miR- 155通過調控Th9細胞分化及相關因子表達參與腦梗死免疫發病機制的研究

賀丹,徐峻峰

(鄂州市中心醫院 神經內科，湖北 鄂州 436000)

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.2 建模、分組和干預

1.3 檢測指標方法

1.3.1 mNSS評分 mNSS評分系統是評估大鼠腦梗死后神經功能缺損的通用標準，包括運動、感覺、反射和平衡測試[11]。mNSS分數最高為18分，分數越高，神經損傷越嚴重。本研究中所有mNSS評分均由同1名研究者進行。

1.3.2 梗死體積評估 使用TTC染色評估梗死體積，干預后安樂死處死大鼠，大腦被迅速收獲并在-20 ℃下冷凍10 min。制作冠狀切片并在37 ℃下用2% 的TTC染色10 min。使用連接到計算機的數碼相機捕獲圖像以評估梗死體積，未染色區域被定義為梗死，使用Image J測量體積。

1.3.3 HE染色 大鼠安樂死后取出梗死邊緣腦組織并在室溫下用4%多聚甲醛固定6 h。用乙醇脫水(從低濃度到高濃度)后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5 μm的切片，并將這些切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10 min。用自來水洗滌1～2 min后，將載玻片置于10%冰醋酸中10 s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2 min后，將載玻片放入曙紅中10 s。脫水后將樣本置于二甲苯中2 min；重復此步驟1次。最后，用中性膠密封玻片。在倒置顯微鏡下觀察載玻片。

1.3.5 ELISA 將梗死邊緣腦組織裂解后離心(4 ℃，20 min，12 000 r·min-1)后使用移液槍小心吸取上層清液，加入抗體孵育2 h后加入顯色劑，10 min后終止反應。在450 nm下檢測吸光度，根據試劑盒標準曲線計算單位質量黑質組織中IL- 1β和IL- 6的量(pg·mg-1)。收集腦組織中血液，離心后收集血清，按照上述方法檢測血清中IL- 9的質量濃度(pg·ml-1)。

1.3.6 流式細胞術 大鼠斷頭處死后取腦組織中的血液，經過密度梯度離心后獲得單個淋巴細胞懸浮液，然后利用免疫磁珠收集T淋巴細胞。將所得細胞用磷酸鹽緩沖液以500 μg·g-1洗滌2次，每次持續5 min。為了分析Th9細胞，將細胞收獲到5 μl的無菌試管中，洗滌后加入CD4(5 μg·ml-1)和IL- 9(5 μg·ml-1)試劑在黑暗中孵育20 min進行表面標記染色。使用BD Aria II活細胞分選儀對細胞進行分析，CD4+IL- 9+為Th9細胞。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠mNSS評分比較

建模后腦梗死組和腦梗死+miR- 155抑制劑組大鼠mNSS評分均在10～13分，且組間比較差異無統計學意義(F=2.810，P=0.094)。干預后，腦梗死組和腦梗死+miR- 155抑制劑組mNSS評分均顯著高于對照組(P<0.05)，且腦梗死+miR- 155抑制劑組mNSS評分顯著低于腦梗死組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠mNSS評分比較 分Tab 1 Comparison of mNSS scores of rats in each group scores

2.2 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠梗死體積的影響

圖1 TTC染色檢測miR- 155抑制劑對梗死體積的影響Fig 1 TTC staining to detect the effect of miR- 155 inhibitor on infarct volume

2.3 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織病理學改變的影響

對照組神經元分布均勻，細胞核結構清晰。腦梗死組的細胞核染色變深并且出現間質性水腫。腦梗死+miR- 155抑制劑組的神經元損傷和水腫情況輕于腦梗死組。見圖2。

圖2 HE染色檢測miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織病理學改變的影響Fig 2 HE staining to detect the effect of miR- 155 inhibitor on the pathological changes of brain tissue in rats with cerebral infarction

2.4 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠神經元凋亡的影響

腦梗死組凋亡指數為(28.62±2.45)，顯著高于對照組(P<0.05)；腦梗死+miR- 155抑制劑組凋亡指數為(13.26±1.79)，顯著低于腦梗死組(P<0.05)，但顯著高于對照組(P<0.05)。見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠神經元凋亡的影響(×400)Fig 3 TUNEL staining to detect the effect of miR- 155 inhibitor on neuronal apoptosis in rats with cerebral infarction(×400)

2.5 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織炎癥反應的影響

腦梗死組IL- 1β和IL- 6水平顯著高于對照組(P<0.05)；腦梗死+miR- 155抑制劑組IL- 1β和IL- 6水平顯著低于腦梗死組(P<0.05)，但顯著高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 ELISA檢測miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織炎癥反應的影響 pg·mg-1Tab 2 ELISA to detect the effect of miR- 155 inhibitors on the inflammatory response of brain tissue in rats with cerebral infarction pg·mg-1

2.6 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠Th9細胞比例和I 9表達的影響

腦梗死組大鼠腦組織血液中Th9細胞比例和IL- 9濃度顯著高于對照組(P<0.05)；腦梗死+miR- 155抑制劑組Th9細胞比例和IL- 9濃度顯著低于腦梗死組(P<0.05)，但顯著高于對照組(P<0.05)。見圖4、表3。

表3 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織血液中Th9細胞比例和I 9表達的影響Tab 3 Effects of miR- 155 inhibitors on the proportion of Th9 cells and the expression of I 9 in the blood of cerebral infarction rats

圖4 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織血液中Th9細胞比例的影響Fig 4 The effect of miR- 155 inhibitor on the proportion of Th9 cells in the blood of cerebral infarction rats

2.7 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織T淋巴細胞中miR- 155表達水平的影響

腦梗死組大鼠腦組織T淋巴細胞中miR- 155水平為(3.41±0.42)，顯著高于對照組的(1.00±0.09)，差異有統計學意義(P<0.05)。腦梗死+miR- 155抑制劑組的miR- 155水平為(1.76±1.92)，顯著低于腦梗死組，但顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.8 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織T淋巴細胞中PU.1、IRF4蛋白表達水平的影響

腦梗死組大鼠腦組織T淋巴細胞中PU.1、IRF4蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)。腦梗死+miR- 155抑制劑組PU.1、IRF4蛋白水平顯著低于腦梗死組(P<0.05)，但顯著高于對照組(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織T淋巴細胞中PU.1和IRF4蛋白表達水平的影響Tab 4 The effect of miR- 155 inhibitors on the expression levels of PU.1 and IRF4 proteins in T lymphocytes in brain tissue of rats with cerebral infarction

圖5 Western blotting檢測miR- 155抑制劑對腦梗死大鼠腦組織T淋巴細胞中PU.1、IRF4蛋白表達水平的影響Fig 5 Western blotting detection of the effect of miR- 155 inhibitor on PU.1 and IRF4 protein expression levels in T lymphocytes of cerebral infarction rats

3 討 論

腦梗死后血液再灌注會誘發腦水腫，在梗死發生2～7 d后導致神經元繼發性損傷，誘發神經系統后遺癥，并與死亡有關[12]。腦梗死預后個體差異較大，具有極高的致死率和致殘率，但是目前尚無治療腦梗死和減少后遺癥的特效藥物，尋找緩解缺血性腦梗死神經元損傷的方法具有重要的臨床意義[13]。