熱休克蛋白在冷應激引起的炎癥反應和氧化應激中的調節作用

郭文亮，徐元慶，金 曉，史彬林

(內蒙古農業大學動物科學學院，動物環境與營養實驗室，呼和浩特 010018)

溫度是影響物種健康和生存的重要環境因素，家畜多為恒溫動物，對環境溫度變化極為敏感，當環境溫度低于動物的適宜溫度下限(肉雞為10 ℃，蛋雞為13 ℃，哺乳豬為30 ℃，仔豬為20 ℃，育肥豬為16 ℃，空懷母豬為16 ℃，公豬為14 ℃，山羊為20 ℃，綿羊為21 ℃)時，會對動物造成冷應激。氣候變化綜合指數(comprehensive climate index，CCI)是目前判斷動物冷熱應激最準確的指數之一，該指數計算包括溫度，濕度，風速和太陽直射時間，當環境CCI 在0～25時動物處于無應激狀態(即冷應激<0，熱應激>25)，北方地區冬季平均溫度低于-15 ℃，畜舍內CCI均<0，持續低溫引起動物的冷應激是北方畜牧養殖中普遍存在的福利問題，冷應激不僅會降低動物的生長性能和飼料效率，還會影響動物的免疫和抗氧化功能。冷應激對動物免疫和抗氧化功能影響的嚴重程度與其持續時間呈正比，通常認為急性冷應激(12 h以內)會增加機體產生的促炎細胞因子和活性氧(reactive oxygen species,ROS)引起炎癥反應和氧化應激，且長期的慢性冷應激(幾天甚至幾個月)則會導致動物機體發生炎癥損傷及抗氧化失衡。熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是機體緩解應激反應的重要蛋白，它通過參與相關信號轉導調節機體免疫和抗氧化功能。畜禽在冷應激狀態下通過提高HSP水平緩解炎癥和氧化損傷，但冷應激引起的炎癥反應和氧化應激下HSP調控免疫反應和抗氧化功能的機制卻少有系統報道。本文通過歸納前人研究結果，就冷應激引起的炎癥反應及氧化應激下，機體HSP對免疫反應和抗氧化功能的調控機制進行綜述，以期為緩解畜禽冷應激理論研究提供參考。

1 冷應激引起機體炎癥反應及氧化應激

1.1 誘導機體炎癥反應

機體免疫系統包括免疫器官、免疫細胞和免疫分子，在防御病原微生物入侵方面發揮重要作用。核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)是一種主要在淋巴細胞中表達的介導炎癥和免疫反應的關鍵轉錄因子，急性冷應激會通過激活NF-κB信號通路提高下游促炎細胞因子的基因轉錄與分泌，導致機體產生炎癥反應，而持續的慢性冷應激則會抑制NF-κB的核移位，降低促炎細胞因子的基因轉錄，抑制免疫細胞活性及吞噬抗原能力，引起脾發生病變、淋巴結減少，心組織發生炎癥、空泡、嗜酸性粒細胞變性和肌肉纖維化，小腸損傷和緊密連接結構被破壞等，從而抑制機體免疫功能。但也有研究發現，急性冷應激會抑制炎癥反應，而慢性冷應激會誘發炎癥反應。Wang等研究發現，3 h 4 ℃急性冷應激抑制了小鼠腦組織中NF-κB 核移位，進而減少了腫瘤壞死因子α(TNF-α)的基因轉錄。Su等研究發現，35 d的14 ℃持續冷應激會誘導肉雞血清誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、環氧合酶2(COX-2)、前列腺素E合酶(PTGEs)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和 白細胞介素(IL)4等細胞因子的mRNA表達水平提高，引起炎癥損傷。因此，冷應激對機體免疫功能的影響與應激時間的長短及強度，不同物種間的適宜溫度下限和機體間不同組織等均有關系。

