腎母細胞瘤腫瘤微環境相關預后基因鑒定及免疫浸潤模式識別*

譚小軍，周 玉，伍 季，韋堂墻

(南充市中心醫院/川北醫學院第二臨床學院泌尿外科，四川南充 637000)

腎母細胞瘤(Wilms tumor，WT)是兒童常見的腹部惡性腫瘤，占0～14歲兒童腎臟腫瘤的90%[1]。手術與放化療相結合使WT的治療取得了很大進展，其5年總生存率為90%，但仍存在預后不良、復發的患者[1]。國際兒科腫瘤學會(SIOP)和美國兒童腫瘤學組(Children′s Oncology Group，COG)根據腫瘤的分期和病理類型等，將腫瘤分為不同的危險等級，為判斷患兒的預后提供指導[2]。但是近50%的復發發生在無已知危險因素的患兒中[3]，顯示現有的分型并不完善。放化療對患兒可能產生嚴重的不良反應，且對患兒的遠期影響并不明確。而精準醫療提出了新的要求，需根據患兒預后進行個體化治療，避免對高危患兒治療不足及對低危患兒治療過度。因此，精確的判斷患兒預后及確定特異性的治療靶點至關重要。

腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)由腫瘤細胞、駐留和招募的宿主細胞、相應細胞的分泌產物和細胞外基質的細胞成分組成。TME和腫瘤細胞相互作用，是導致腫瘤轉移、耐藥等惡性發展的機制之一。隨著二代測序的發展，基于生物信息學的方法應運而生。ESTIMATE是一種計算腫瘤組織腫瘤純度和微環境成分的方法，通過基因表達譜來計算腫瘤組織的免疫/基質/總評分[4]。有助于明確TME在許多癌癥中的重要性，如肺癌和乳腺癌[5-6]。免疫浸潤算法則可以進一步直接通過轉錄組測序數據評估各種免疫細胞比例，顯示了較好的準確性。目前主要由兩種算法來評估免疫浸潤，一是基于標記基因的類似單樣本基因集富集分析(ssGSEA)的算法，MCPcounter為其中代表[7]；另一種是基于反卷積的算法，經典的有EPIC[8]。反卷積方法的一個限制是易受背景預測的影響。因此，本研究選擇了基于標記基因的MCPcounter算法測試WT中免疫細胞的浸潤模式，并評估其與臨床特征和預后的關系[7]，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 數據來源

采用R軟件(R4.0.1)的TCGAbiolink包[9]從腫瘤基因組圖譜(TCGA)數據庫下載WT(TARGET-WT)mRNA表達數據及臨床數據。篩選標準：(1)來自原發腫瘤及癌旁正常組織；(2)同時具有mRNA表達數據及臨床數據。本研究共納入130份標本，包括124份腫瘤組織標本和6份癌旁正常組織標本。收集腫瘤組織標本的臨床數據為：女71例，男53例；診斷年齡156 d至15.7歲，中位診斷年齡為4.2歲。根據國際WT分期系統分期，Ⅰ期16例，Ⅱ期49例，Ⅲ期46例，Ⅳ期13例；根據COG危險分層，高危型66例，低危型58例。本研究的所有數據均來自公共數據庫。

1.2 方法

1.2.1免疫/基質/總評分及其與患者預后的關系

使用R軟件ESTIMATE包[4]評估每份標本的基質評分、免疫評分及相加的總評分。所有標本根據評分中位數分為高評分組和低評分組，使用Kaplan-Meier(KM)生存曲線分析評分與預后的關系。

1.2.2差異表達基因(DEGs)的篩選及富集分析

使用R軟件的edgeR包[10]比較免疫評分、基質評分及總評分高、低組的DEGs，以|Log2FC|>1和P<0.05篩選差異基因。用Peatmap、ggplot2包繪制熱圖和火山圖。采用clusterProfiler軟件包[11]對DEGs進行基因本體論(GO)分析[12]和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析[13]。

