補腎泄濁化瘀通絡方對膜性腎病的腎保護作用*

董玥，閆慧明，多慧玲，趙雯紅，孫姍姍，陳文軍

石家莊市中醫院，河北 石家莊 050000

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是常見和難治的腎小球疾病，其發病機制尚不明確，西醫以糖皮質激素聯合免疫抑制劑來降低蛋白尿、提高血漿蛋白、降低血脂、保護腎功能[1]，但伴有股骨頭壞死、肝腎毒性等副作用，停藥后易復發，且仍有近30%的患者會在5～10年內進展為終末期腎疾病[2]，對家庭和社會造成嚴重的負擔，如何有效的治療MN是腎內科面臨的嚴峻挑戰。隨著中醫對MN認識和研究的加深發現，中西醫結合能夠有效提高整體治療效果[3-4]，降低不良反應，受到廣大患者的歡迎。“通因通用”出自《素問·至真要大論》，是指用通利藥治通利病癥的方法，適用于因實邪內阻出現通泄癥狀的真實假虛證[5]。MN患者體內大量免疫復合物沉積腎小球基底膜，造成基底膜斷裂，蛋白尿升高，形成通利的假象，本質是不通[6]。趙玉庸教授總結“腎絡瘀阻”是MN的基本病機特點[7]，而活血化瘀通絡是治療MN蛋白尿的基本原則。此次研究建立MN大鼠模型觀察基于通因通用理論補腎泄濁化瘀通絡方治療MN的效果，并初步闡明其作用機制。

1 材料

1.1 動物100只健康雄性 SPF級SD大鼠，體質量(170±10) g，來自河北醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(冀)2020-001。飼養于河北中醫學院SPF級動物房，25 ℃恒溫，相對濕度50%～60%，12 h明暗交替，適應性喂養1周，期間可自由飲水、進食。檢測尿蛋白均為陰性后用于后續實驗。

1.2 藥物與試劑鹽酸貝那普利片(深圳信立泰藥業股份有限公司，國藥準字H20054771，規格：5 mg)；黃芪、土茯苓、積雪草、丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎(石家莊市中醫院中藥房提供)。Trizol試劑(美國Invitrogen公司，貨號：10296028)；熒光定量PCR試劑(美國Bio-Rad公司，貨號：10039761)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo Fisher Scientifi公司，貨號：K1691)；陽離子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin，C-BSA)凍干粉[依科賽生物科技(太倉)有限公司，貨號：excell.C-BSA00025]；弗氏不完全佐劑 (德國Biofroxx公司，貨號：2203ML010)；雙縮脲試劑(AB液，北京百奧萊博科技有限公司，貨號：GL1492)；山羊血清(艾美捷科技有限公司，貨號：005-000-121)；平足蛋白抗體(Podoplanin，美國Abcam公司，貨號：ab109059)；α-平滑肌肌動蛋白抗體(α- smooth muscle actin，α-SMA，美國Abbkine公司，貨號：ABM0052)；山羊抗大鼠IgG H&L(美國Abcam，貨號：ab150157)；DAB溶液(二氨基聯苯胺法，西安齊岳生物科技有限公司，貨號：100582)；大鼠總膽固醇(total cholesterol，TC)ELISA試劑盒(上海佰利萊生物科技有限公司，貨號：BLL100955E)；大鼠三酰甘油(triglyceride，TG)、D-二聚體(D-dimer，D-D)ELISA試劑盒(上海科博瑞生物科技有限公司，貨號：KBR-PD5878S、KBR-PD5597S)；大鼠總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(albumin，Alb)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)ELISA試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司，貨號：SP13059、SP13429、SP30121、SP12839)。

