濃縮生長因子促進干細胞成骨分化的研究進展*

代酉麗 綜述，蔣孝添，李叢華 審校

(重慶醫科大學附屬口腔醫院大學城醫院門診部 401331)

創傷、壞死、腫瘤、先天畸形等各種原因都可能導致大面積骨缺損和骨愈合失敗，這些在人或動物的一生中不能完全愈合的缺陷稱為臨界骨缺損[1]。臨界骨缺損通常需要手術用自體骨移植或骨移植替代物重建。其中自體骨移植常需要額外手術，且供體有限；骨替代材料存在塑形性和成骨能力不足等缺點[2]。而且，由于祖細胞數量不足，缺乏向缺損部位的遷移，無法分化為成骨細胞，在臨界骨缺損的愈合過程中仍存在難題[3]。因此，骨組織工程受到了廣泛關注，其可通過添加多種生長因子的具有骨誘導性的支架，將干細胞運送至缺損部位以促進骨再生。

生長因子的釋放是組織再生研究中具有挑戰性的問題，目前濃縮生長因子(concentrated growth factor，CGF)作為能夠控制其釋放的儲蓄庫，正受到許多研究者的關注。CGF作為第3代血小板濃縮物，柔軟疏松的纖維蛋白支架內包埋了大量的血小板、白細胞和紅細胞，含有大量生長因子，很多學者研究表明CGF可以單獨或和其他骨移植材料聯合應用促進干細胞增殖及成骨分化。在骨組織工程中，牙源性干細胞及骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)等常被用于研究。其中，牙源性干細胞是具有自我更新能力和多向分化潛力的間充質干細胞群體。從較早發育階段的組織(如牙胚、牙囊、初生脫落的乳牙)或成人牙齒組織(如成人牙髓、根尖乳頭、牙周韌帶和牙齦)中分離出神經嵴來源的干細胞，其可分化形成顱面軟骨和骨，用于自體移植重建人顱面骨[4]。

1 CGF的發展

1974年，含有多種自體生長因子和纖維蛋白支架的血小板濃縮物被發現[5]。富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)作為第1代濃縮血小板已被用于各種醫療領域，但是近年來其使用受到限制，主要是由于添加凝血酶和氯化鈣增強纖維聚合作用已被證明會引起交叉感染、免疫排斥等不良反應[6]。為了克服這些問題，在不添加抗凝劑的情況下離心并分離出富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)[7]。與PRP不同，PRF的纖維蛋白基質充當3D支架，允許生長因子緩慢釋放，同時為細胞黏附、遷移和分化提供空間[8]。2006年，有學者通過改變離心速度從PRF中分離出CGF，其可誘導纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，從而形成具有高抗張強度的基質，促進血小板破裂和生長因子釋放[9-10]。目前認為CGF在成分和臨床適用性方面優于PRP和PRF。

2 CGF的主要成分及作用

CGF主要由多種生長因子、細胞、血小板及纖維網狀支架組成。在CGF的制備中，血液樣品通過固定程序進行差速離心處理分離出CGF凝膠層，由上層貧血小板層、中層血漿和下層紅細胞層3層組成，CGF也具有3個部分，即最上面部分呈白色，最下面部分呈紅色，中間部分為血沉層，呈棕黃色[11]。電子顯微鏡掃描顯示，CGF上部為3D網絡，主要由纖維蛋白和一些類似天然纖維蛋白的小直徑纖維蛋白分子組成，有利于細胞黏附；下部含有大量的細胞成分，包括血小板、白細胞和紅細胞[12]，值得注意的是，其中還存在大量參與血管生成的分化細胞簇——CD34陽性細胞[13]。通過纖溶激活包裹在CGF的纖維蛋白支架中的血小板可促進生長因子的持續釋放，如轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，上述生長因子已經被證實是組織工程中調節干細胞活性所必需的[9，14]。TGF-β1在大多數生理環境中是一種趨化和促有絲分裂因子，可促進間充質干細胞增殖和細胞外基質合成[15]。PDGF刺激成纖維細胞、成骨細胞和間充質干細胞的增殖，還參與血管生成和膠原蛋白的生物合成[16]。IGF調節多種細胞類型的增殖、遷移和分化，并誘導周圍神經形成[17]。VEGF是血管生成中內皮細胞增殖和遷移的關鍵調節因子，并在新生血管形成過程中調節缺血環境中的血管通透性[18]。BMPs是一類參與骨形成和發育的分泌型多功能蛋白[19]。EGF在細胞分化、遷移和凋亡中發揮作用，并且在體外和體內均可作為有效的有絲分裂原[20]。bFGF是一種具有促有絲分裂和血管生成活性的單鏈蛋白，可促進受損內皮細胞的修復和血管生成[21]。

3 CGF對干細胞成骨分化的作用

3.1 CGF促進牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)增殖及成骨分化

YU等[22]報道，將CGF與比格犬PDLSCs共培養發現，CGF能顯著促進PDLSCs增殖，增強堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性、礦化結節的沉積能力和上調成骨相關基因的表達來促進其成骨分化，而且這種作用隨CGF濃度增加而增強。賈婷婷[23]將PDLSCs接種于CGF膜上培養，發現CGF膜也可顯著促進PDLSCs增殖和成骨分化。QIAO等[24]初步探討了關于CGF促進hPDLCs成骨分化的機制，發現CGF顯著促進人PDLSCs(hPDLCs)的增殖和ALP活性，且與重組人血小板衍生生長因子-AB(rhPDGF-AB)和重組人轉化生長因子-β1(rhTGF-β1)的聯合作用相比，其作用更強，Wnt/β-catenin信號通路在早期參與了CGF誘導的細胞增殖和分化。而關于CGF對炎癥環境下PDLSCs的作用，LI等[25]研究報道在腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導的炎癥微環境下，CGF滲出液明顯增強了hPDLCs的增殖和成骨分化，CGF中所含的TGF-β1通過上調Runx2轉錄因子表達減輕了TNF-α對hPDLCs成骨分化的抑制作用。而AGHAMOHAMADI等[26]報道，CGF促進PDLSCs增殖無劑量依賴性，高濃度CGF顯著抑制PDLSCs增殖，并認為由TGF-β和蛋白水解酶介導。