1.2.3單因素及多因素回歸分析

采用KM生存曲線及單因素Cox模型確定TME相關DEGs表達與預后之間的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。進一步將單因素Cox分析P<0.01的變量納入多因素Cox回歸分析建立預后模型。采用KM曲線、受試者工作特征(ROC)曲線、校正曲線、決策曲線及生存狀態圖評價模型的預測能力。

1.2.4免疫細胞浸潤模式

TIMER2.0[14]合并了多種不同算法用于評估腫瘤的免疫細胞浸潤情況。本研究采用MCPcounter算法，評估包括總T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、髓樣樹突狀細胞、內皮細胞、腫瘤相關成纖維細胞9種細胞[7]。

1.2.5免疫細胞與臨床相關性

采用R軟件合并臨床數據與免疫細胞浸潤數據，GrphPad Prism8.0.2軟件評估免疫細胞在癌旁正常組織標本和腫瘤組織標本中的差異及其與性別、年齡的關系。同時采用R軟件繪制KM曲線評估各種免疫細胞與生存的關系。

1.2.6T淋巴細胞相關基因

通過相關性分析研究與T淋巴細胞數量具有相關性的基因，相關系數絕對值|r|>0.5，P<0.05定義為相關基因，其中|r|>0.8定義為強相關。

2 結 果

2.1 ESTIMATE評分與預后的相關性

從TCGA數據庫下載的RNA數據集來自124份WT腫瘤標本和6份癌旁正常組織標本，其中第1、2、3、4期腫瘤分別占14%、39%、37%和10%。通過ESTIMATE算法，患者的基質評分范圍為-1 780.3～536.7分，免疫評分范圍為-2 362.7～-824.5分，總評分范圍為-2 750.5～-2 530.0分。根據評分中位數將患者分為高評分組(62例)和低評分組(62例)進行生存分析，結果顯示：基質評分和總評分高的患者生存時間較評分低的患者長(P=1.973×10-3、1.718×10-3)，見圖1A、C；高免疫評分和低免疫評分患者生存時間無明顯差異(P=0.991 1)，見圖1B。

A：不同基質評分的生存曲線；B：不同免疫評分的生存曲線；C：不同總評分的生存曲線。

2.2 DEGs鑒定

根據評分中位數將患者分為兩組，高評分組作為對照組。基質評分低組有922個基因表達下調，92個基因表達上調；免疫評分低組有873個基因表達下調，52個基因表達上調；總評分低組有988個基因表達下調，80個基因表達上調(P<0.05，|log2FC|>1.0)。熱圖和火山圖顯示高、低基質評分不同的基因表達譜，見圖2。總評分DEGs更接近于基質評分DEGs結果。

A：熱圖；B：火山圖。

2.3 GO分析和KEGG富集分析

分別采用基于免疫評分、基質評分及總評分的DEGs進行GO分析和KEGG富集分析。基質評分的DEGs在腎素分泌、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、鈣通道信號通路等富集，見圖3。根據免疫評分確定的DEGs通路包括細胞因子受體交互、抗原加工提呈、核因子-κB(NF-κB)信號通路。總評分和基質評分DEGs相似，其富集通路也較為接近。

A：差異基因的KEGG富集分析；B：差異基因的GO富集分析。

2.4 預后模型的建立與驗證

考慮到基質評分和總評分與預后相關，而免疫評分與預后無明顯相關性，將基質評分和總評分相關DEGs取交集得到928個共同DEGs。對共同DEGs進行KM生存分析和單因素Cox回歸分析，計算出175個基因與WT患者生存相關。進一步將P<0.01的17個基因行逐步多元Cox回歸分析解決共線性問題，構建預后公式。 5個基因被納入最終變量，分別為C10orf71、FMOD、REN、ST6GALNAC1、GABRA5,對這5個基因繪制了KM曲線,結果顯示，各基因高、低表達患者生存時間均有明顯差異(P=1.191×10-2、3.607×10-2、5.309×10-3、1.417×10-2、2.678×10-4)，見圖4。多因素cox回歸結果見表1。

表1 多因素COX分析各基因與預后的關系

A：C10orf71基因高、低表達的生存曲線；B：FMOD基因高、低表達的生存曲線；C：GABRA5基因高、低表達的生存曲線；D：REN基因高、低表達的生存曲線；E：ST6GALNAC1基因高、低表達的生存曲線。

