黃芪及其活性成分的利水作用機制探討*

趙安社，王新陸，朱明軍，曹英杰，喬利杰，鄭超楠

1.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046

《中華人民共和國藥典》記載：黃芪，甘、溫，歸肺、脾經，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌之功效，中醫古籍大多把它歸為補益藥中的補氣藥。黃芪具有利尿作用，防己黃芪湯、黃芪桂枝五物湯、桂枝加黃芪湯、黃芪芍藥桂枝苦酒湯等方劑常用于治療水腫，包括心源性水腫、腎病綜合征水腫、黃斑水腫、腦水腫、外科手術水腫等[1-4]。通過分析名老中醫醫案，治療水腫從“脾”論治，推測黃芪的功效為益氣、健脾、補虛。《珍珠囊》載黃芪“甘溫純陽、補諸虛、益元氣、活血生血”。《本經逢原》謂黃芪“性雖溫補，而能通調血脈，流行經絡”，說明黃芪非為純補呆滯之品，而是以益氣補虛之效，行通脈活血之用，對氣虛血瘀之證而言，可謂兩擅其功[5]。含黃芪的治療水腫的方劑中，黃芪除了具有益氣活血功效之外，是否同時具有利尿作用及發揮利尿作用的可能成分尚不清楚。基于此，本研究通過網絡藥理學及大鼠水負荷實驗進行研究。

1 基于網絡藥理學研究黃芪治療水腫的作用機制

1.1 資料與方法

1.1.1 藥物活性成分及相關靶點的獲取基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)及PubChem數據庫檢索黃芪的化學成分，以口服生物利用度(oral availability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18%為條件對化學成分進行篩選，得到黃芪的活性成分，并通過查閱文獻進行補充。在PubChem數據庫中獲取黃芪活性成分的標準Smiles結構，導入Swiss Target Prediction數據庫中對活性成分的作用靶點進行預測，并以Probability≥30%為條件進行篩選。利用TCMSP數據庫獲得黃芪活性成分的相關作用靶點，與Swiss Target Prediction數據庫獲得的作用靶點進行整合，通過Uniprot數據庫對靶點進行標準化。

1.1.2 水腫相關靶點及黃芪治療水腫的潛在靶點的獲取在人類基因數據庫(GeneCards)與人類孟德爾遺傳數據庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)中以“edema”為關鍵詞對疾病靶點進行預測，選取-IgP>5的靶點，并通過Uniprot數據庫對靶點進行標準化。將黃芪活性成分的相關作用靶點與水腫相關疾病靶點導入Veney2.1軟件進行映射，并繪制韋恩圖，獲取黃芪活性成分靶點與水腫相關靶點的共同靶點，即為黃芪治療水腫的潛在靶點。

1.1.3 “活性成分-潛在靶點”網絡構建將黃芪活性成分與潛在靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“活性成分-潛在靶點”相互作用網絡。

1.1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建將潛在靶點導入STRING數據庫(https：//string-db.org/)中，物種設置為“Homo sapiens”，設置最低相互作用閾值≥0.90，并隱藏游離節點，構建PPI網絡并篩選核心基因。

1.1.5 富集分析將黃芪治療水腫的相關作用靶點導入DAVID數據庫進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2 結果

1.2.1 藥物活性成分及相關靶點基于TCMSP及PubChem數據庫檢索黃芪的化學成分，以OB≥30%、DL≥0.18%為條件對化學成分進行篩選后，共得到黃芪的活性成分20個。雖然黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅳ及甜菜堿的DL較低，但文獻研究顯示這些成分有明顯的利尿作用，也納入后續研究。將25個黃芪活性成分導入Swiss Target Prediction數據庫獲取相關靶點，并與TCMSP數據庫中所得靶點合并，共獲得248個黃芪活性成分作用靶點。見表1。

表1 黃芪活性成分信息表

1.2.2 水腫相關靶點及黃芪治療水腫的潛在靶點檢索Gene Cards數據庫與OMIM數據庫篩選出-IgP>5的靶點，共得到710個水腫相關靶點。將248個黃芪活性成分作用靶點與710個水腫相關靶點導入Veney2.1軟件，繪制韋恩圖，取交集，最終獲得黃芪活性成分與水腫的共同作用靶點79個，即為黃芪治療水腫的潛在靶點。見圖1。

