平的方式來調控基因表達的。2)細菌種內的QS調控機制又分為平行型模式的QS調控、順序型模式的QS調控、競爭型模式的QS調控，以及開-閉型模式的QS調控等。在細胞間的交流中，不同信號結構體系中提供信息傳遞、檢測、轉譯和應答過程可以作為用于區別其他類型的唯一特性。3)種間的QS調控機制，也稱“合作-欺騙”生態關系。欺騙指的是細菌個體從公共池中獲取其他個體分泌的公共物質，享受QS利益的行為；合作指的是細菌個體通過相互交流，分泌能被群體中任意個體使用的公共物質。

2 細菌QS在畜禽消化道中的研究進展

由于消化道結構、生理特性以及消化道菌群組成等各方面的不同，目前，豬和家禽消化道中細菌QS的研究發現主要集中于QS在大腸桿菌、產氣莢膜梭菌、空腸梭菌等致病性細菌的發病機制中所發揮的作用，而反芻動物瘤胃中細菌QS的報道則多與QS在瘤胃細菌粗纖維降解與微生物蛋白合成等生理活動中的作用有關。

2.1 在豬消化道中的研究

Zhu等研究發現，腸毒性大腸埃希桿菌(Enterotoxigenic，ETEC)菌株JG280所誘導的豬小腸上皮IPEC-J2細胞死亡具有細菌細胞密度依賴性，其隨后的研究結果表明，JG280的AI-2信號分子所介導的QS參與了ETEC的發病機制。劉云研究表明，AHL類信號分子3OC12-HSL對仔豬IPEC-J2細胞形態具有明顯影響。其進一步研究表明，3OC12-HSL在細菌黏附、侵襲宿主細胞過程中起著重要作用，影響了病原菌和宿主細胞間的互作，從而引起IPEC-J2形態的改變。Yang等從豬腸道內容物中首次分離出AHL陽性菌，并將其命名為嗜水氣假單胞菌YZ2(YZ2)，通過構建來自YZ2的(編碼產生AHL類信號分子)同源基因的大腸桿菌表達載體，進一步研究證明AHL能夠在大腸桿菌中誘導QS相關致病基因(包含、、等)表達。最新的研究表明，3OC12-HSL還會通過抑制仔豬IPEC-J2細胞的跨膜運輸功能并影響精氨酸和脯氨酸的代謝而降低IPEC-J2細胞活力，從而對低出生體重仔豬的腸道健康產生不利影響。

2.2 在家禽消化道中的研究

相對于豬和反芻動物，針對家禽消化道中細菌QS的相關研究及報道較少。Novak和Fratamico研究發現，能夠引起雞壞死性腸炎(necrotic enteritis，NE)的產氣莢膜梭菌可以產生種間信號分子AI-2，且QS信號分子類似物會抑制其活性。據報道，從雞消化道中分離出的產氣莢膜梭菌含有Agr型和Lux型QS，這兩種類型的QS在NE的發病機制中均起著重要作用。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic，APEC)中也存在QS，并且缺失基因的APEC突變株DDE17的毒力、運動能力等都有所下降，證實了AI-2介導的QS在APEC導致家禽患大腸桿菌病中起著重要作用。研究發現，缺失基因的空腸彎曲菌突變體生物膜形成會受到抑制，其運動能力以及在雞消化道中的定植能力也會降低。進一步研究表明，抑制雞消化道中空腸梭菌QS能夠減少糞便中的空腸梭菌數量，從而控制其在環境中的傳播。

2.3 在反芻動物消化道中的研究

反芻動物的瘤胃是一種特殊的天然發酵罐，其中棲息著諸多種類的微生物，這些微生物具有降解纖維素、合成菌體蛋白和維生素等多種作用，對反芻動物的生產性能及健康產生重要影響，因而細菌QS在反芻動物消化道中的研究發現多集中于瘤胃細菌。Erickson等最早發現奶牛瘤胃液中的細菌可以產生AHL，但并未在所有試驗奶牛的瘤胃液中檢測到AHL，推測產生AHL的細菌可能并非維持瘤胃正常發酵所必需的菌群。Mitsumori等在溶纖維丁酸弧菌、瘤胃真桿菌、黃色瘤胃球菌和溶淀粉琥珀酸單胞菌的培養液中均檢測到了AI-2類信號分子，同時在奶牛瘤胃液中檢測到了基因(編碼產生AI-2類信號分子)的同源物，表明瘤胃中存在由AI-2介導的QS系統。Ran等于不同采樣時間均未在山羊瘤胃內容物及體外發酵的瘤胃液中檢測到AHLs和AI-2活性，但在體內和體外的瘤胃液里克隆到了瘤胃普雷沃菌()的同源物。研究者推測可能是由于飼養條件與檢測技術的限制，導致AHLs和AI-2未被檢出。然而基因同源物的發現表明山羊瘤胃微生物仍然可能存在AI-2介導的QS。至今已證實黃色瘤胃球菌、牛瘤胃鏈球菌等瘤胃微生物存在多種AI介導的QS，但是由于瘤胃微生物種類多、數量大，仍需進一步研究瘤胃中究竟哪些微生物存在QS、存在哪種AI介導的QS，以及QS是如何調控這些微生物的。

