藏藥十五味賽爾斗丸治療豚鼠膽囊炎的作用機制研究*

陳蔚，馬騰飛，武慧超，2，劉媛媛，仁青東主，張金魁，任小巧，2

1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學民族醫藥學研究所，北京 100029；3.青海大學，青海 西寧 810016；4.青海藏醫藥研究院，青海 西寧 810016

膽囊炎(cholecystitis)是指膽囊壁的炎癥反應，是臨床常見和多發的膽系疾病，常由膽囊管梗阻、細菌感染、化學性刺激、高脂飲食等所誘發的炎性病變所致[1]。根據發病緩急和經過可分為急性膽囊炎和慢性膽囊炎；根據是否伴有結石可分為結石性膽囊炎和非結石性膽囊炎。藏藥十五味賽爾斗丸具有解熱鎮痛、抑菌、消炎、消腫、利膽溶石、排石，提高機體免疫功能等作用，臨床用于治療膽囊炎、膽囊結石、膽總管結石及肝內膽管結石[2]，但其作用機制及有效成分尚不清楚。鑒于此，本研究基于系統生物學理論，通過網絡藥理學的方法結合分子對接技術對治療的關鍵靶點、通路進行預測，分析其潛在作用機制，然后應用動物模型實驗驗證預測出的核心靶點和通路，多角度分析藏藥十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的作用機制。

1 基于網絡藥理學研究十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的作用機制

1.1 資料與方法

1.1.1 十五味賽爾斗丸活性成分的獲取及相關靶點預測通過檢索PubMed(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、CNKI、萬方、維普等文獻數據庫，結合中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)、中藥分子機制的生物信息學分析工具(bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine，BATMAN-TCM)等數據庫，搜集十五味賽爾斗丸各藥的化學成分。將獲取的化學成分在PubChem數據庫中下載SDF格式文件，逐一上傳至SwissADME(http：//swissadme.ch/)進行活性成分篩選。滿足腸胃吸收(gatrointestinal absortion)為“High”，且5種類藥性(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)結果中有2個及2個以上為“Yes”的成分視為活性成分。再通過蛋白質數據庫Swiss Target Prediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)篩選出活性成分的對應靶點，整理并去重后作為十五味賽爾斗丸活性成分的靶點，以供后續分析。

1.1.2 膽囊炎相關靶點預測及十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點獲取在人類基因數據庫(GenCards，https：//www.genecards.org)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https：//omim.org)中以 cholecystitis、chronic cholecystitis、acute cholecystitis、gallstones和cholelithiasis為關鍵詞進行檢索，獲得膽囊炎相關的疾病靶點。將十五味賽爾斗丸有效成分的相關靶點與膽囊炎相關靶點進行映射，繪制venny圖，所得交集靶點即為十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點。

1.1.3 “藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡的構建將十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點、活性成分和疾病導入Cytoscape3.8.2軟件，構建“藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡圖，并通過“Network Analyzer”進行網絡拓撲分析，篩選十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關鍵成分。

1.1.4 蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡的構建將潛在靶點輸入STRING數據庫(https：//www.string-db.org/)，以“Homo sapiens”為分析條件，設置置信度蛋白質參數>0.9，去除散在靶點，得出蛋白質相互作用網絡關系，導入Cytoscape3.8.2軟件中進行可視化處理，獲得PPI網絡。通過網絡拓撲分析獲得核心靶點。

1.1.5 富集分析將潛在靶點導入DAVID數據庫(https：//David.ncifcrf.gov/summary.jsp)進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，以P≤0.5為條件進行篩選并排序，選擇排名前20的條目，運用微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn/)在線作圖工具作出氣泡圖。

1.1.6 分子對接通過PubChem數據庫獲得十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關鍵成分的分子結構，利用Chem3D進行格式轉化及能量最小化，將所得結構導入Schr?dinger軟件建立數據庫，通過加氫、結構優化、能量最小化后作為分子對接的配體分子數據庫。通過蛋白質數據庫(https：//www.rcsb.org/)獲得靶點蛋白的晶體結構，導入Maestro11.9平臺，用Schr?dinger的Protein Preparation Wizard模塊對蛋白進行去除結晶水、補加缺失的氫原子、修復缺失鍵信息、修補缺失肽段處理，最后通過OPLS3e力場對蛋白進行約束能量最小化以及幾何結構的優化，并保存為受體。采用Schr?dinger Maestro軟件中的Glide模塊進行分子對接。選取蛋白的原配體或者預測活性位點作為12 ?盒子的質心，最后通過標準方法(standard precision，SP)完成分子對接及篩選，采用Pymol2.1進行可視化分析。

