基于生物信息學(xué)分析NEIL3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義

張建國(guó)，何亮，王久陽(yáng)，姜濤

(北京市平谷區(qū)醫(yī)院 1.普外科,2.病理科, 北京 101200)

肝癌在人類惡性腫瘤中發(fā)病率排名第六，是全球第四大腫瘤相關(guān)死亡原因[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類型，與多種眾所周知的病因相關(guān)，包括慢性 HBV 或 HCV 感染、酗酒、非酒精性脂肪肝以及接觸黃曲霉毒素等膳食毒素[2]。HCC 是一種高度異質(zhì)性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。盡管手術(shù)切除、肝移植、經(jīng)皮消融、靶向治療和放療已被用作HCC臨床治療方法，但由于治療后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高，HCC患者的預(yù)后仍不理想[3]。因此，需要探索新型藥物靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物，為 HCC 患者提供使其獲得更有效的個(gè)性化治療和更好的預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)

TCGA(https:∥portal.gdc.cancer.gov/)是由美國(guó)國(guó)家癌癥研究所和國(guó)家人類基因組研究所公共資助的項(xiàng)目，該項(xiàng)目通過(guò)大規(guī)模高通量測(cè)序分析技術(shù)創(chuàng)建全面的癌癥基因組圖譜[8]。本研究從該數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了50例正常組織及374例HCC組織的mRNA數(shù)據(jù)(FPKM)和HCC患者的臨床信息(表1)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC患者的臨床病理特征Tab 1 Characteristics of HCC patients in the TCGA database

1.2 基因表達(dá)譜交互式分析(gene expression profiling interactive analysis，GEPIA)和Kapla Meier數(shù)據(jù)庫(kù)

1.3 UALCAN和cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)

UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)公開(kāi)可用的門戶網(wǎng)站(http:∥ualcan.path.uab.edu)，它提供對(duì)來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)的在線分析[11]。cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥cbioportal.org) 是一個(gè)可以公開(kāi)獲取的數(shù)據(jù)資源平臺(tái)，旨在為癌癥基因組學(xué)數(shù)據(jù)集提供可視化和分析，包括甲基化、拷貝數(shù)變異和突變[12]。本研究首先使用UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析NEIL3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度在正常組織和HCC組織之間的差異。然后通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析HCC組織中NEIL3表達(dá)與甲基化水平的相關(guān)性。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和功能探索

1.5 共表達(dá)基因的獲取和富集分析

LinkedOmics(http:∥www.linkedomics.orglogin.php) 是軟件生態(tài)系統(tǒng)中一種新的獨(dú)特工具，用于分析來(lái)自大規(guī)模癌癥組學(xué)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)[15]。本研究使用LinkedOmics的LinkFinder模塊探索NEIL3的共表達(dá)基因；然后使用LinkInterpreter模塊進(jìn)行GSEA分析探索NEIL3及其相關(guān)基因可能參與的信號(hào)通路，F(xiàn)DR值<0.05通路有顯著意義。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NEIL3在HCC中顯著高表達(dá)

來(lái)自于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的mRNA數(shù)據(jù)分析顯示，與正常癌旁組織相比，NEIL3在HCC組織中顯著上調(diào)(P<0.001)(圖1A)。另外，來(lái)自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的配對(duì)樣本進(jìn)一步分析顯示，與配對(duì)癌旁組織相比，NEIL3在肝細(xì)胞癌組織中也顯著高表達(dá)(P<0.001)(圖1B)。

A．與正常癌旁組織相比，NEIL3在HCC組織中顯著高表達(dá)；B. 與配對(duì)癌旁組織相比，NEIL3在HCC組織中顯著高表達(dá)圖1 NEIL3在肝臟癌旁組織和HCC組織中的表達(dá)差異A. NEIL3 was significantly highly expressed in HCC tissues compared to normal paraneoplastic tissues; B. NEIL3 was significantly highly expressed in HCC tissues compared to paired paraneoplastic tissuesFig 1 Differences in NEIL3 expression in paraneoplastic liver tissues and HCC tissues

2.2 NEIL3表達(dá)在HCC患者臨床病理特征中的差異

根據(jù)NEIL3中的中位表達(dá)值將HCC患者分為高、低NEIL3表達(dá)組。對(duì)高、低NEIL3表達(dá)組患者臨床特征的差異比較顯示，NEIL3表達(dá)在患者的病理分期中存在差異(表2)。

表2 NEIL3表達(dá)與HCC患者臨床病理性狀的關(guān)系 例Tab 2 Relationship between NEIL3 expression and clinicopathological symptoms in HCC patients cases

2.3 NEIL3表達(dá)在HCC預(yù)后中的價(jià)值

B． 高NEIL3表達(dá)組患者的OS和DFS較低表達(dá)組患者差(GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù))； F.高NEIL3表達(dá)組患者的OS、DFS、PFS和RFS較低表達(dá)組患者差(Kapla Meier數(shù)據(jù)庫(kù))圖2 NEIL3在HCC預(yù)后中的價(jià)值 B. The overall survival and disease- free survival of patients in the high NEIL3 expression group were poorer than those in the low expression group(GEPIA database); F. Overall survival, disease- free survival, progression- free survival and recurrence- free survival of patients in the high NEIL3 expression group were poorer than those in the low expression group(Kaplan- Meier database)Fig 2 Prognostic value of NEIL3 in hepatocellular carcinoma

2.4 NEIL3在HCC中的甲基化分析

通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，NEIL3啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度在HCC組織中顯著降低(圖3A)。其次，通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，在HCC組織中隨著甲基化水平降低，NEIL3表達(dá)越低(圖3B)。