綜上所述，針對畜禽消化道中細菌QS的研究起步較晚，近年來，對于畜禽消化道中細菌QS的研究逐漸發展和深入。然而，還存在很多需要探索的問題，例如在不同種類動物中是否存在不同的作用機制，以及不同細菌種類在同種類動物中的作用及其機制等。以上問題均需要通過進一步的深入研究證實。

3 QS對畜禽消化和免疫功能的影響

3.1 QS對畜禽消化功能的影響

已有的相關研究報道表明，細菌QS存在于畜禽消化道菌群中，并且其可能通過調控消化道細菌生理代謝活動進而對宿主消化功能產生影響。冉濤和譚支良的報道表明，反芻動物瘤胃微生物中的溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌等細菌存在多種AI信號分子介導的QS，具有調節瘤胃細菌運動、定植和生物膜形成等功能，并且這些細菌在瘤胃發酵過程中對降解纖維素、半纖維素和木質素等有重要作用，推測QS在瘤胃厭氧發酵過程中也起著重要作用。有研究表明，在14月齡草原紅牛日糧中添加參照橡樹皮提取物成分制成的QS抑制劑(quorum sensing inhibitor，QSI，成分：松柏醇50%，3,4,5-三甲氧基苯酚20%，丙基間苯二酚15.5%，香草醛5.9%，氧雜茶鄰酮5.3%，東莨菪素3.3%)可提高瘤胃中揮發性脂肪酸(volatile fatty acids，VFA)濃度以及促進菌體蛋白合成，表明QSI可能通過抑制消化道某些細菌QS功能而提高了消化率，據此可以推測被此QSI所抑制的細菌QS會對草原紅牛消化功能產生不利影響。Patra等研究發現，反芻動物以甲烷形式所損失的能量占飼料總能的2%～15%，而瘤胃產甲烷菌主要利用VFA和氫氣生成甲烷。由于QS能夠對產甲烷菌細胞形態、生物膜生成及瘤胃菌群增殖產生影響，其可能在瘤胃中細菌與甲烷菌的互作中發揮作用，因此如果對這一作用機制開展深入研究，有望為提高飼料利用率及減少甲烷排放尋找到一條新途徑。目前，QS對豬和家禽消化的影響的相關報道極少，但是QS對乳酸菌、沙門菌、大腸桿菌等消化道細菌生物膜形成、毒力因子表達等有重要作用，進而對消化道中菌群組成和結構、pH等產生影響，因此推測QS會對豬和家禽的消化功能同樣發揮作用。

綜上所述，畜禽消化道菌群中存在QS，也可以推測消化道細菌QS會對畜禽消化功能產生影響，但是QS影響消化道細菌具體作用機制以及對畜禽消化功能的作用仍需進一步探索和明確。而如何利用細菌QS對于畜禽消化道菌群的作用機制對畜禽消化功能實現有效調控，將會是今后研究的一系列熱點。

3.2 QS對畜禽免疫功能的影響

QS可以通過促進或抑制細菌毒力因子基因表達影響細菌的代謝、運動、毒素分泌等，進而影響畜禽免疫功能。Gart等的研究報道，沙門菌Ⅱ型QS系統可以介導鞭毛基因(C和)和毒力島SPI-1(編碼細菌毒力基因簇的染色體片段)相關毒力因子(、、和)的表達，影響沙門菌對宿主細胞的黏附和侵襲，進而引發宿主體液和細胞免疫應答。Moreira等研究證實沙門菌Ⅲ型QS系統中的、基因在沙門菌毒力基因(、和)的表達中發揮重要作用，影響沙門菌的毒力和運動性，進而影響沙門菌侵染畜禽腸道黏膜上皮、破壞腸道屏障及誘導炎癥反應的能力。研究表明，金黃色葡萄球菌QS輔助基因調節系統(accessorygene regulator，Agr)中的轉錄單位RNAⅢ通過反義堿基配對機制和轉錄抑制蛋白Rot影響基因表達，可調控α-溶血素、PSMα及PSMβ等多種毒素的釋放，從而具有影響宿主白細胞、血小板等的裂解以及抑制吞噬細胞的吞噬功能等一系列作用。QS具有影響細菌毒力因子中內毒素、外毒素的分泌，進而調節畜禽免疫功能的作用。細菌毒力因子中的內毒素可誘導機體巨噬細胞產生腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-6(IL-6)，還會引起血小板減少、骨髓反應和過敏反應等一系列免疫反應。此外，細菌分泌的外毒素能破壞宿主細胞、干擾免疫反應，如α-溶血素可以裂解白細胞、血小板、上皮細胞等。