1.2 結果

1.2.1 十五味賽爾斗丸活性成分及相關靶點通過篩選與整理，十五味賽爾斗丸組方的15味中藥中納入12味中藥，分別為印度獐牙菜(8)、小檗皮(5)、角茴香(35)、波棱瓜子(16)、榜嘎(11)、兔耳草(8)、五靈脂(75)、石榴子(4)、金腰草(4)、訶子(9)、川木香(12)、矮叢鳳毛菊(6)，滿足要求的活性成分193個。經Swiss Target Prediction數據庫獲取 1 069 個活性成分相關靶點。見表1。

表1 十五味賽爾斗丸部分活性成分信息

1.2.2 膽囊炎相關靶點及十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點在GenCards數據庫、OMIM數據庫檢索膽囊炎相關的疾病靶點，去重后共得到膽囊炎相關靶點702個。將十五味賽爾斗丸有效成分的相關靶點與膽囊炎相關靶點進行映射，繪制venny圖，獲得141個交集靶點，即為十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點。見圖1。

圖1 交集靶點韋恩圖

1.2.3 “藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡將十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的潛在靶點、活性成分和疾病導入Cytoscape3.8.2軟件，獲得“藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡圖。該網絡中包含338個節點(node)和2 166條邊(edge)。通過“Network Analyzer”進行網絡拓撲分析，篩選出4個度值(degree)大于2倍平均值、介數中心性(betweenness centrality，BC)大于平均值的活性成分，即十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關鍵成分，分別是N-methylcorydaldine、氧化血根堿、金圣草(黃)素和7-羥基香豆素。見表2，圖2。

表2 十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關鍵成分拓撲參數

圖2 “藥物-活性成分-潛在靶點-疾病”網絡

1.2.4 PPI網絡及核心靶點將141個潛在靶點輸入STRING數據庫，得出蛋白質相互作用網絡關系，導入Cytoscape3.8.2軟件中獲得PPI網絡。該網絡中節點越大，顏色越深，則度值越大。網絡拓撲分析，根據degree、BC、接近中心性(closeness centrality，CC)、集聚系數(clustering coefficient)及節點鄰居的平均連接度(neighborhood connectivity，NC)篩選出degree、BC均大于平均值的靶點，即為十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的核心靶點，共30個。排名前20位的核心靶點包括磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α(phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase1，MAPK1)、MAPK3、腫瘤蛋白53(tumor protein 53，TP53)、蛋白激酶B(protein kinase1，AKT1)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Harvey-RAS(HRAS)、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、凝血因子Ⅱ(coagulation factor II，F2)、雌激素受體1(estrogen receptor，ESR1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、IL-8(CXCL8)、緩激肽受體B2(recombinant bradykinin receptor B2，BDKRB2)、BDKRB1、Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、1-磷酸鞘氨醇受體1(sphingosine 1-phosphate receptor 1，S1PR1)、發動蛋白1(dynamin 1，DNM1)、組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase-9，MMP-9)。見圖3、圖4及表3。

圖3 PPI網絡

表3 排名前20位的核心靶點拓撲參數

圖4 核心靶點PPI網絡

1.2.5 富集分析將潛在靶點導入DAVID數據庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集分析共得到661個條目，其中包含生物過程(biological process，BP)491個，細胞組分(cellular component，CC)62個，分子功能(molecular function，MF)108個。生物過程主要涉及對缺氧的反應(response to hypoxia)、蛋白質磷酸化的正調控(positive regulation of protein phosphorylation)、對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)等。細胞組分主要涉及質膜(plasma membrane)、細胞外間隙(extracellular space)、細胞表面(cell surface)、小窩(caveola)等。分子功能主要涉及酶結合(enzyme binding)、血紅素結合(heme binding)、氧結合(oxygen binding)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、RNA 聚合酶 II 轉錄因子活性(RNA polymerase II transcription factor activity)、配體激活的序列特異性 DNA 結合(ligand-activated sequence-specific DNA binding)等。KEGG通路富集分析共得到113條通路，主要涉及缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)信號通路、催乳素(prolactin)信號通路、甲狀腺激素(thyroid hormone)信號通路、TNF信號通路等。見圖5、圖6。