圖1 “活性成分-疾病”靶點韋恩圖

1.2.3 “活性成分-潛在靶點”網絡將25個藥物活性成分與79個潛在靶點導入Cytoscape3.7.2軟件進行映射，構建“活性成分-潛在靶點”相互作用網絡圖。網絡中圓形代表活性成分，方形代表潛在靶點，從圖中可知，該網絡共包括95個節點、175條邊。因黃芪25個活性成分中有10個成分未找到與此對應的潛在作用靶點，因此圖中只顯示15個活性成分，其中對應靶點最多的成分為槲皮素、山柰酚、7-O-methylisomucronulatol、芒柄花素、毛蕊異黃酮。結合已報道的基礎動物實驗研究及網絡藥理學靶點數目及相關性，選取芒柄花素、毛蕊異黃酮進行后續實驗驗證研究。見圖2。

圖2 “活性成分-潛在靶點”網絡圖

1.2.4 PPI網絡將79個黃芪治療水腫的潛在靶點導入STRING數據庫并進行分析，獲得PPI網絡圖。此網絡有79個節點、225條邊，平均節點度值為5.7，其中節點表示靶點蛋白，邊代表蛋白與蛋白之間相互作用關系，邊數代表關聯度的大小。富集P<1.0×10-16的靶點，平均度值為31.418，選取度值大于平均值的靶點為核心靶點，共41個，涉及蛋白激酶Bα(probein kinase Bα，AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、腫瘤壞死因子(tumor necrotic factor，TNF)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol 3 kinase adaptor，PIK3CA)等。見圖3。

圖3 黃芪利水作用核心靶點網絡圖

1.2.5 GO功能富集分析將79 個潛在靶點導入DAVID數據庫進行GO功能富集分析，包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)3 個分支。設定閾值P<0.05，共富集到生物過程464個條目，涉及NO生物合成過程的正調控、炎癥、凋亡、雌二醇、應對缺氧、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控等；細胞組分45個條目，涉及細胞膜、細胞質、線粒體、受體復合物、細胞外基質等；分子功能77個條目，涉及細胞因子活性、蛋白結合、酶結合、serine-type肽鏈內切酶活性、血紅素結合、生長因子活性、蛋白同二聚活動等。篩選排名前10位的生物過程、分子功能和細胞組分，用GraphPad Prism 5.0繪圖。見圖4。

圖4 GO功能富集分析

1.2.6 KEGG通路富集分析對篩選得到的 79 個關鍵靶點進行KEGG 通路富集分析，設定閾值P<0.05，共富集得到106條通路，主要涉及TNF 信號通路(16個靶點)、低氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路(13個靶點)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-AKT信號通路(20個靶點)、叉頭狀轉錄因子(forkhead transcription factor，FoxO)信號通路(12個靶點)、p53信號通路(9個靶點)、鞘脂(sphingolipid)信號通路(11個靶點)、T細胞受體(T cell receptor)信號通路(10個靶點)等。說明黃芪主要活性成分的作用靶點分布在不同的代謝通路，多成分、多靶點相互調節是黃芪治療水腫的可能作用機制。選擇前20條信號通絡通過Omicshare軟件制作高級氣泡圖。見圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

2 黃芪及其活性成分的利水作用研究

2.1 材料

2.1.1 動物54只6～8周齡SPF級SD雄性大鼠，體質量(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證編號：SCXK(京)2015-0005。動物每籠4只，飼養在22 ℃、40%濕度的環境下，自由飲食進水。本研究通過河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準(倫理批號：YFYDW2020007)。

2.1.2 藥物與試劑黃芪(北京同仁堂藥店)；呋塞米片(江蘇亞邦愛普森藥業有限公司，國藥準字：HB2021428)。芒柄花素、毛蕊異黃酮標準品(純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司，貨號：B20836、B20847)。

2.1.3 儀器馮氏DXL-D型代謝籠(蘇州馮氏實驗動物設備有限公司)；Waterse26995型高效液相色譜儀、2998型紫外檢測器、Empower化學工作站(美國沃特世公司)；Alltech 2000ES型蒸發光散射檢測器(美國奧泰公司)；CF225D型電子天平(德國賽多利斯集團)。

2.2 方法

2.2.1 藥物制備100 g黃芪經清洗、去除雜質、烘干后質量共計81.3 g。加10倍量水煎煮三次，每次1 h，合并煎煮液，濾過，濾液減壓濃縮得凍干粉26.33 g，使用時用超純水進行配制。