A. 與正常組織相比，NEIL3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化程度在HCC中顯著降低；B. NEIL3表達(dá)與基因甲基化程度呈負(fù)相關(guān)圖3 NEIL3在HCC中的甲基化分析A. The degree of methylation in the promoter region of NEIL3 gene was significantly reduced in HCC compared with normal tissues; B. NEIL3 expression was negatively correlated with the degree of gene methylationFig 3 Methylation analysis of NEIL3 in HCC

2.5 NEIL3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和功能探索

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建了NEIL3的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(圖4A)，獲得了10個(gè)與NEIL3存在相互聯(lián)系的基因(APEX2、DLGAP5、EXO1、FEN1、MUTYH、NCAPG、NEIL1、NTHL1、OGG1和TOP2A)。將這些基因輸入到Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能探索，結(jié)果如圖4B所示。NEIL與其相互作用基因主要參與堿基切除修復(fù)、核酸磷酸二酯鍵水解和姐妹染色體分離等生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。

A. NEIL3蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建；B. NEIL3及其相互作用網(wǎng)絡(luò)蛋白的功能分析圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和功能分析A. Construction of NEIL3 protein interaction network; B. Functional analysis of NEIL3 and its interacting network proteinsFig 4 Construction and functional analysis of protein interaction network

2.6 NEIL3共表達(dá)基因的獲取和通路分析

A.共表達(dá)基因火山圖；B- C.與NEIL3存在正、負(fù)相關(guān)的前50個(gè)基因；D.NEIL3及其共表達(dá)基因的京都基因與基因組百科全書(shū)圖5 NEIL3在HCC中的共表達(dá)分析和功能富集分析A. Volcano map of co- expressed genes; B- C. Top 50 genes positively and negatively associated with NEIL3; D. Kyoto gene and genome encyclopedia of NEIL3 and its co- expressed genesFig 5 C expression analysis and functional enrichment analysis of NEIL3 in HCC

3 討 論

HCC是最常見(jiàn)的實(shí)體惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。HCC的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種危險(xiǎn)因素。HCC在全球的分布隨危險(xiǎn)因素的流行程度而變化。慢性乙型肝炎病毒(HBV) 感染和黃曲霉毒素 B1(AFB1)吸入是中國(guó)和印度等發(fā)展中地區(qū)的主要危險(xiǎn)因素。在發(fā)達(dá)地區(qū)，HCC主要由丙型肝炎病毒(HCV)和非酒精性脂肪肝引起的肝硬化發(fā)展而來(lái)[2]。目前早期HCC患者多采用肝移植(LT)等根治性療法。對(duì)于中度HCC，主要是局部治療，如經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞(TACE)。對(duì)于晚期HCC患者，目前全身藥物治療最為有效。盡管有多種療法可用于 HCC，但患者的OS仍遠(yuǎn)不能令人滿意，對(duì)更有效療法的需求仍未得到滿足[16]。靶向藥物是HCC最有前景的治療選擇之一。探索新型預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)改善HCC患者預(yù)后具有重大意義。

首先，本研究發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，NEIL3在HCC中顯著高表達(dá)。其次，臨床病理相關(guān)性分析顯示，隨著NEIL3的升高，HCC的病理分期和T分期越高。然后生存分析顯示高表達(dá)NEIL3與HCC患者較差的OS、DFS、PFS和RFS顯著相關(guān)。這些研究表明，NEIL3可能在HCC中充當(dāng)癌基因的角色。表觀遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，NEIL3低甲基化水平可能是NEIL3在HCC中高表達(dá)的原因。最后，為了探索NEIL3在HCC中的潛在作用機(jī)制，分析NEIL3的互作網(wǎng)絡(luò)蛋白和相關(guān)基因，然后對(duì)這些基因進(jìn)行功能富集分析。有趣的是，這些基因富集在經(jīng)典的腫瘤信號(hào)通路，例如細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、同源重組、錯(cuò)配修復(fù)、p53信號(hào)通路、堿基切除修復(fù)、剪接體和乙型肝炎相關(guān)等信號(hào)通路。這些信號(hào)通路被證實(shí)在癌癥中具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。例如細(xì)胞周期調(diào)控的紊亂是癌癥最重要的特征之一[17]。DNA 復(fù)制是基本的生物學(xué)過(guò)程之一，其中失調(diào)會(huì)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定。這種不穩(wěn)定性是癌癥的標(biāo)志之一，并在腫瘤發(fā)生過(guò)程中賦予遺傳多樣性[18]。同源重組是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 DNA 雙鏈斷裂修復(fù)的主要途徑，其定義步驟是由 RAD51 蛋白指導(dǎo)的同源鏈交換，研究顯示同源重組缺陷將導(dǎo)致發(fā)育異常和增強(qiáng)癌癥易感性[19]。DNA 錯(cuò)配修復(fù)切除堿基錯(cuò)配以提高 DNA 復(fù)制的保真度，而錯(cuò)配修復(fù)的喪失導(dǎo)致自發(fā)突變?cè)黾?。結(jié)合以上研究結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)NEIL3可能通過(guò)這些腫瘤信號(hào)通路參與HCC的進(jìn)程。

綜上所述，NEIL3具有作為HCC預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。NEIL3潛在調(diào)控信號(hào)通路是理解HCC發(fā)病機(jī)制的突破點(diǎn)。然而，本研究存在著不可忽視的局限性:缺乏HCC中NEIL3蛋白水平的證據(jù)；NEIL3影響HCC患者預(yù)后的確切機(jī)制尚未完全闡明。應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證本研究的結(jié)論。