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

圖6 KEGG信號通路分析氣泡圖

1.2.6 分子對接以N-methylcorydaldine、氧化血根堿、金圣草(黃)素及7-羥基香豆素為配體分子，以PIK3CA、TNF、IL-6、EGFR、AKT1為受體進行分子對接。結果顯示，結合能均小于-6 kcal·mol-1，提示核心活性成分與關鍵靶點具有較高的匹配度和較好的結合活性，其中各化合物與TNF的結合能最低。見表4，圖7。

表4 分子對接結果

圖7 分子對接結果

2 基于NF-kB通路研究十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的作用機制

2.1 材料

2.1.1 動物60只雌雄各半清潔級豚鼠，體質量(350±50) g，由北京艾尼特科技有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2016-0007。實驗動物分籠飼養于北京中醫藥大學動物房，室溫維持在(25±1)℃，濕度維持在(65±5)%，12 h循環交替光照(光照時間為730到1930)，控制干擾噪音及光線。在開始實驗前，動物適應性飼養1周，采用普通動物飼料+蔬菜(大白菜、娃娃菜、小青菜和生菜)或維生素C，自由飲食、飲水。實驗操作符合實驗動物倫理學的相關規定，所有實驗豚鼠的給藥、灌胃、喂養等嚴格遵照實驗動物倫理協會規定的動物倫理福利條款。實驗經北京中醫藥大學醫學與實驗動物倫理委員會審查通過，動物倫理審查編號：BUCM-4-202012100202-4120。

2.1.2 藥物與試劑十五味賽爾斗丸(青海久美藏藥藥業有限公司，批號：20200701)；鹽酸林克霉素(上海旭東海普藥業有限公司，批號：AM191006)；消炎利膽片(廣東羅浮山國藥有限公司，批號：F20A005)；總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1200、PC0020)；通用逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司，貨號：11141ES60、11201ES08)；核轉錄因子kappa-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)p65 抗體(美國proteintech公司，貨號：10745-1-AP)；羊抗兔HRP二抗(北京博奧森生物技術有限公司，貨號：bs-0295G-HRP)；TNF-α ELISA試劑盒(江萊生物技術有限公司，貨號：JL13090)；引物序列在上海晶萊生物技術有限公司北京晶萊生物實驗室設計，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2.1.3 儀器3120000259型2～200 μL精密移液器(德國Eppendorf公司)；Synergy H4型酶標儀(美國Biotek公司)；ST-36WT型洗板機(上海科華實驗系統有限公司)；HDPN-88型電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)；80-2型臺式低速離心機(離心半徑：10 cm，上海醫療器械技術有限公司)；Genesy 98T型普通PCR儀(西安天隆科技有限公司)；MA-6000型實時熒光定量PCR儀、MA-6000型核酸檢測儀(蘇州雅睿生物技術股份有限公司)、BSH-C2型組織破碎儀(杭州遂真生物技術有限公司)；5200型全自動化學發光圖像分析系統(上海天能科技有限公司)；1645070型電泳儀、BE6085型電轉儀(美國Bio-rad公司)。

2.2 方法

2.2.1 藥物制備十五味賽爾斗丸醇提物的制備：用電子天平準確稱量十五味賽爾斗丸300 g，碾碎后加入10倍量 70%乙醇，回流提取1 h后，將提取液移置于旋轉蒸發儀中加熱旋蒸，溫度為60～70 ℃，當藥液體積為0.5～1 L時，倒出并放置于水浴鍋中蒸干，再放置于真空干燥箱里面干燥，所得浸膏冷凍干燥后粉碎，使用時用生理鹽水配置；十五味賽爾斗丸水溶液和消炎利膽片溶液的制備：十五味賽爾斗丸丸劑及消炎利膽片使用時分別研成粉末，按照給藥劑量溶于生理鹽水。

