血清和尿液Hugl- 2基因甲基化檢測對腎細胞癌的診斷價值

李朝輝，程任權，李瑤，王鑫淼，楊小麗

(臨汾市中心醫院 1.檢驗科,2.腫瘤科,山西 臨汾 041000)

1 資料與方法

1.1 生物信息學分析

1.2 一般資料

本研究所使用的腫瘤組織、腎實質、血清和尿液樣本，均來自2018年5月至2021年3月在本院泌尿外科接受根治性腎切除術的148例RCC患者(RCC組)，術前未接受任何抗腫瘤治療。確診時患者的中位年齡為64歲(21～84歲)。同時，從參加預防性醫學檢查的非癌人群中提取150例(非癌對照組人群)血清樣本和尿液樣本，非癌對照組人群中位年齡65歲(18～85歲)，沒有任何患有惡性腫瘤的臨床證據和高危因素(鼻咽癌病史、吸煙、飲酒、經常食用腌制或鹽漬食品)，且無任何毒化學品職業暴露風險。兩組年齡、性別構成比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。冷凍生物樣本,-80 ℃下儲存直到處理完畢。所有參與者均獲得書面知情同意，且本研究亦獲得本院倫理委員會批準。

1.3 研究方法

1.3.1 血液和尿液采集 入組次日上午(8:00～10:00)從每個受試者處抽取靜脈血10 ml,并收集大約13 ml的現場尿液，置于冰箱中直至離心。取上清液在-80 ℃保存。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 生物信息學數據分析

A. TCGA樣本RCC組織和正常組織中Hug 2 mRNA表達；B. CPRAC樣本RCC組織和正常組織中Hug 2蛋白表達；C. Hug 2 mRNA表達與腫瘤組織學分級的關系；D. Hug 2 mRNA表達與患者總生存預后的關系；E. TCGA樣本RCC組織Hug 2基因甲基化水平(淡色字體表示CpG島)；F. 基于LinkedOmics工具，RCC組織Hug 2基因甲基化水平與TNM病理學分期的關系；G. RCC組織Hug 2基因甲基化水平與T分期的關系；H. RCC組織Hug 2基因甲基化水平與患者總生存預后的關系圖1 基于生物信息學工具分析Hugl- 2 mRNA在RCC組織中的表達和甲基化情況

2.2 RCC組織中Hug 2基因甲基化水平

經甲基化特異性PCR法檢測，RCC組織標本中Hugl- 2基因甲基化水平高于相配對的癌旁非癌腎實質組織樣本[0.342(0.128，0.803)vs.0.032(0.007，0.102)，Z=-12.090，P<0.001，圖2A]。此外，RCC組患者血清樣本[0.078(0.033，0.186)vs.0.019(0.010，0.064)，Z=-6.881，P<0.001]和尿液樣本[0.123(0.078，0.218)vs.0.023(0.014，0.059)，Z=-8.752，P<0.001]中Hugl- 2基因甲基化水平亦高于非癌對照組人群。經Spearman相關系數分析，RCC組患者血清樣本和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平均與腫瘤組織樣本中Hugl- 2基因甲基化水平呈正相關(rs值分別為0.352、0.486，均P<0.001，圖2B和圖2C)。

A. RCC組織和相配對的癌旁非癌腎實質組織樣本Hugl- 2基因甲基化水平；B. 腫瘤組織與血清樣本中Hugl- 2基因甲基化水平的關系；C. 腫瘤組織與尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平的關系圖2 Spearman相關系數分析

2.3 RCC組織、血清和尿液樣本中Hug 2基因甲基化水平與患者臨床病理特征的關系

表1 RCC組織、血清和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平與患者臨床病理特征的關系

2.4 血清和尿液Hug 2基因甲基化水平對RCC的診斷價值

經ROC曲線分析發現，檢測血清和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平診斷RCC的AUC分別為0.818(95%CI：0.770～0.867)和0.958(95%CI：0.935～0.980)，且尿液樣本的AUC大于血清樣本(Z=-0.498，P<0.001，圖3)。

圖3 血清和尿液Hugl- 2基因甲基化診斷RCC的ROC曲線

3 討 論

臨床上RCC早期診斷率較低，通常只是在對非特異性癥狀或其他腹部疾病進行影像學檢查時才被診斷出來，因此迫切需要更有效的早期診斷技術[2]。DNA甲基化是哺乳動物表觀遺傳修飾中研究最為廣泛的一種，它可以通過抑制腫瘤的抑制基因的表達而促進腎臟腫瘤的發生。作為穩定的、可以定量檢測的DNA標志物，腫瘤組織中DNA甲基化是一種潛在的早期檢測、預測治療反應及預后的生物標志物。在本研究中我們基于TCGA數據庫發現Hugl- 2基因啟動子上的CpG基因位點是影響其在RCC中表達的可能調節因子。此外，Hugl- 2 mRNA表達與蛋白表達水平呈正相關性。為了證實該推斷的可靠性，我們收集了近3年在我院泌尿外科接受根治性腎切除術的RCC患者的組織標本，證實RCC腫瘤組織、血清和尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平普遍升高，且Hugl- 2基因甲基化與RCC患者臨床病理分期有關。結果表明RCC中Hugl- 2蛋白表達下調可能是由異常的啟動子甲基化引起的。盡管在RCC中Hugl- 2表達下調的機制是潛在的，本研究結果表明Hugl- 2基因甲基化水平可能是這種癌癥的特異性生物標志物。

細胞極性是細胞的不對稱性分裂、細胞的遷移、細胞的免疫、神經信號的傳導等生理過程的重要基礎[8]。細胞極性的建立和維持對于胚胎和個體發育的過程是必需的，在病理條件下丟失細胞極性會嚴重影響機體發揮正常功能而形成腫瘤并且發生轉移。Lgl編碼一種保守的腫瘤抑制因子，在細胞極性、不對稱分裂和增殖控制中具有已確立的作用。Lgl功能的喪失會導致極化上皮組織的破壞，并影響調節細胞生長的信號通路，而這些信號通路與人類癌癥有關[5]。Calleja等[9]研究發現,在果蠅的三齡幼蟲階段Lgl的缺失會導致侵入性神經和上皮腫瘤的發生。另外，在神經干細胞中Lgl被證明與非典型蛋白激酶C(aPKC)/PAR極性復合物相互作用并拮抗，以控制尖基極性和細胞增殖[10]。

綜上，Hugl- 2基因異常DNA甲基化是癌變過程中的一個早期事件，并隨著腫瘤的發展逐漸明顯。因此，檢測血清或尿液樣本中Hugl- 2基因甲基化水平有望成為RCC的診斷手段，尤其檢測尿液中Hugl- 2基因甲基化水平。