1.3 儀器7170A型全自動生化分析儀(日本日立公司)；A2-8型電熱恒溫水浴鍋(天津太斯特設備廠)；TDL-60C型高速離心機(上海安亭科技儀器廠，離心半徑：13.5 cm)；MIKROTOME-M型石蠟切片機(美國PERKINELMER公司)；CX33型顯微鏡(日本Olympus公司)；Image-Pro Plus 7型多功能真彩色細胞圖象分析管理系統(美國Media Cybernetics 公司)；VORTEX-5型渦旋混合器(海門市其林貝爾公司)；NanoDropTM3300型分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)；H7500型透射電子顯微鏡(日本HITACHI株式會社)；7500 Fast Dx型熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 藥物制備取補腎泄濁化瘀通絡方組方藥材(黃芪20 g、土茯苓15 g、積雪草15 g、丹參15 g、川芎12 g、地龍9 g、水蛭3 g、全蝎3 g)，經水浸泡后煎煮，濃縮至每毫升煎煮液含生藥2.5 g備用。

2.2 動物分組、造模與給藥從100只大鼠中隨機選擇15只作為空白對照組，剩余85只參照Border法[8]采用 C-BSA尾靜脈注射法復制膜性腎病動物模型，具體如下：1 mg C-BSA凍干粉加入到0.5 mL PBS中，并與等量弗氏不完全佐劑混合，超聲充分乳化后取適量乳化液于大鼠腋下、腹股溝多點皮下注射進行預免疫(共6個部位，每個部位 0.05 mL)，隔日1次，共3次。1周后進行正式免疫，將2.5 mg C-BSA加入到1 mL PBS中進行尾靜脈注射，每周3次，每次1 mL，共注射4周。4周后使用雙縮脲試劑(AB液)檢測大鼠24 h尿蛋白，當大鼠24 h尿蛋白超過20 mg/24 h時，視為造模成功。將85只造模成功的大鼠隨機分為模型組、貝那普利組、補腎泄濁化瘀通絡方低、中、高劑量組。貝那普利組給予10 mg·kg-1的鹽酸貝那普利溶液灌胃，補腎泄濁化瘀通絡方低、中、高劑量組大鼠分別給予 7.5 g·kg-1、15.0 g·kg-1、22.5 g·kg-1的補腎泄濁化瘀通絡方溶液，空白對照組和模型組給予蒸餾水灌胃，每只 3 mL，每日1次，連續4周。

2.3 24 h尿蛋白檢測采用代謝籠分別在造模前、給藥前和給藥后收集各組大鼠的24 h尿液，檢測24 h尿蛋白含量，所有操作嚴格按照試劑盒說明書步驟執行。

2.4 全自動生化分析儀測定血清相關指標末次給藥后腹腔注射水合氯醛麻醉，經腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min后分離血清，采用全自動生化分析儀測定血清TC、TG、D-D、TP、Alb、ALT、AST等生化指標的水平。

2.5 HE染色觀察腎小球基底膜、足細胞的病理變化取血后斷頭處死大鼠，摘除左腎，取適量腎皮質固定后包埋、切片，HE染色后在光鏡下觀察腎小球基底膜、足細胞的病理變化。

2.6 免疫組化法檢測腎組織Podoplanin、α-SMA的表達水平所有大鼠均采用免疫組化法檢測腎組織Podoplanin、α-SMA陽性表達情況。石蠟切片經烘烤、脫蠟后室溫孵育30 min，加入枸櫞酸鹽酸緩沖液進行抗原修復，加入10%山羊血清封閉，加入Podoplanin、α-SMA一抗(稀釋比例為1200)，4 ℃冰箱孵育過夜；次日復溫后滴加Podoplanin、α-SMA二抗(稀釋比例為110 000)孵育30 min；使用DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察陽性表達；每張切片隨機選擇5個非重疊視野，通過Image Pro Plus軟件測算平均積分光密度，以此反映Podoplanin、α-SMA陽性表達情況。

2.7 實時熒光定量PCR測定腎組織PodoplaninmRNA、α-SMAmRNA的表達Trizol法提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄獲得cDNA，反轉錄體系(10 μL)：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL；PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I 0.5 μL；隨機引物(0.2 μg·μL-1) 0.5 μL；總RNA 0.5 μg；DEPC水補至10 μL。取適量cDNA進行熒光定量PCR檢測，擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s；共40個循環。以β-actin為內參，通過Ct值和標準曲線計算目的RNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結果