2.2.2 HPLC測定浸膏中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量適量浸膏粉末過四號篩后，精密稱取0.2 g，置具塞錐形瓶中，加入含4%濃氨試液的80%甲醇溶液50 mL，超聲30 min，用含4%濃氨試液的80%甲醇溶液補足失重，搖勻，過濾，精密量取續濾液 25 mL，蒸干后用80%甲醇溶解，轉移至5ml量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續濾液進行檢測。檢測波長260 nm，以AB=乙腈0.3%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫。洗脫程序為0～20 min，10%～30% A；20～25 min，30% A；25～35 min 30%～60%A。毛蕊異黃酮與芒柄花素分離度良好。外標曲線法計算樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量[6]。

2.2.3 水負荷實驗大鼠水負荷實驗相關方法參照2000年人民衛生出版社出版的《中藥藥理研究方法學》。將大鼠置于代謝籠中適應性喂養48 h后，禁食不禁水18 h，稱質量，按照50 mL·kg-1的劑量灌胃給予生理鹽水，進行水負荷實驗。30 min后，按摩腹部排空膀胱尿液，將54只大鼠隨機分為正常組、黃芪小劑量組、黃芪大劑量組、芒柄花素組、毛蕊異黃酮組、呋塞米組，每組9只。依照黃芪相關方劑臨床常用劑量，結合前期預實驗，黃芪劑量分為 60 g、30 g兩個劑量，根據人與大鼠體表面積進行換算，黃芪大、小劑量組大鼠的給藥劑量分別為 2.3 g·kg-1及1.15 g·kg-1。芒柄花素組、毛蕊異黃酮組的灌胃劑量根據浸膏中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量進行計算。選擇呋塞米作為陽性對照藥，經換算后給藥劑量為4.6 mg·kg-1。按照 10 mL·kg-1的劑量灌胃給予相應實驗用藥，正常組灌入同等容積的生理鹽水，分別收集灌胃后0～2 h、2～4 h、4～6 h、7～24 h內的大鼠尿液，共進行3次實驗，每次每組3只大鼠，取平均值作為實驗結果。

2.3 結果

2.3.1 浸膏中芒柄花素和毛蕊異黃酮含量結果顯示，芒柄花素的含量為5 545.674 μg·g-1，毛蕊異黃酮的含量為39.66 μg·g-1。根據高效液相的檢測結果計算得出，芒柄花素和毛蕊異黃酮組大鼠的灌胃劑量分別為9.2 mg·L-1、1.3 g·L-1。見圖6。

圖6 黃芪樣品中芒柄花素、毛蕊異黃酮含量檢測色譜圖

2.3.2 黃芪及芒柄花素、毛蕊異黃酮的利水作用與正常組比較，灌胃后0～2 h、2～4 h及0～6 h內呋塞米組、黃芪小劑量組及毛蕊異黃酮組的尿量顯著增多(P<0.05)；灌胃后4～6 h內呋塞米組、黃芪小劑量組、黃芪大劑量組及芒柄花素組的尿量顯著增多(P<0.05)；灌胃后7～24 h內黃芪小劑量組、毛蕊異黃酮組大鼠的尿量明顯增加(P<0.05)。提示黃芪小劑量、毛蕊異黃酮具有長效利尿的作用。見表2。

表2 黃芪及主要活性成分對大鼠尿量的影響

3 討論

黃芪，豆科多年生草本植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，別名綿芪或綿黃芪，始載于《神農本草經》，“耆，長也。”黃耆色黃，為補藥之長，故名黃耆，今俗作黃芪。以山西、內蒙古武川等地所稱為北芪者，質地好，為正品。戴瑜婷等[6]指出黃芪具有補氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌等功效，臨床用于治療氣虛乏力、納差便溏、中氣下陷、肢腫尿少、氣虛血滯、痹痛麻木等。古代醫家常用黃芪配伍不同中藥治療虛勞、血痹、歷節病、黃汗、黃疸、表虛不固之風水或風濕痹證等[7]。醫圣張仲景在《金匱要略·痙濕暍病脈證并治》云：“風濕，脈浮身重，汗出惡風者，防己黃芪湯主之。”治表虛濕痹證，取防己黃芪湯，以黃芪 30 g 配伍防己 15 g，固表祛風以行水，常加土茯苓、豨薟草利水滲濕，忍冬藤、青風藤、海桐皮祛風利濕[7]。王暴魁教授參考《冷廬醫話》治療水腫案中黃芪的用量(四兩)及補陽還五湯中黃芪的用量(四兩)，并結合自己的臨床經驗，主張采用大劑量生黃芪治療水腫及蛋白尿，并根據病情輕重、患者體質量、患者服用后的反應等調整用量[8]。黃煌指出：“黃芪主治汗出而腫[9]。”自汗皮水、風濕身重者用黃芪，以其利水[10]。