根據預后模型對患者進行風險評分，KM生存曲線顯示：與低風險評分患者比較，高風險評分患者死亡率更高(P=3.678×10-5)，見圖5A；預后模型預測3年和5年生存率的ROC曲線下面積分別為0.735、0.771，見圖5B、C。校正曲線顯示預測結果與實際較一致，且比較穩定，見圖6；決策曲線表明根據預測模型可獲得對患者預后判斷的凈獲益，而且該模型對患者遠期預測更優(圖7)，與ROC曲線結果一致。生存狀態圖顯示隨著風險評分增加，患者死亡率上升，見圖8。

2.5 免疫浸潤模式

采用MCPcounter計算130份標本(124份腫瘤標本和6份癌旁正常組織標本)的總T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、髓樣樹突狀細胞、內皮細胞、腫瘤相關成纖維細胞共9種細胞的浸潤數量。配對樣本t檢驗顯示，癌旁組織中T淋巴細胞、髓樣樹突狀狀細胞、中性粒細胞、內皮細胞數量明顯高于腫瘤組織(P<0.05)，見圖9A；而CD8+T淋巴細胞數量在兩組間無明顯差異(P>0.05)。

A：基于危險評分的KM生存曲線；B：預后模型預測3年生存率的ROC曲線；C：預后模型預測5年生存率的ROC曲線。

A：3年校正曲線；B：5年校正曲線。

圖7 預后模型的3年及5年決策曲線

2.6 免疫細胞與臨床的相關性

采用KM生存曲線評估124份腫瘤組織標本中免疫細胞與生存的相關性，結果顯示T淋巴細胞數量與患者生存相關(P<0.05)，腫瘤中有較高T淋巴細胞浸潤的患者顯示更好的預后，見圖9C。進一步分析年齡、性別與免疫細胞的關系，提示免疫細胞數量與性別無關，年齡與免疫細胞的浸潤存在一定相關性，3歲以下患者中性粒細胞、單核細胞、內皮細胞數量明顯高于3歲及以上的患者(P<0.05)，見圖9B。

圖8 預后模型的生存狀態圖

A：WT組織及癌旁組織不同免疫細胞浸潤的差異；B：不同年齡WT患者免疫細胞浸潤的差異；C：基于T淋巴細胞浸潤數量的KM生存曲線。

2.7 免疫細胞與基因表達的相關性

由于T淋巴細胞數量在癌旁組織中與腫瘤組織中有明顯差異，并且與預后相關，進一步通過相關性分析尋找T淋巴細胞相關基因，結果顯示：共1 135個基因與T淋巴細胞數量相關，特別是TMEM213、FXYD2、KCNJI1、ATP6V0A4、MAL、MUC1、TACSTD2、BLNK、DEFB1、TFAP2B、PROM2、SCIN、PAGR5、CLDN8、SCTR、CASR這16個基因的表達水平與T淋巴細胞數量呈強相關(|r|>0.8)。

3 討 論

WT是兒童常見的腹部腫瘤之一，通過手術、放療和化療等綜合治療有較高的治愈率[2]，但依然存在一些棘手的問題，如缺乏早期診斷的標志物，高危患者的識別和治療等。WT由胚胎細胞而不是成熟的上皮細胞組成[2]，可分為不同的組織學類型，對預測患者預后有重要意義。此外，1 q和16 q的染色體擴增對預后也有重要作用[15]。1 q擴增被認為是最有力的預后預測因子，有1 q擴增的患者其生存時間明顯低于沒有1 q擴增的患者[15]。COG基于年齡、腫瘤重量、1 q/16 q雜合度缺失和化療對肺轉移的反應對患者進行危險分層[2]，但是不能很好地預測患者預后，近50%的復發發生在沒有高危因素的兒童[3]，因此，需要探索更多的具有預后意義的指標。