QS除了通過促進或抑制細菌毒力因子表達，也能通過調控短鏈脂肪酸生成的方式影響機體免疫功能。由于反芻動物瘤胃中的白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌等能夠將木質纖維素降解生成乙酸、丙酸、丁酸等，QS能夠調控這些細菌的代謝、運動以及增殖等生理活動，從而影響乙酸、丁酸等短鏈脂肪酸調節消化道菌群、保護腸道黏膜屏障、抗炎抗腫瘤等作用。此外，研究報道產丁酸的梭菌屬、梭桿菌屬等菌屬中均有受QS調控的菌種，推測QS也能通過調控產丁酸菌的生理活動影響丁酸的生成進而調節畜禽免疫功能，但仍需進一步驗證。

綜上，細菌QS可能通過影響細菌毒力因子表達、短鏈脂肪酸生成等方式影響畜禽免疫活動。然而迄今只對消化道中極個別致病性細菌QS有較為全面的研究，接下來應深入探究畜禽消化道中常見及優勢細菌的QS通過調控毒力因子、短鏈脂肪酸等途徑進而影響畜禽免疫功能的具體機制或模式。

4 畜禽消化道細菌QS相關調控

4.1 細菌QS的相應調控手段

干擾和破壞QS的過程稱作群體淬滅(quorum quenching，QQ)，可以減少或消除細菌間的“交流”，阻礙致病菌致病因子表達，從而抵御致病菌感染。相較于使用抗生素滅菌或抑菌，QQ不會影響細菌的生存和生長，并且只針對某一類靶細菌的QS，能夠特異性抑制致病菌的致病性，而不是采用全部消殺的方式，不易造成選擇壓力和耐藥性。有鑒于此，QQ作為一種新型的、有效的病害防控方法，具有良好的應用前景。

QS需要先后經由信號分子分泌、識別以及信號—受體復合體形成3個主要步驟而產生作用(圖2)，因此QQ可以通過破壞或抑制以上3個步驟中的任意一個而實現。即可以通過降低QS信號分子調節基因的表達來抑制信號分子生成，或使用信號分子降解酶降解、破壞信號分子，或使用信號分子類似物、信號受體抑制劑等阻止信號分子與相應的受體蛋白結合。

圖2 群體感應作用機理Fig.2 Mechanism of action of Quorum sensing

4.2 畜禽消化道細菌QS相關調控研究

如今已經發現諸多能夠淬滅細菌QS的物質，但僅有少量應用于畜禽，尤其是暫未發現QS信號分子類似物應用于畜禽消化道細菌的報道。因此，使細菌QS相關調控的研究應用于畜禽生產將成為重點。以下分別是通過抑制QS信號分子生成、傳遞來淬滅畜禽消化道細菌QS的研究成果。

4.2.1 抑制信號分子生成 細菌生長過程當中會產生多種QS信號分子，并不斷分泌到周圍環境中，達到“信息交流”的目的。生成QS信號分子需要底物、各種酶以及多種調節基因共同作用，譬如革蘭陰性菌QS中LuxI蛋白能夠催化-腺苷蛋氨酸(-adenosyl methionine，SAM)上的高絲氨酸與載體蛋白酰基側鏈結合，進而形成信號分子 AHL；AI-2的生成則是-腺苷同型半胱氨酸(-adenosyl homocysteine，SAH)在核苷酶Pfs的作用下分解為腺嘌呤和-核糖基同型半胱氨酸(LuxS)，接著LuxS反應產生AI-2的前體物質4，5-二羥基-2，3-戊二酮(DPD)；因而可以通過破壞底物、抑制酶活性和調節基因的表達阻礙信號分子產生。通過總結相關報道發現，眾多天然植物活性成分能夠抑制QS信號分子生成(表1)。除天然植物活性成分外，發現一些化合物也具有抑制QS信號分子生成的作用。Dong等研究表明，三氯生(triclosan)能夠阻止酰基載體蛋白被還原，起到抑制信號分子AHL生成的作用。Alfaro等合成了三氫核糖基-L-同型半胱氨酸和-高核糖基-L-半胱氨酸兩種LuxS的底物類似物，均能夠降低LuxS活性進而抑制信號分子AI-2生成。隨著研究的不斷深入，將會有更多的天然或人工合成化合物用于抑制QS信號分子生成。

