拉曼光譜技術在血脂異常診斷試驗中的應用*

謝景麗，曾麒霖 綜述，姜文錫 審校

(新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊 830011)

血脂異常通常指由于脂質代謝紊亂而引起血清中血脂成分含量的異常變化，又稱高脂血癥[1]。高脂血癥促進脂質在血管內皮下沉積而形成斑塊，晚期斑塊破裂形成血栓，堵塞冠狀動脈或腦血管造成心肌梗死或腦卒中[2]，是心腦血管疾病的一個重要危險因素。目前，中國成人高脂血癥患病率高達40.4%，隨著人群血脂水平的升高，我國心血管病事件在2010—2030年預計增加920萬[3]，所以提高血脂異常的早期檢出率、控制血脂水平對減少心血管病事件的發生至關重要。

拉曼光譜基于分子振動產生，可以反映分子的結構和構象，從分子水平反映組織病理變化，是一種基于分子水平的檢測手段[4]。疾病的發生與分子蛋白質、脂類、核酸、糖等各種成分的改變相關，而光譜技術是了解這些物質變化最靈敏的技術[5]。通過激光散射獲得拉曼光譜圖譜，根據波峰的位置、強度、譜線的寬度，可獲得這些大分子物質的含量及結構信息[6]。拉曼光譜技術可以探尋血清中與疾病相關的大分子物質的譜線特征，從分子水平研究與疾病相關的物質在血清中的濃度變化，從而進行疾病的診斷。

大多數高脂血癥患者無任何癥狀和異常體征表現,常常是在進行血液生化檢驗時被發現[7]，這并不利于血脂異常的早期發現，而且現有的診斷方法主要靠血常規檢測，此方法雖然普及且簡便，但仍然是一項有創的檢查方法。拉曼光譜具有對樣品破壞程度低、迅速、操作簡便、專一性強等優點。本文就拉曼光譜技術的基本原理與優點、在疾病診斷領域的應用，以及便攜拉曼光譜儀的原理及應用展開綜述，以探究拉曼光譜技術診斷血脂異常的可行性。

1 拉曼光譜技術的基本原理及特點

1.1 拉曼光譜的基本原理

1928年，RAMAN在一次涉及光學的實驗中觀察到與原始入射光波長不同的散射光，這種現象被稱為“拉曼散射效應”[8]。當一定頻率的入射光照射于樣品表面后會出現透射、吸收、散射3種情況。當一束激光照射被測物體時，被測物體中含有的分子可以使入射光發生散射，大部分散射光的頻率與入射光相同，稱為瑞利散射；而由于樣品中分子振動-轉動能級作用使一部分散射光發生偏移，不僅改變了光的傳播方向，而且改變了傳播頻率，稱為拉曼散射。這種發生偏移的光譜就是拉曼光譜，散射光與入射光頻率差值被稱為拉曼位移，其只與被測物質本身的結構有關，與入射光頻率無關，每一種物質有自己的特征拉曼光譜[9]。

對拉曼散射光進一步分析，其中一部分散射光頻率小于入射光被稱為斯托克斯散射，另一部分散射光頻率大于入射光則被稱為反斯托克斯散射。因斯托克斯散射光較強，通常情況下用于物質拉曼光譜測量[10]。拉曼光譜對于C-C、N=N、S-S鍵等電荷分布中心對稱的化學鍵散射很強，因此可以很好地反映一些分子內部的結構信息，而且還可以測定分子的退偏比，有利于明確分子的對稱性，常用于分子結構分析[11]。

1.2 拉曼光譜的特點

拉曼光譜對于樣品沒有特殊要求，不論樣品呈何形態，均可存在拉曼效應。由于水的拉曼散射很微弱，所以拉曼光譜是研究水溶液及類似水溶液樣品中分子結構的理想工具[12]。拉曼光譜亦具有高特異度、高分析效率及復雜樣品無需染色或標記等優點，能以較低的成本提供樣品實時分子信息，故成為診斷疾病及預后評價的工具。

但傳統拉曼光譜技術存在信號強度低、熒光干擾強等缺點，應用比較受限。為克服這些缺點，隨之產生了許多新拉曼光譜技術，包括表面增強拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光譜、受激拉曼光譜等[13]。近幾年，隨著拉曼光譜技術的不斷發展，已廣泛應用于材料、化工、環保生物、醫學、地質等領域。

2 拉曼光譜技術在疾病診斷中的應用

2.1 惡性腫瘤

惡性腫瘤目前已成為人類健康最大的威脅。由于缺乏高效的癌癥篩查手段，以及對“早發現、早診斷、早治療”等防癌策略認知不足，我國癌癥患者5年生存率僅為30.9%[14]。目前，檢測腫瘤的3種主要方法為腫瘤標志物檢測、影像學診斷和組織病理學診斷，其中組織病理學診斷是腫瘤診斷的“金標準”，但也是一種有創的診斷方式，不僅要求檢測人員具有豐富的經驗，而且診斷時效性差。拉曼光譜可以在分子水平上揭示腫瘤組織與正常組織結構之間的差異，且不會改變樣品的性狀，故在腫瘤的良惡性判別、腫瘤的亞型分類、切片病理診斷等方面被廣泛應用。腫瘤生物標記物檢測是一種非侵入性的快速分析技術，而且腫瘤標記物濃度低，化學成分復雜，可以利用拉曼光譜技術檢測血清腫瘤標志物成分，以彌補傳統病理活檢的局限性，完成癌癥的早期篩查[14-15]。