3.1 24 h尿蛋白比較造模前，各組大鼠24 h尿蛋白水平無明顯差異(P>0.05)；給藥前，與空白對照組比較，其余組大鼠24 h尿蛋白水平均明顯升高(P<0.05)，且均超過20 mg/24 h，表示造模成功。給藥后，與空白對照組比較，模型組大鼠的24 h尿蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠的24 h尿蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，補腎泄濁化瘀通絡方高劑量組大鼠的24 h尿蛋白水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠24 h尿蛋白水平比較

3.2 血清生化指標比較與空白對照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG、D-D的水平明顯升高(P<0.05)，TP、Alb的水平明顯降低(P<0.05)，而ALT、AST的水平無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中TC、TG、D-D的水平明顯降低(P<0.05)，TP、Alb的水平明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清生化指標比較

3.3 各組大鼠腎組織病理變化比較空白對照組大鼠的腎組織無明顯異常；模型組基底膜增厚，腎小球體積增大，伴有輕度系膜增生和腎小管上皮細胞空泡變性，腎間質無明顯病變；各給藥組基底膜增厚減輕，腎小球體積增大改善，輕度系膜增生和腎小管上皮細胞空泡變性明顯減少。見圖1。

3.4 各組大鼠腎組織Podoplanin、α-SMA陽性表達情況比較與空白對照組比較，模型組Podoplanin蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)，α-SMA蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組Podoplanin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，α-SMA蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)；與貝那普利組比較，補腎泄濁化瘀通絡方各劑量組Podoplanin蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)，α-SMA蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、圖3及表4。

表4 各組大鼠Podoplanin、α-SMA蛋白表達情況

注：A：空白對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：補腎泄濁化瘀通絡方低劑量組；E：補腎泄濁化瘀通絡方中劑量組；F：補腎泄濁化瘀通絡方高劑量組圖2 各組大鼠腎組織Podoplanin陽性表達(×400)

注：A：空白對照組；B：模型組；C：貝那普利組；D：補腎泄濁化瘀通絡方低劑量組；E：補腎泄濁化瘀通絡方中劑量組；F：補腎泄濁化瘀通絡方高劑量組圖3 各組大鼠腎組織α-SMA陽性表達(×400)

3.5 腎組織PodoplaninmRNA、α-SMAmRNA表達情況比較與空白對照組比較，模型組大鼠腎組織PodoplaninmRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)，α-SMAmRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各給藥組PodoplaninmRNA的表達水平顯著升高(P<0.05)，α-SMAmRNA的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠Podoplanin mRNA、α-SMA mRNA表達情況比較

4 討論

MN是現代醫學名詞，中醫古籍中并無該病明確的記載。由于該病以高度水腫為主要臨床表現，故中醫學將其納入“水腫”的范疇。《景岳全書》記載：“凡水腫等證，乃肺脾腎三臟相干之病”。現代中醫學家根據多年臨床經驗總結，脾腎虧虛、腎絡瘀阻為貫穿MN的基本病機[9]，以脾腎虧虛為本，濕濁瘀血為標。本病多發于中老年人，先天稟賦不足致脾腎虧虛，水液失其運化，內停泛溢于肌膚，發為水腫[10-11]。脾虛則清不得升，濁不得降，腎虛則固攝無權，久之精微下泄，在現代醫學中表現為尿蛋白水平異常。先天不足，加之后天失養，脾腎虧虛至氣血運行不暢，發為血瘀。“瘀”的形成則加重氣血運行障礙、體虛和脾腎虧虛，形成惡性循環[12]。本次研究從“通因通用”傳統理論出發，結合基本病機，認為疏通“腎絡”為治療關鍵[13-14]，當以補腎泄濁化瘀通絡方治療。方中黃芪為君藥，善于健脾補腎、益氣固表；臣藥土茯苓、積雪草解毒化濁，丹參、川芎行氣活血、破血逐瘀，合黃芪升降并用、攻補兼施，以達補腎氣、化瘀濁、通腎絡之效；并佐以蟲類藥地龍、水蛭、全蝎，以求“追拔沉混氣血之邪，搜剔絡中混處之邪”，可破血逐瘀、入絡搜剔、松透病根、直達病所。諸藥共用，共奏補腎泄濁、化瘀通絡之功。現代藥理研究也顯示，黃芪具有調節免疫，減少腎性尿蛋白的功效[15]，還可調節脂質代謝，保護腎臟。