水腫是內科常見病，指體內水液滯留，泛溢肌膚，以眼瞼、頭面、四肢、腹背甚至全身浮腫為特征，《黃帝內經》中水腫病名眾多，包括腎風、風水、水腫、溢飲、石水、涌水等，主要病機為臟腑功能失調致陽氣阻遏，氣化失司，聚水為水腫[11]。《素問·湯液醪醴論》云：“去宛陳莝，微動四極，溫衣，繆刺其處，以復其形；開鬼門，潔凈府……[12]”提出水腫的治療有“開鬼門”“潔凈府”“去菀陳莝”三條基本原則，即發汗，利小便，攻下逐水、通利大便。張志聰謂積者謂之宛，久者謂之陳，宛陳謂之積久之水邪，莖謂之雜草，二者喻指體內積久水邪與久病疲血，“去宛陳莝”指的就是去除體內積久痕滯之物[13]。朱麗穎等總結了《金匱要略》中關于四水的癥狀及治療用方，將四水治療方劑分為以防己黃芪湯與越婢湯為代表方劑的兩類，方為綱體現出從肺論治及從脾論治兩大治療體系[14]。現代醫學認為，引起水腫的主要原因為血管內外液體交換平衡失衡及體內外液體交換平衡失衡，水鈉潴留是引起體內外液體交換平衡失衡的主要原因，心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)分泌減少及腎小管對ANP的利尿作用抵抗，血管加壓素(arginine vasopressin，AVP)或抗利尿激素(antidiuretic hormone，ADH)分泌增加、醛固酮分泌增多等，均可引起腎小球濾過率下降、腎小管對水鈉重吸收增加，引起水鈉潴留，最終導致水腫[15-18]。

針對水腫患者，除積極治療原發病之外，服用利尿劑是最常用的治療方法，也往往能夠起到立竿見影的效果，但對于一些慢性疾病，尤其是心源性疾病引起的水腫，需長期服用利尿劑，以改善水鈉潴留、緩解心衰癥狀、延緩心衰進展，但利尿劑抵抗是不能忽視的一個問題，有研究顯示，約有1/3的心衰患者存在利尿劑抵抗的問題[19]，目前常用的利尿劑，包括袢利尿藥、噻嗪類利尿藥和保鉀利尿藥三類，其中袢利尿藥效果最強，有明顯的“劑量-效應”關系，作用靶點相對單一，利尿效果明顯，臨床應用廣泛。但長期服用利尿劑，不僅會引起電解質紊亂，利尿效果逐漸減弱也是不爭的事實，同時會引起口干而增加飲水次數，繼而引起嚴重鈉潴留，再次形成引發水腫的機體內環境[20]。

中藥成分復雜，多種成分多途徑、多靶點共同發揮作用，能很好地解決單一靶點抵抗問題，并已廣泛應用于臨床，但同時多種成分的交互作用、靶點的相互關聯，也給研究帶來了一定的困難。網絡藥理學是建立在疾病、基因、靶點與藥物相互作用的網絡模型表達基礎上，通過網絡分析系統地觀察藥物對疾病網絡的影響，從而揭示多分子藥物協同作用的新學科，具有整體、協同和動態的特點[21]，這一特點與中醫學“整體觀”和“辨證施治”的觀點不謀而合。針對確定中藥及中藥復方活性成分、中醫癥候的研究，闡明配伍規律、解釋方劑-癥候關系和復方優化尋找新藥等方面具有一定優勢[22-23]。

現代研究發現，黃芪的主要成分包括皂苷類(黃芪皂苷甲、乙、丙等)、黃酮類(芒柄花素，毛蕊異黃酮，3-羥基-9，10-二甲氧基紫檀烷等)、氨基酸類(8-氨基丁酸、天冬酰胺等)、多糖類(鼠李糖、蔗糖、葡萄糖醛酸等)以及膽堿、香菜堿、香豆素等[24]。研究表明，黃芪利水作用功效可能與調節水與電解質平衡、調控水通道蛋白、保護腎臟微組織結構、修復黏膜損傷、糾正腸道菌群微生態動態平衡等作用有密切聯系[25]。汪賢聰等研究發現黃芪通過顯著改善腎病綜合征患者精氨酸AVP系統提高腎小球濾過率，進而實現其利尿作用[26]。張永娜等[27]研究發現黃芪注射液可明顯促進水負荷模型大鼠尿液中Na+、Cl-的排泄，未發現黃芪注射液對尿液中K+的排泄與尿液pH值有影響。