1.2 誘導機體氧化損傷

機體細胞線粒體呼吸會產生超氧陰離子(O·)、過氧化氫(HO)和羥自由基(·OH)等ROS，過多的ROS會氧化不飽和脂肪酸產生脂質過氧化物(MDA)，使蛋白變性和DNA損傷，導致細胞壞死，對機體造成嚴重傷害，而酶和非酶抗氧化劑是保護機體抵抗氧化應激的重要物質。在細胞抗氧化防御系統下，ROS通常保持在較低水平，但冷應激引起的代謝加強會增加自由基負荷，并產生大量的ROS，降低酶促和非酶促抗氧化水平，還會誘導瞬間受體電位離子通道(transient receptor potential A1，TRPA1)活化，增加Ca流入，使ROS水平升高，加劇寒冷環境下的氧化應激。臧樹成研究發現，冷應激會損傷大鼠肝組織，使肝組織出現細胞間隙變小，脂肪變性，通過使用HO模擬體內大鼠肝組織冷應激狀態后，結果顯示氧化應激下大鼠肝組織中MDA含量上升，超氧化物歧化酶(SOD)蛋白水平和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力均下降，肝細胞凋亡率增加。核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)是抗氧化防御系統的主要調控因子，過量產生的ROS會激活Nrf2信號通路，提高下游抗氧化酶的基因轉錄來抵抗氧化失衡。叢培芳等研究發現，極端低溫導致小鼠心肌組織中過氧化氫酶(CAT)和Nrf2的mRNA表達量增加，Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白 1(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)的mRNA表達量降低。Frigault等研究發現，冬眠松鼠心組織的Nrf2 mRNA轉錄水平顯著提高，Keap1的mRNA表達量顯著降低。因此，急、慢性冷應激均會引起氧化應激，損傷機體抗氧化系統及機體組織，且機體會通過激活Nrf2信號通路來抵抗氧化應激。

2 冷應激引起機體HSP表達提高

HSP家族(HSPs)是一類高度保守的分子伴侶蛋白，通過恢復蛋白質錯誤折疊、保護新生蛋白質的翻譯、幫助蛋白質的細胞器轉運、減少有毒物的聚集等功能參與細胞的損傷、修復、增殖、分化和凋亡，在調節細胞周期進程、抵抗機體應激方面有重要作用。HSPs依據分子量的大小可分為HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPs(如HSP12-34)及泛素等幾個家族。不同分子量的HSP功能也不相同。HSP27的主要功能是修復心損傷。HSP32也稱為血紅素加氧酶 1(heme oxygenase-1, HO-1)，在脊椎動物系統中負責幫助機體適應氧化、炎癥和細胞毒性應激，并催化血紅素降解。HSP40是HSP70的合作蛋白，可以調節HSP70 的ATP酶活性作用參與蛋白質解離和跨膜運輸。HSP60在應激狀態下會迅速活化并修復變性的蛋白。HSP70是機體分布與表達均最高的HSP，在應激條件下參與新合成蛋白質的折疊、修飾和轉運。HSP90是細胞內最活躍的HSP，可以維持細胞內蛋白質的構型。HSP110可結合多肽，是一種免疫佐劑，可激活免疫細胞啟動免疫應答。因此，炎癥和氧化失衡均可激活HSPs的表達，各個器官的損傷和修復過程也通常伴隨著HSPs的上調，其含量的高低可用于衡量應激程度，也被稱為應激蛋白。

冷應激產生的信號會激活機體自我防御機制，通常機體會通過上調HSPs水平來適應寒冷環境。熱休克轉錄因子(heat shock transcription factor，HSF)家族(包括鼠類和人HSF-1、2和4以及禽類特有的HSF-3)是HSP的關鍵轉錄因子，其中HSF-1和HSF-3可以響應低溫環境直接上調HSPs的基因和蛋白表達；也可以引起機體內分泌狀態的改變間接誘導HSPs的表達，冷應激狀態下機體會降低胰島素分泌、提高血糖，補償機體能量消耗，胰島素的降低向受體衰變加速因子2(decayacceleratingfactor-2，DAF-2)傳遞信號，使DAF-2的調節器(DDL-1)磷酸化，解離熱休克蛋白結合因子(heat shock factor binding protein 1，HSB-1)、HSF-1、DDL-1和DDL-2結合形成的抑制復合物，釋放HSF-1，三個HSF-1單體聚合成一個有活性的HSF-1三聚體進入細胞核，并與熱休克元件(heat shock element，HSE)結合增加HSP基因轉錄和翻譯的水平。且HSPs的轉錄還受到Nrf2和NF-κB轉錄因子的調控，也會被促炎細胞因子IL-1β、TNF-α、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和ROS激活。Wang等指出，冷(4 ℃)、熱應激(40 ℃)均可誘導粉虱的大多數HSP基因過表達，而沉默HSPs可顯著降低粉虱在45 ℃下的存活率，在-4 ℃下影響不大。在-4 ℃處理1 h提取頭部和身體RNA后發現，體內多數蛋白的合成速率均下降，只有HSP顯著增加，這表明HSPs提高了粉虱耐寒性，從而保護其免受極端環境溫度的影響。綜上所述，低溫環境和內分泌變化均會參與調節HSPs的快速產生，幫助維持機體穩態。