2.2.2 膽囊炎模型制備、動物分組與給藥隨機從60只豚鼠中選12只為正常組，其余48只豚鼠皮下注射30 mg·kg-1鹽酸林可霉素，每天1 次，連續7 d復制豚鼠膽囊炎模型。當造模豚鼠出現蜷縮，精神萎靡，進食減少，尿黃，體質量明顯降低的現象；且病理檢查發現膽囊形態改變，出現明顯的炎癥，膽汁渾濁，可見黑色的泥沙樣結石等時視為模型建立成功。采用隨機數字表法將造模成功的48只豚鼠隨機分為模型組、十五味賽爾斗丸水溶液組、十五味賽爾斗丸醇提組、消炎利膽片組，每組12只。根據《實驗動物學》不同動物間體表面積折算等效劑量系數表可知，體質量為70 kg的人與體質量為0.4 kg的豚鼠之間換算系數為0.031[3]，結合比率按公式計算本實驗中豚鼠的用藥劑量為：豚鼠的給藥劑量=0.031×人的每日劑量4.5 g÷豚鼠體質量0.4 kg=0.35 g·kg-1，即十五味賽爾斗丸水溶液組的給藥劑量為0.35 g·kg-1；由于十五味賽爾斗丸醇提物的成膏率為35%，十五味賽爾斗丸醇提組的給藥劑量為0.12 g·kg-1；消炎利膽片組的給藥劑量 0.36 g·kg-1；造模成功后，各給藥組給予相應劑量的藥物進行灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，每天1次，連續15 d。

2.2.3 病理學檢查末次給藥后禁食禁水12 h，稱量豚鼠的質量，按3.5 mL·kg-1劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，腹主動脈取血后，結扎膽囊管，摘膽囊抽取膽汁，將膽囊分為三份，取一份豚鼠膽囊標本，以10%甲醛固定24 h后換成新鮮的10%甲醛繼續固定24 h。常規脫水、石蠟包埋，切片，HE 染色，顯微鏡下觀察其病理學改變。

2.2.4 TNF-α含量的測定用ELISA法測定血清和膽汁樣本中TNF-α的含量，在450 nm波長處檢測各孔的OD值。在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值為縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

2.2.5 實時熒光定量PCR檢測膽囊中NF-κB、TNF-α的mRNA表達提取每只豚鼠膽囊組織總 RNA，采用通用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA后進行PCR反應。反應體系：5 μL cDNA、5 μL GoTaq反應液、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、20 μL無菌超純水。將PCR 反應混合液置于7500 Real Time PCR System進行擴增，擴增程序：95 ℃ 預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 20 s，共40 個循環。采用 2-△△CT相對定量法計算各樣本中TNF-αmRNA、NF-κBmRNA的相對表達量。引物序列見表5。

表5 引物序列

2.2.6 Western Blot檢測膽囊組織中NF-κB蛋白表達水平分別于各組取適量膽囊組織，按照 19 的比例加入含蛋白酶抑制劑的裂解液，4 ℃震蕩至組織塊全部破碎，置于冰上裂解20 min，4 ℃，12 000 rpm·min-1離心 20 min，取上清。上樣等量蛋白經過電泳，轉移到PVDF膜上，轉膜條件為 200 mA 90 min(0.45 μm膜)，5% 脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入相應的一抗(NF-κB、GAPDH稀釋比例分別為12 000和15 000)，4 ℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜3次，每次10 min。加入二抗(稀釋比例為15 000)，室溫孵育1 h。TBST充分洗滌PVDF膜3次，每次10 min。將ECL試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按11比例混勻，滴加適量工作液于PVDF膜上，采用全自動化學發光圖像分析系統進行曝光，并使用Image J軟件分析灰度值。

2.3 結果

2.3.1 十五味賽爾斗丸對膽囊炎豚鼠膽囊組織病理的影響正常組膽囊形態正常，未見病理學改變。模型組豚鼠膽囊明顯腫大，組織局部增生、水腫或壞死，炎性細胞浸潤，黏膜水腫、散在性脫落、滲血。經過藥物治療后，膽囊組織損傷得到明顯改善。見圖8。