目前，WT免疫治療效果不佳，可能與WT的TME有關。WT中可能存在免疫抑制的微環境[16]。TME與腫瘤細胞之間的雙向通信對腫瘤的發生、發展至關重要，不僅腫瘤細胞有異質性，TME也存在差異，這可能是影響腫瘤預后的因素之一[17]。靶向TME而不是腫瘤細胞本身提供了一種新的腫瘤治療策略。

本研究分析了腫瘤中基質細胞和免疫細胞的浸潤水平，用基質評分和免疫評分來表示。結果顯示，基質評分高的患者預后較好，但預后與免疫評分無明顯相關性。這也顯示腫瘤純度越高，惡性程度越強。而免疫評分與預后無關，推測可能原因為免疫成分對腫瘤的雙向作用抵消了這種影響，如巨噬細胞的M1及M2極化分別發揮抑制和促進癌癥的作用[18]。腫瘤相關成纖維細胞也在腫瘤中發揮著重要作用[19]。通過差異分析發現，在評分高的組大多基因下調，而基質評分和總評分越高預后越好，說明這些下調基因的功能可能與預后不良有關。富集分析顯示腎素分泌、PI3K/Akt信號通路、鈣通道信號通路等可能參與了這種免疫微環境的構建，與免疫微環境的差異有關。作者對差異基因進行了回歸分析，建立了基于5個基因的預后模型，其中REN/ST6GALNAC為危險因素，提示降低REN/ST6GALNA基因表達也許可以起到抑制腫瘤的作用。REN基因編碼腎素，腎素是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的一部分，參與調節血壓和電解質平衡。據統計，30%的WT患者有高血壓癥狀[20]，這種高血壓可能是由WT自主分泌的腎素導致[21]。鑒于REN基因表達水平升高對預后的不良影響，作者推測高血壓可能與患者預后有聯系。而一項單中心回顧性研究支持這一推測，其研究表明初診時的高血壓與WT患者的不良預后相關[22]。唾液酰基轉移酶是一系列參與糖鏈合成的酶。在惡性腫瘤中，ST6GALNAC1將唾液酸添加到絲氨酸或蘇氨酸殘基上的α-2,6鍵，在各種類型的腫瘤中發揮重要作用，如乳腺癌、結直腸癌[23-24]。有研究顯示，白細胞介素-13(IL-13)介導巨噬細胞刺激結腸細胞激活ST6GALNAC1的轉錄[25]。總之，本研究中的預后模型揭示了可能受到微環境影響的與腫瘤轉歸相關的基因。

鑒于有研究顯示免疫對腫瘤進展有重要影響，本研究進一步探索了WT的免疫浸潤模式，顯示T淋巴細胞在WT腫瘤組織中較癌旁正常組織低且與預后相關，較高T淋巴細胞浸潤的患者預后好。這可能與腫瘤的免疫逃逸相關，惡性程度低的腫瘤更容易被T淋巴細胞識別并招募T淋巴細胞，進而被T淋巴細胞殺傷[26]。蔡志明等[27]發現，預后不良患者免疫抑制更重，血液中CD3+T淋巴細胞更少。作者分析了與T淋巴細胞表達相關的基因，值得注意的是TMEM213顯示了和T淋巴細胞很好的相關性，但它并不是T淋巴細胞標記物。TMEM213是一種跨膜蛋白，其功能并不明確，在腎、肺、唾液腺中表達，其他組織中幾乎不表達。關于這些基因與T淋巴細胞浸潤的相互關系值得進一步研究。作者還發現中性粒細胞與年齡相關，3歲以下患者中性粒細胞浸潤數量更多。可能原因為腫瘤初期免疫細胞浸潤良好，而隨著腫瘤細胞的發展，其免疫抑制作用使得局部免疫細胞越來越弱，從而影響患者預后。一項來自歐洲的大樣本研究顯示，0～3歲兒童的預后更好[1]。這提示也許早期發現、早期治療WT會帶來更大的收益。

綜上所述，本研究構建了一個預測能力良好的預測模型，可以為判斷WT患者預后提供參考，并發現REN基因與患者預后相關，為分子靶向治療提供了一定的思路。另外，本研究顯示T淋巴細胞在WT中發揮了重要作用，這值得進一步的探索。