3 炎癥反應下HSP對機體免疫功能的調節作用

在動物機體免疫系統中，免疫細胞與其他生理系統協調發揮最佳功能的能力取決于信號轉導，而冷應激引起的HSPs表達提高可參與調節機體免疫功能。Rastogi 與Haldar研究發現，皮下注射褪黑素會提高冷應激下松鼠脾HSF-1和HSP70的表達，進而增加血液淋巴細胞比率來增強免疫力。Ren等發現，冷應激會引起鵪鶉脾組織的炎癥損傷，而HSP70的表達增加可能會通過抑制前炎癥細胞因子(NF-κB、COX-2、PTGES 和 TNF-α)的表達來保護脾免受炎癥損傷。目前，已有研究表明，冷應激對機體的影響涉及復雜的代謝反應、生理變化和大量的信號轉導，而HSP作為體內重要分子伴侶蛋白，在細胞內和細胞外對免疫系統具有多重調節作用。HSPs的細胞內蛋白(intracellular heat shock protein，IHSP)可通過信號轉導和胞內運輸緩解炎癥反應，但長期應激和細胞凋亡會觸發HSP從胞內主動或被動釋放，胞外蛋白(extracellular heat shock protein，EHSP)可以加強免疫細胞功能，提高促炎細胞因子分泌，維持機體免疫功能動態平衡。

3.1 胞外調節免疫細胞，加強免疫反應

EHSP的胞外免疫調控作用主要分為兩方面，一方面是加強抗原呈遞與免疫細胞功能，保護免疫細胞免受炎癥損傷，提高機體適應性免疫。抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells, APC)可以加工呈遞抗原給抗原特異性細胞，EHSP可增加細胞外環境中抗原和APC之間交叉呈遞的有效性。HSPs與肽復合形成 HSP 肽復合物，該復合物可以通過APC進行加工呈遞給主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)Ⅰ類分子供CD8細胞毒性T淋巴細胞(CTL)識別，且HSPs也可直接作為抗原呈遞分子。巨噬細胞(macrophages，M?)和樹突狀細胞(dendritic cell, DC)是一類專職的APC。其中，M?是獲得性免疫的重要效應細胞，可定向轉移并集中到炎癥部位，殺傷清除炎癥部位的病原體、異物及衰老細胞。而EHSP可誘導激活M?促進炎癥反應參與免疫應答。DC吞噬能力很弱，但有活躍的運動能力，是最強的APC，胞外的HSP70可與DC結合，誘導它們成熟，參與免疫調節，且EHSP可促進DC和M?合成釋放促炎細胞因子，激發T細胞的適應性免疫反應。自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)是機體天然免疫力的重要效應細胞，其細胞表面上的CD94可識別多種癌細胞，并與其膜上的HSP70結合，啟動癌細胞的有效溶解，且EHSP還可以增加NK細胞毒性功能和細胞增殖。另有研究發現，HSP70可以保護大鼠胰島B細胞免受IL-1β誘導的損傷，也能夠保護大鼠腎小球系膜細胞免受IL-1β誘導的凋亡。