2.2 病毒檢測

目前病毒感染的診斷方法有多種，主要為免疫檢測、核酸檢測、熱成像檢測等。其中核酸檢測是在新型冠狀病毒感染診斷中使用最多，也被世界公認的重要方法。ANWAR等[15]在拉曼光譜儀的532 nm激光光源下檢測健康人、乙型肝炎(以下簡稱乙肝)和丙型肝炎(以下簡稱丙肝)患者血清。與健康人血清相比，峰值在1 006、1 157、1 513 cm-1處，乙肝和丙肝患者血清光譜的峰值隨著強度的降低而發生藍移。KHAN等[16]研究發現乙肝患者血清中的625、678、748、810、820、950、1 003、1 018、1 275 cm-1波峰強度高于健康人血清。乙肝和丙肝患者血清的拉曼光譜譜線波峰及波段與健康人血清光譜差異很大，該技術可被視為診斷乙肝和丙肝的有效工具。亦有研究表明，充分利用表面增強拉曼散射的“指紋圖譜”分析優勢，利用DNA探針將拉曼活性分子與靶核酸連接，通過對DNA探針上拉曼活性分子信號變化的檢測和分析，可提高新型冠狀病毒核酸檢測的靈敏度與特異度[17]。

2.3 血糖異常檢測

糖尿病是一種影響全球4.22億人的慢性非傳染性疾病，可能在未來幾年對公共健康構成巨大威脅[18]。目前最先進的血糖監測器也需要患者每天取數次指間血，這種方法不僅有創、不便，而且有感染風險。在不同光學技術中，拉曼光譜是用無創技術診斷疾病最有前景的光學方法之一[19-20]。有研究者使用拉曼光譜儀采集12名志愿者微血管血糖的拉曼光譜來預測血糖，結果顯示激光聚焦甲襞微血管獲得的拉曼光譜峰在650、758、837、945、978、1 004、1 130、1 163、1 217、1 551、1 660 cm-1處很明顯，且比健康人血清譜峰要高，這些譜峰同樣也存在于血液中[21-23]。這表明可以使用無創的方法在體表進行臨床范圍可接受的血糖預測，對研究無創血糖檢測具有重要意義，而且這種創新的方法還可以促進其他血液成分的非侵入性檢測[24]。

3 基于拉曼光譜技術對樣品的定性及定量分析

定性和定量分析是拉曼光譜應用于物質分析科學中兩個最重要的方面。不同分子物質有不同特征的拉曼光譜譜線，故可以用于物質分子定性與結構分析。光譜波峰的強度與分子物質濃度成正比，因此可用于物質的定量分析[25]。

拉曼光譜分析法在臨床上可用于對血紅蛋白含氧量的檢測[26]。董海勝等[27]利用血清拉曼光譜結合偏最小二乘法建立了膽固醇的濃度與光譜之間的模型及校正模型，表明應用拉曼光譜結合偏最小二乘法建立模型可以實現對血清膽固醇濃度的預測。拉曼光譜分析法可以對樣品進行快速、簡單、可重復、無損傷的定性、定量分析，可以利用拉曼光譜這一特點，對血脂異常患者血清進行各血脂成分的定性及定量分析。

4 便攜拉曼光譜儀的原理及應用

便攜拉曼光譜儀工作原理與大型拉曼光譜儀的工作原理相似，先是由光譜儀激光器發出一束激光聚焦在被測物體上，然后用探頭收集散射光，并濾去頻率沒有變化的散射光，再利用內置光柵對不同波長的散射光進行分離，最后對光譜進行收集和記錄，并轉換成數字信號后最終輸出，得到拉曼光譜[28]。

便攜式拉曼光譜儀以其快速無損、便攜等特點被廣泛應用于各個領域。DINGAR等[29]表明，通過拉曼光譜和偏最小二乘法可以對血清樣品中的糖化清蛋白進行體外定量。GUEVARA等[30]使用便攜拉曼光譜儀在糖尿病患者及健康人群不同解剖位置獲得拉曼光譜，然后結合人工神經網絡及支持向量機等進行算法分析，發現人工神經網絡結合拉曼光譜檢測血糖的總體性能優于毛細血管血糖測量，并且具有與糖尿病診斷金標準相當的性能。使用便攜拉曼光譜儀結合人工神經網絡有可能在普通人群中進行體外、無創、快速的糖尿病篩查。

5 小 結

脂質是人體所需三大營養物質之一，脂質代謝紊亂或異常容易導致高脂血癥，但早期高脂血癥患者并無任何癥狀和異常體征，不易早期發現，長期血脂異常容易引起心腦血管不良事件。現有的血脂異常診斷方法雖然普及且簡便，但仍然對人體造成一定的創傷，且不易提高血脂異常的早期檢出率。所以基于拉曼光譜技術，結合便攜拉曼光譜儀的可攜帶、方便性等優點，研究出一種無創、高效的血脂異常篩查方法具有廣闊前景。