外周血ctDNA中PCDH8和PCDH17基因甲基化在高級別漿液性卵巢癌篩查和預后中的臨床價值

程其軍，劉意，許劍利

(1.自貢市第一人民醫院 婦產科，四川 自貢 643000; 2.重慶醫科大學附屬第二人民醫院 婦產科，重慶 400010)

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年7月至2018年7月在自貢市第一人民醫院診治并接受手術治療的85例HGSOC患者(HGSOC組)和35例非惡性診斷患者(如子宮脫垂伴附件切除術或子宮肌瘤等，設為對照組)作為研究對象。本研究中使用的185份福爾馬林固定石蠟包埋標本由本院生物庫提供。同時收集診斷時的血液樣本，用EDTA抗凝和以3 200 r·min-1離心后，在-80 ℃下保存血漿上清液。所有組織樣本都經過有經驗的婦科病理學專家的審核。納入標準：(1) 卵巢癌為原發性；(2) 經病理明確診斷為HGSOC，根據國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期[7]，術后接受足夠療程的化療[8]；(3) 將腫瘤組織標本用蘇木精和伊紅染色，并由病理學專家閱片，確定腫瘤細胞≥60%。排除標準：(1) 于本院就診治療前已行過放化療、免疫治療或內分泌治療；(2) 合并可能影響測量結果的并發癥，如嚴重高血壓、肝腎功能衰竭等；(3) 合并其他部位的腫瘤。本研究是根據赫爾辛基宣言進行的，研究方案得到了醫院倫理審查委員會的批準。所有HGSOC患者都簽署了參與研究的書面同意書。患者中位確診年齡為57歲(40～79歲)，對照組中位年齡為56歲(43～84歲)，兩組在年齡方面具有可比性(P>0.05)。所有HGSOC患者完成全面分期手術(手術方式為全子宮+附件+大網膜切除術+腹、盆腔腫瘤減滅術)以及術后根據FIGO臨床分期接受至少6個周期的卡鉑AUC5和紫杉醇175 mg·m-2。以HGSOC患者術后影像學檢查(腹部CT+盆腔MRI檢查，平掃+增強掃描，掃描范圍包括整個盆腔和腹部)發現新病變的時間為復發日期。隨訪截至2021年7月。

1.2 DNA提取及亞硫酸鹽修飾

1.3 甲基化熒光(MethyLight)定量分析

1.4 克隆重亞硫酸鹽測序

為了分析CpG在特定基因啟動子(PCDH8、PCDH17)中的甲基化狀態，隨機抽取了5個甲基化陽性的腫瘤組織樣本(PMR值>4)和3個正常樣本進行克隆重亞硫酸鹽測序。用甲基熒光分析法測定各自基因啟動子所覆蓋的區域。將擴增產物用快速凝膠提取試劑盒進行凝膠切割和純化。利用InsTAcloneTMPCR克隆試劑盒將純化的PCR產物連接到T載體上，轉化并克隆到大腸桿菌DH5α中。通過藍白篩選得到陽性轉化克隆，并利用NucleoSpin?質粒DNA純化試劑盒進行純化。挑取10～12個克隆菌落在3730XL基因分析儀上進行測序。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 組織PCDH8、PCDH17克隆重亞硫酸鹽測序結果

根據克隆重亞硫酸鹽測序，PCDH8基因啟動子區含14個CpG位點(圖1)，PCDH17基因啟動子區含19個CpG位點(圖2)。

a．PCDH8啟動子區包含14個CpG位點；b.PCDH8啟動子區域的核苷酸序列；c.克隆重亞硫酸鹽測序結果圖1 PCDH8在對照組和HGSOC組組織中的克隆重亞硫酸鹽測序結果

a.PCDH17啟動子區包含19個CpG位點；b. PCDH17啟動子區域的核苷酸序列；c. 克隆重亞硫酸鹽測序結果圖2 PCDH17在對照組和HGSOC組組織中的克隆重亞硫酸鹽測序結果

2.2 組織和ctDNA中PCDH8、PCDH17甲基化狀態

利用MethyLight定量分析，HGSOC組腫瘤組織和ctDNA中PCDH8、PCDH17基因PMR值高于對照組(P<0.05，表1)。經Spearman秩相關性分析，HGSOC組腫瘤組織與ctDNA中PCDH8基因PMR值、PCDH17基因PMR值均呈正相關性(rs分別為0.465、0.432，均P<0.001)。

表1 甲基化熒光定量分析組織和ctDNA中PCDH8、PCDH17甲基化狀態%

2.3 ROC曲線分析PCDH8、PCDH17基因用于HGSOC篩選標志物的潛力

經ROC曲線分析，甲基化PCDH8和PCDH17分別發生在84.7%和85.9%的HGSOC組織樣本中，從而證實PCDH8和PCDH17基因甲基化是高度腫瘤特異性的。ctDNA中PCDH8和PCDH17基因PMR值用于篩查HGSOC的曲線下面積(AUC)均>0.7，當兩個基因啟動子都顯示甲基化時，靈敏度為83.5%，特異度為80.0%(表2和圖3)。

圖3 PCDH8、PCDH17基因用于區分HGSOC和非惡性樣本的ROC曲線

表2 ROC曲線分析組織和ctDNA中PCDH8、PCDH17基因PMR值用于篩選HGSOC的臨床價值

2.4 組織和ctDNA中PCDH8、PCDH17基因高甲基化與臨床病理特征的關系

表3 組織和ctDNA中PCDH8、PCDH17基因高甲基化與臨床病理特征的關系

2.5 單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析影響術后復發的臨床因素

表4 單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析影響術后復發的臨床因素

3 討 論

綜上，外周血ctDNA中PCDH8、PCDH17基因甲基化檢測可以作為HGSOC篩查或預測腫瘤術后進展的潛在的生物標志物。然而，本研究患者數量相對較少，需要進一步大樣本研究來證實，并為此優化策略和方案。外周血ctDNA中PCDH8、PCDH17甲基化檢測最顯著的特點是高效、快速、低成本和無創性，因此其具有潛在的應用前景。