EHSP的胞外免疫調控作用另一方面是會激活免疫細胞膜上的Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)和晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)，提高胞內促炎細胞因子的分泌來加強免疫反應。孫海閣等研究發現，在小鼠皮下注射HSP65后，血清抗炎細胞因子IL-10濃度下降，促炎細胞因子干擾素(IFN)-γ濃度升高，誘發機體炎癥反應。Fang等研究發現，HSP70樣蛋白1(HSP70-like protein 1，HSP70L1)可以直接與DC表面的TLR4結合，激活NF-κB通路，上調CD40、CD80和CD86表達，并促進TNF-α、IL-1β和活性白細胞介素12(IL-12p70)的生成，而在 TLR4 缺陷的DC中HSP70L1未能誘導這種表型成熟及相關細胞因子產生。因此，EHSP可通過免疫細胞膜上的TLR2和TLR4誘導促炎細胞因子的分泌。Somensi等研究發現，體外EHSP70處理人肺癌上皮細胞后，可通過細胞模上的晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation endproducts，RAGE)磷酸化ERK1/2激酶，激活NF-κB信號通路，提高TNF-α等促炎細胞因子的轉錄水平，而在RAGE受體阻斷的細胞中，EHSP70處理對促炎細胞因子的分泌刺激減弱，上述激活途徑的不同可能與不同細胞表面的受體有關。綜上所述，EHSP可通過加強免疫細胞功能與抗原呈遞，激活免疫細胞膜上的Toll樣受體和RAGE受體，提高胞內促炎細胞因子的分泌來激發免疫反應。

3.2 胞內炎癥緩解作用

IHSP在胞內緩解炎癥反應主要是通過NF-κB信號通路。NF-κB蛋白通常以無活性的形式與抑制蛋白κB(inhibitory κB，IκB)家族結合，以復合物的形式存在于細胞質中。核苷酸結合寡聚結構域(nucleotide-binding, leucine-rich repeat-containing，NLR)家族成員(NOD1和NOD2)介導先天免疫基因的轉錄激活，并與其下游銜接蛋白受體相互作用蛋白(receptor-interacting proteins, RIP)2相互作用形成NOD1-RIP2 / NOD2-RIP2復合物，該復合物可以募集到IκBk(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK)抑制性復合物中激活NF-κB途徑。HSP90可以維持NOD1的穩定，使其處于失活狀態，減少NOD1 / NOD2與RIP2相互作用形成的NOD1-RIP2 / NOD2-RIP2復合物，從而抑制NF-κB的激活。腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6，TRAF6)是一種重要的信號轉導子，可調節多種生理和病理過程，并且可以磷酸化IKK，激活NF-κB信號通路。HSP70可以在TRAF-C域中與TRAF6發生物理結合，抑制TRAF6泛素化，從而抑制NF-κB活化，緩解炎癥反應。HSPs不僅可以通過NLR和TRAF6受體抑制NF-κB信號通路，還可以直接激活IκB磷酸化，抑制NF-κB于IKK抑制性復合物中，減少NF-κB通過核孔進入細胞核，下調TNF-α、IL-1β 和 IL-8 基因的表達。因此，由于HSP可通過下調NF-κB的激活來表現出免疫抑制，使其在許多發炎組織中過度表達，并參與調節慢性炎癥，改善自身免疫疾病等。Zhou等研究發現，小鼠旋毛蟲感染后顯著降低了機體的HSP70豐度，并激活了NF-κB信號通路增強IL-10 和IL-17的表達，誘導機體發生炎癥反應。但是高溫處理后，HSP70基因和蛋白的表達量提高抑制了NF-κB的活化。腹腔注射吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC，NF-κB抑制劑)和-硝基-1-精氨酸甲酯氫氯化物(1-NAME，iNOS抑制劑)后發現，回腸HSP70的表達提高和PDTC處理會進一步抑制NF-κB的活性，而1-NAME處理會降低HSP70對iNOS的激活，因此，HSP70會抑制NF-κB并激活NOS /一氧化氮(NO)信號途徑，緩解機體炎癥反應。同樣，Shang等研究建立了雞卵清白蛋白誘導的哮喘小鼠模型，敲除HSF-1后會促進NF-κB信號通路的激活，加重小鼠氣道炎癥，說明HSF-1也可負調控NF-κB信號通路參與炎癥反應。綜上所述，HSPs可通過胞內胞外的不同作用雙向調節免疫反應，這種相互矛盾的調節方式表明HSP可在細胞內外發揮雙重作用，這可能與細胞類型、疾病類型、炎癥部位、應激強弱和機體狀況等有關。當機體處于冷應激下發生炎癥反應時，HSPs會提高其內源性轉錄，減少胞外流出起到緩解炎癥反應作用，而當機體長期處于炎癥反應下，免疫系統受損，細胞因子分泌降低，免疫細胞活性抑制，細胞發生凋亡，HSPs可在應激下增加胞外流出起到保護免疫細胞，加強其免疫功能，提高細胞因子分泌等作用激發自身免疫反應，以此來控制自身免疫平衡。