本研究通過TCMSP數據庫、PubChem數據庫以OB≥30%、DL≥0.18%為條件，篩選出黃芪共20個活性成分，結合文獻查閱，共得到25個活性成分。通過Veney2.1軟件獲取79個黃芪藥物成分與水腫共同作用靶點，涉及的活性成分共14個，涉及最多的成分為黃酮類(芒柄花素、毛蕊異黃酮、檞皮素、異鼠李素、二氫異黃酮、山柰酚)、皂苷類(常春藤皂苷元、甜菜堿)、氨基酸類(葉酸)，靶點最多、相關度最高的為黃酮類，主要為槲皮素、7-O-methylisomucronulatol、山柰酚、芒柄花素、毛蕊異黃酮。結合文獻研究、網絡藥理學靶點數目及相關性，本研究選取刺芒柄花素、毛蕊異黃酮進行后續實驗驗證研究。

通過大鼠水負荷實驗證實，黃芪小劑量具有明顯的利尿作用，利尿強度弱于呋塞米片，但作用持久，持續觀察24 h發現，前6 h呋塞米組尿量明顯增加，7～24 h尿量增加不明顯；黃芪小劑量組0～6 h、7～24 h兩個時間段尿量均增加，且較正常組具有統計學意義。黃芪大劑量組前6 h尿量明顯減少，且尿液顏色明顯變黃，7～24 h尿量與正常組相當。毛蕊異黃酮組、芒柄花素組0～6 h、7～24 h 兩個時間段尿量均增加，毛蕊異黃酮組尿量增加更明顯且具有統計學意義。此研究證實，黃芪具有利尿作用，并且與劑量有關系，黃芪30 g利尿作用明顯，黃芪60 g尿量較正常組減少，主要利尿作用可能與毛蕊異黃酮、芒柄花素相關，需進一步研究證實。雷根平受《冷廬醫話》中“芪米湯”一案啟發，經臨床多年實踐發現，對于各種原因引起的水腫，凡屬氣虛，僅重用黃芪一味即可達到利尿功效，此功效需用量在 90 g 以上方能見明顯療效。視水腫之嚴重程度，大劑量可用至100～200 g，超大劑量可至300 g，稱之為“獨芪湯”[28]。現代患者大多以慢性病為主，病情周期長，加之大多藥物采用人工種植，藥力較古時相差較大；且患者期望值亦普遍較高[29]。“中醫不傳之秘在于量”，因此有關劑量的應用還需進一步研究，找到黃芪最佳利尿效果的使用劑量。

通過KEGG通路富集分析及GO功能富集分析發現，生物過程涉及NO生物合成過程的正調控、炎癥、凋亡、雌二醇、應對缺氧、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正調控等；細胞組分涉及細胞膜、細胞質、線粒體、受體復合物、細胞外基質等；細胞組分涉及細胞因子活性、蛋白結合、酶結合、serine-type肽鏈內切酶活性、血紅素結合、生長因子活性、蛋白同二聚活動等方面。黃芪抗水腫靶點主要涉及TNF信號通路、HIF-1、PI3K-Akt信號通路、FoxO 信號通路、p53信號通路、Sphingolipid信號通路、T cell receptor等信號通路。水腫是多種疾病的并發癥狀，包括心力衰竭、腎功能不全、風濕免疫相關疾病等。《素問·經脈別論》中“飲入于胃，游縊精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調水道，下輸膀胱，水精四布，五經并行”。《素向·水熱穴論》之水腫形成“其本在腎，其末在肺”的論述，體內水液的運行依靠肺氣的通調、脾氣的轉輸、腎氣的開闔及膀胱的氣化，因而小便通利。相關研究已證明，PI3K-AKT信號通路、FoxO 信號通路、p53信號通路、Sphingolipid信號通路、T cell receptor等信號通路與肺、脾、腎、心生理功能及相關疾病的發生發展密切相關，也間接說明黃芪利水消腫功效與調節整體身體機能有關。

本研究通過網絡藥理學初步聚焦了黃芪的主要作用成分、可能涉及的生物學過程及作用靶點。通過大鼠水負荷實驗，初步證實了黃芪具有利尿作用，且與黃酮類成分密切相關；但對于心衰、腎病綜合征引起的水腫，黃芪是否具有同樣的利尿效果，涉及的生物學過程及作用通路、作用靶點是否一致，仍需結合蛋白組學、代謝組學等相關研究方法進一步明確。