通過對比不同組大鼠腎組織的病理變化發現，補腎泄濁、化瘀通絡中藥對MN具有良好的治療效果，表現為基底膜增厚減輕，腎小球體積增大改善，輕度系膜增生和腎小管上皮細胞空泡變性明顯減少。蛋白尿是體現腎臟病變程度的重要指標，高水平蛋白尿也是導致MN向終末期發展的危險因素[16-17]，控制其水平是MN治療的關鍵，并可延緩腎臟疾病的進展。同時，MN患者大多伴有不同程度低蛋白血癥和血脂代謝紊亂[18]。本次研究結果顯示，給藥后大鼠24 h尿蛋白定量水平明顯降低，且以中藥高劑量組降低最為顯著；通過對血脂、腎功能相關指標觀察顯示，與模型組比較，各給藥組TC、TG、D-D明顯降低，TP、Alb明顯升高，證實補腎泄濁化瘀通絡方通過降低24 h尿蛋白定量、提高血清白蛋白，改善血脂代謝，降低腎損傷，延緩疾病進展。

隨著對MN研究不斷地深入，發現足細胞轉分化是導致蛋白尿的重要因素[19]。足細胞是腎小球濾過膜的重要組成部分，是腎小球作為濾過屏障的最后一道防線[20]，其附著于腎小球基底膜外側，足細胞破壞、丟失使濾過屏障完整性遭到破壞，蛋白尿形成。足細胞轉分化是足細胞損傷的形式之一[21]。在正常生理狀態下，足細胞無法生殖再生，一旦發生病理改變則可恢復增殖再生的能力，從樹枝分叉狀變成鵝卵石狀、梭形，導致基底膜增厚[22]，形成“釘突”，細胞外基質類蛋白增多，導致腎纖維化發生。足細胞相關蛋白水平降低，間充質類蛋白水平升高，腎小球濾過膜屏障遭到破壞[23]，從而引起蛋白尿。Podoplanin是足細胞裂孔膜相關蛋白[24]，對于維持足突結構和裂孔膜完整性具有重要作用，發生足細胞轉分化后，足細胞破壞增多、數量減少，其表達亦隨之減少[25]；α-SMA是新型足細胞間充質標志物蛋白之一，相關研究證實，其在足細胞間充質轉化過程中具有較高的參與度[26]。發生足細胞轉分化后，成熟的上皮細胞表型標志性蛋白表達降低或消失，導致足突融合、腎小球濾過屏障受損，導致蛋白尿的發生[27]。本次實驗研究顯示，經過中藥干預后，Podoplanin蛋白的表達量升高，α-SMA蛋白的表達量降低，說明補腎泄濁化瘀通絡方通過上調Podoplanin蛋白表達及下調α-SMA蛋白表達抑制足細胞轉分化，維持腎小球濾過屏障功能的完整性，保護腎組織，與陳玲玲[28]等學者研究得出的結論具有一致性。

綜上所述，補腎泄濁化瘀通絡方能夠明顯降低MN大鼠尿蛋白，提高血清白蛋白，改善血脂代謝，降低腎損傷，延緩疾病進展，其作用機制可能與上調Podoplanin蛋白表達，下調α-SMA蛋白表達，抑制足細胞轉分化有關。該作用機制可能是補腎泄濁化瘀通絡方治療MN的作用機制之一，仍需在今后的實驗研究中不斷深入。