4 氧化應激下HSP對機體抗氧化功能的調節作用

HSPs還可通過Keap1-Nrf2-抗氧化反應元件(anti-oxidant response element，ARE)信號途徑緩解機體的氧化損傷。正常生理條件下，Keap1通過與Nrf2的氨基末端Neh2域特異性結合形成復合物將其抑制于細胞質中，使Nrf2處于無活性狀態。HSP90可與Keap1相互作用，解離Keap1-Nrf2復合物釋放Nrf2，Nrf2進入細胞核與ARE結合提高其下游抗氧化酶的基因轉錄。Rastogi與Haldar研究發現，褪黑素治療可通過增加小鼠脾的HSF-1和HSP-70基因表達和蛋白表達，進而提高SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性，緩解冷應激引起的氧化失衡。賈紅豆研究指出， HSPB7(heat shock protein family B member 7)過表達上調了Nrf2的蛋白和mRNA表達，且提高了下游靶基因HO-1和醌氧化還原酶1[NAD (P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]的mRNA表達量，增強了SOD和GSH-Px的活性，進而緩解了HO誘導的氧化應激。HSP和Nrf2的表達提高是機體抵抗急、慢性冷應激引起的氧化/抗氧化系統失衡的重要保護機制。

5 HSP與炎癥反應、氧化失衡的聯系

盧德勛提出氧化應激-炎癥反應-免疫功能失衡鏈是1個問題的3個相互聯動方面，免疫系統和抗氧化系統是緊密聯系的整體。細胞因子與ROS是機體代謝的產物，對于細胞功能、增殖和信號轉導進程有重要作用，二者處于動態平衡的狀態。低濃度的ROS可激活T細胞，促進細胞生長，而氧化應激會破壞機體自由基穩態，引起過量的ROS積累，進而激活大量的淋巴細胞和M?發生炎癥反應，誘導胰腺細胞、M?和DC發生凋亡，抑制淋巴細胞的增殖和分化，減弱NK細胞的殺傷能力，抑制免疫功能，還會通過TLR2途徑激活促炎細胞因子的轉錄和分泌加重氧化應激對機體的炎癥損傷，ROS與炎癥相互促進發展，從而引起免疫和抗氧化系統失衡。炎癥因子和ROS均可上調Nrf2和NF-κB的表達，Nrf2的激活會增強下游抗氧化酶相關基因的表達，清除自由基，保護細胞免受氧化損傷并抑制炎癥。NF-κB的激活會提高促炎細胞因子基因的表達，增強炎癥反應，且Nrf2的激活會抑制NF-κB通路的激活，從而降低ROS介導的NF-κB激活引起的炎癥反應。

圖1 熱休克蛋白在冷應激引起的炎癥反應和抗氧化功能中的調節作用通路圖Fig.1 Moderating role of heat shock protein under inflammatory response and oxidative stress caused by cold stress pathway diagram

6 小 結

冷應激會誘發機體產生炎癥反應和氧化失衡，且長期冷應激會造成機體免疫器官病變和免疫細胞凋亡，加劇氧化應激對機體的損害。其中，HSPs在機體維持內環境穩態和細胞保護中起重要作用，可通過胞內調控Nrf2和NF-κB信號通路來調節免疫細胞和免疫因子，提高機體抗氧化能力，抑制炎癥反應，緩解氧化損傷，還可胞外保護免疫細胞、參與抗原呈遞，激發免疫反應，以保護免疫系統功能不會過度抑制。目前關于冬季控制畜舍環境及營養調控提高動物免疫抗氧化功能已有大量報道，但如何提高冷應激條件下HSPs的表達和HSPs是否會在冷應激條件下參與調控動物代謝卻少有研究，完成這些工作有助于全面了解冷應激下HSPs對機體的影響及作用。

致謝

本研究由動物福利標準項目(Animal Welfare Standards Project by Good Ventures Foundation, in a grant administered through the School of Veterinary Science, University of Queensland)支持，特表感謝。