A：正常組；B：模型組；C：十五味賽爾斗丸水溶液組；D：十五味賽爾斗丸醇提組；E：消炎利膽片組圖8 十五味賽爾斗丸對豚鼠膽囊組織病理的影響(HE染色，×400)

2.3.2 十五味賽爾斗丸對豚鼠血清及膽汁中TNF-α含量的影響與正常組相比，模型組血清中 TNF-α 含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，十五味賽爾斗丸醇提組血清中TNF-α含量顯著下降(P<0.01)。與正常組相比，模型組膽汁中TNF-α含量有所升高；與模型組比較，各給藥組膽汁中TNF-α含量有所下降，但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 十五味賽爾斗丸對豚鼠血清及膽汁中TNF-α含量的影響

2.3.3 十五味賽爾斗丸對膽囊炎豚鼠NF-κB和TNF-αmRNA表達水平的影響與正常組比較，模型組TNF-αmRNA、NF-κBmRNA的表達水平明顯升高 (P<0.01)。與模型組比較，各給藥組NF-κBmRNA表達水平顯著降低 (P<0.01)；十五味賽爾斗丸醇提組、消炎利膽片組TNF-αmRNA 的表達水平顯著降低(P<0.01)。見表7。

表7 十五味賽爾斗丸對膽囊炎豚鼠NF-κB和TNF-α mRNA表達水平的影響

2.3.4 十五味賽爾斗丸對膽囊炎豚鼠NF-κB蛋白表達水平的影響與正常組比較，模型組 NF-κB 蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組蛋白表達水平有下降趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖9，表8。

圖9 Western Blot檢測NF-κB蛋白水平表達的影響

表8 十五味賽爾斗丸對豚鼠NF-κB蛋白表達水平的影響

3 討論

十五味賽爾斗丸系傳統藏成藥，由印度獐牙菜、唐古特烏頭、矮叢鳳毛菊、金腰草、石榴子、黑冰片、火硝、波棱瓜子、川木香、角茴香、小檗皮、訶子、洪連、五靈脂、金精石組成[4]，藏醫理論認為本方具有清利肝膽濕熱、舒膽排石退黃之效，臨床常用于肝膽熱癥、膽囊炎、膽石癥、膽總管結石等常見肝膽疾病。現代藥理研究發現，十五味賽爾斗丸具有解熱鎮痛、抑菌、消炎、消腫、利膽溶石、排石，提高機體免疫功能的功效，但其作用機制及有效成分尚不完全清楚，亦無具體的功效藥理學評價及分析。但有研究發現，十五味賽爾斗丸組方中單味藥的醇提物的利膽等作用效果比水提物強[5]。亦有研究對比發現，乙醇作為提取溶劑，更有利于后續的分離純化[6]，可為進一步研究提取物的作用效果及有效成分分析，多方面了解藥物療效作用及靶點打下基礎。

本研究通過網絡藥理學和分子對接技術研究發現，十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的關鍵活性成分有N-methylcorydaldine、氧化血根堿、金圣草(黃)素及7-羥基香豆素。N-methylcorydaldine具有抗分泌活性，可抑制胃酸分泌，其效果媲美奧美拉唑[7]；氧化血根堿具有抗瘧活性[8]。金圣草(黃)素具有很強的抗氧化活性，可抑制脂質過氧化[9]；7-羥基香豆素可誘導HepG2細胞凋亡，具有抗腫瘤和免疫調節作用[10]。與核心靶點PIK3CA靶向的活性成分有雛菊葉龍膽酮、白屈菜紅堿、原阿片堿、隱品堿、別隱品堿、芹菜素等。雛菊葉龍膽酮是從獐牙菜莖中提取的一種呫噸酮化合物，具有保肝、抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性，是免疫缺陷病毒蛋白R的抑制劑[11-13]；白屈菜紅堿具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎活性[14]；Su等[15]研究發現原阿片堿、隱品堿、別隱品堿等生物堿對金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和銅綠假單胞菌都有明顯的抑制作用。慢性膽囊炎的成因中包括細菌感染，其病原菌主要來源于腸道，腸道細菌可經膽管至膽囊，以革蘭陰性菌為主，其中包括大腸埃希菌等[16]。