4.2.2 破壞信號分子，抑制其傳遞 通過破壞QS信號分子，抑制其傳遞，進而干擾細菌通訊途徑能夠達到群體淬滅的目的。例如，-酰基高絲氨酸內酯酶可水解QS信號分子酰基高絲氨酸內酯的內酯環，從而破壞其作為信號分子的功能。但是水解產物-酰基高絲氨酸在酸性介質中能夠重新環化成-酰基高絲氨酸內酯，因而-酰基高絲氨酸內酯酶的淬滅作用是可逆的。淬滅酶在動物試驗中已經得到應用，張廣民等曾在肉雞飼料及斷奶仔豬日糧中添加500 g·t-乙酰基高絲氨酸內酯酶。結果顯示，不同日齡的肉雞淬滅酶組和對照組相比料肉比有明顯降低，日增重和飼料轉化率有一定提高；斷奶仔豬生產性能顯著改善，腹瀉率得到降低。也有研究結果表明，在日糧中添加-酰基高絲氨酸內酯酶能夠改善綿羊瘤胃發酵，提高日糧營養利用效率和干物質表觀消化率。Kim等研究發現，日糧中添加嗜酸乳桿菌30SC能夠提高仔豬消化道中乳酸桿菌相對豐度，減少大腸桿菌的數量，有效改善仔豬的生長性能和免疫狀態。其相關研究表明，30SC細胞提取物可以深度抑制腸出血性大腸桿菌O157:17(ETEC)中AI-2信號分子活性，但30SC益生菌細胞提取物破壞或降解AI-2信號分子的過程仍需進一步研究。

4.3 淬滅畜禽消化道細菌QS的其他方法

目前暫未發現信號分子類似物(可抑制信號分子與受體蛋白結合)以及受體抑制劑作用于畜禽消化道細菌的報道，但已有諸多關于運用信號分子類似物和受體抑制劑淬滅QS的研究。Mcinnis等設計合成的多種硫代內酯類信號分子類似物對LuxI/LuxR型QS系統有影響。其中，六個碳短酰基尾的OHHL硫內酯類似物對LuxR受體具有抑制作用。Brackman等合成了一系列酰胺鍵被三唑環取代的AHL類似物，發現其均能抑制銅綠假單胞菌的LuxR型QS系統。Sully等發現了一種小分子抑制劑——savirin，它能夠抑制受體蛋白AgrA活性，從而干擾金黃色葡萄球菌中agr介導的QS。Paczkowski等研究表明，對銅綠假單胞菌進行類黃酮處理，可改變QS調控靶標啟動子的轉錄，抑制毒力因子的產生，這是由于黃酮類化合物通過拮抗信號分子的結合受體LasR和RhlR而特異性地抑制QS。O’Loughlin等利用重組大腸桿菌菌株測定間溴硫代內酯(meta-bromo-thiolactone, mBTL)對LasR和RhlR兩種受體的影響，結果表明，mBTL能夠部分抑制兩種受體，但只在一定濃度范圍才能發揮效力。Kalaiarasan等在mCTL與mBTL上引入更多氫鍵，設計合成了-(4-(4-氟苯胺)丁酰)-L-高絲氨酸內酯(FABHL)和-(4-(4-氯苯胺)丁酰)-L-高絲氨酸內酯(CABHL)，FABHL和CABHL均能通過干擾QS抑制生物膜形成，且CABHL能夠顯著下調和基因的表達。

綜上，盡管已有諸多研究表明QS信號分子類似物和受體抑制劑能夠淬滅細菌QS，然而暫未見應用于畜禽的相關報道。如何利用QS信號分子類似物或受體抑制劑對畜禽消化道QS進行淬滅進而有效調控消化道菌群并提升畜禽健康與生產水平，是需要進一步探究的問題。

表1 植物活性成分抑制QS信號分子生成

5 小結與展望

細菌QS的發現作為微生物學領域的重大進展之一，增進了人們對細菌通訊系統及細菌種內和種間互作競爭機制的深入了解，促進了環境科學、食品科學、獸醫學等相關學科的發展。近年來，關于細菌QS在細菌感染、食品保鮮、厭氧發酵等領域的研究逐漸增多，但其在畜禽上的報道相對少見。隨著全世界對于畜牧業減排、禁抗的要求越來越高，如何利用細菌QS克服細菌抗藥性以及調控畜禽消化與免疫等功能必將成為研究熱點。有鑒于此，基于已有的細菌QS信號分子、信號通路、調控機理等方面的研究成果，進一步深入研究畜禽消化道細菌QS在畜禽生產中的作用及其調控機制，對于保障畜禽健康、提高畜禽產品品質、以及促進畜禽養殖產業提質增效等均具有積極的指導意義。