通過對關鍵活性成分進行靶點預測和分子對接發現，TNF、PIK3CA、AKT1、IL-6、EGFR是十五味賽爾斗丸治療膽囊炎的核心靶點。其中，TNF是與各核心化合物結合表現最好的靶點，TNF是一種調節性細胞因子，是免疫系統中極其重要的信號蛋白。TNF-α、TNF-β是TNF家族重要的成員[17]，TNF-α 主要通過上調MAPK、ERK、NF-kappa B等信號通路來誘導細胞凋亡及促炎癥作用[18]。研究證明，PI3Ks可調節參與細胞增殖、黏附、存活和運動的信號通路。對PIK3CA突變的分析表明，PIK3CA增加PI3K信號，刺激下游AKT信號，促進不依賴生長因子細胞的生長并增加細胞侵襲和轉移能力[19]。現代醫學認為，急性膽囊炎多由大腸桿菌、厭氧桿菌等引起，膽囊結石同樣會誘發急性膽囊炎，損傷膽管壁，產生炎性介質如IL-6，繼發性引起炎性細胞因子升高，參與炎癥反應[20]。有研究證實，急性膽囊炎患者血中革蘭陰性桿菌感染易釋放過量的內毒素，誘導IL-6等入血，引起炎性鏈級反應，導致多器官障礙和并發癥[21]。所有存在結石的膽囊均有炎癥反應變化，炎癥與黏蛋白的分泌異常有一定關系[22]，EGFR對于黏蛋白合成有中心調節作用，進而促進膽囊結石的形成[23]。此外，部分靶點如AKT1[24]、VEGFA[25]等與腫瘤表達密切相關，推測十五味賽爾斗丸在治療腫瘤方面具有一定的潛能。根據《膽囊癌診斷與治療》2019版[26]，膽囊炎為膽囊癌發病相關的危險因素。

GO富集分析發現，十五味賽爾斗丸可改善對細胞缺氧的反應、對脂多糖的反應[27]以及氧結合等功能。由于代謝高度活躍的常駐細胞和活化的浸潤免疫細胞耗氧量增加以及血管功能障礙導致的氧氣供應減少，因此，缺氧常作為慢性發炎組織的顯著特征。組織缺氧會對免疫和非免疫細胞中的炎癥信號通路產生重大影響，影響疾病進展[28]。KEGG通路分析提示，十五味賽爾斗丸主要是通過HIF-1信號通路、TNF信號通路等發揮協同作用來治療膽囊炎。HIF-1水平的變化與AKT、NF-κB通路有關，還可誘導VEGF的轉錄，是干預炎癥損傷、氧化應激、凋亡等的重要信號通路[29]。NF-κB信號通路的激活，可以有效抑制NF-κB介導的TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子及其蛋白的表達，減輕全身炎癥反應和各組織器官的急性損傷[30]。雖然 NF-κB 信號通路在KEGG富集結果中排名未進入前20，但參考前期課題組研究，經過查詢文獻和討論后，認為其有重要的研究意義。

為了驗證十五味賽爾斗丸對膽囊炎模型的影響，本研究進一步采用皮下注射鹽酸林可霉素建立豚鼠膽囊炎模型。結果顯示，模型組血清中 TNF-α 含量明顯升高，提示膽囊出現部分炎癥反應；各給藥組TNF-α含量明顯下降，且十五味賽爾斗丸醇提組中TNF-α含量低于十五味賽爾斗丸水溶液組。與模型組比較，各給藥組NF-κBmRNA表達水平顯著降低，十五味賽爾斗丸醇提組、消炎利膽片組TNF-αmRNA 的表達水平顯著降低，且十五味賽爾斗丸醇提組作用效果更明顯。

綜上，本研究通過網絡藥理學和分子對接技術初步預測十五味賽爾斗丸可通過多成分、多靶點及多通路治療膽囊炎；動物實驗顯示十五味賽爾斗丸可通過激活NF-κB信號通路抑制TNF-α等炎癥因子及其蛋白的表達，減輕炎癥反應，從而治療膽囊炎，與預測結果存在高度一致，明確了本次網絡藥理學和生物信息學預測的可靠性，為今后繼續研究相關成分治療膽囊炎的作用機制提供了重要依據。