3.2 CGF促進牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)增殖及成骨分化

牙本質-牙髓復合物對于牙齒的長期完整性和活力至關重要，但它容易受到外部因素的損傷。隨著干細胞組織工程的發展，將牙源性干細胞與組織修復微環境相結合以促進牙本質-牙髓復合物再生的可能性增加。JIN等[27]發現，CGF以劑量依賴的方式促進DPSCs增殖，高濃度CGF抑制DPSCs的內皮分化和成牙本質細胞分化，且高劑量CGF的負面作用可能與濃度增加時TGF-β、白細胞介素(IL)-1β和IL-6過量有關。JUN等[28]用CGF提取物處理人DPSCs(hDPSCs)，發現CGF提取物顯著促進hDPSCs增殖和遷移，且呈劑量依賴性。XU等[29]的實驗也表明，CGF以劑量依賴的方式促進暴露于脂多糖的DPSCs的增殖、遷移和分化，可能是由于CGF處理的DPSCs分泌TNF-α和IL-8促進了DPSCs遷移。TIAN等[30]研究發現，CGF以劑量依賴的方式促進DPSCs的增殖和遷移，CGF通過上調RUNX2轉錄因子增強DPSCs成牙或成骨分化，且骨形成蛋白2(BMP-2)/Smad5/Runx2信號通路與CGF介導的DPSCs礦化有關。LI等[31]研究了CGF滲出液(CGFe)和TGF-β1的協同作用，結果表明CGFe和TGF-β1增強了hDPSCs活力，并通過激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路促進hDPSCs的活力和成骨分化。

3.3 CGF促進BMSCs增殖及成骨分化

BMSCs是骨組織工程中常用的一種多能干細胞，能夠多向分化。HONDA等[32]報道了CGF促進BMSCs的增殖及成骨分化，且這種作用呈劑量依賴性。CHEN等[33]進一步證實CGF聯合BMSCs修復骨缺損具有獨特的天然優勢，研究結果表明CGF與BMSCs結合可以形成纖維蛋白支架，這種支架對成骨有強大的作用，同時還具有血管生成的輔助作用，而且CGF與BMSCs聯合具有良好的骨誘導活性，是一種優秀的骨再生生物材料。近期，張月等[34]實驗結果表明，CGF能有效促進BMSCs在礦化膠原材料上的黏附、增殖和成骨分化，其中10% CGF滲出液效果最顯著，而且與礦化膠原材料聯合應用可促進骨形成。

3.4 CGF促進脂肪干細胞(adipose derived pulp stem cells，ADSCs)增殖及成骨分化

與其他來源的干細胞相比，ADSCs具有供應豐富、制備簡單、再生能力強等優點，正在成為組織工程中種子細胞的重要來源[35-36]。馬翔宇等[37]探討CGF對ADSCs成骨作用的影響，證實了比格犬ADSCs在體外礦化環境誘導下可出現骨向分化，CGF可通過釋放生長因子顯著加強ADSCs的增殖及成骨效應。近來HU等[38]探究了不同含量CGF(0、5%、10%、20%)對ADSCs增殖分化的影響，發現在體外促進ADSCs增殖和分化的最佳含量為20%，將CGF與ADSCs相結合的復合物植入骨缺損處在大鼠體內顯示出良好的成骨作用，證明CGF/ADSCs復合物可以促進大鼠頜面部骨缺損修復。

3.5 CGF促進牙齦間充質干細胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells，GMSCs)增殖及成骨分化

與BMSCs相比，GMSCs來源于臨床廢棄物，且易獲得、可自我修復，具有更高的增殖率。但就臨床骨再生而言，GMSCs的成骨分化能力較差。CHEN等[39]用不同含量CGF培養GMSCs，實驗結果顯示10% CGF對GMSCs增殖的促進作用最為顯著，且CGF通過調控牙本質基質蛋白1(DMP1)、牙本質涎磷蛋白(DSPP)、BMP-2和RUNX2的表達誘導GMSCs成骨分化。QI等[40]采用不同濃度的CGF處理GMSCs，觀察CGF對細胞增殖和遷移的影響，發現CGF培養的GMSCs細胞增殖能力和遷移能力明顯增強。此外，CGF提高了纖維連接蛋白(FN)、Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、VEGF和血管生成素-1(Ang-1)的表達水平。CGF的這些作用是由蛋白激酶B(AKT)/Wnt和Yes相關蛋白(YAP)通路介導，而AKT可能在Wnt/β-catenin和YAP通路的上游發揮作用。在體內模型中也顯示YAP過表達。因此，CGF具有促進牙齦再生的作用，而YAP轉運至細胞核可能是其中的關鍵因素，這為牙齦再生提供了新的視角，進一步促進了CGF的臨床應用。

4 小結及展望

CGF可通過專業的設備、規范的程序從自體靜脈血離心而得，來源豐富、制取方便快捷。相比一些外源性生長因子，CGF排除了臨床應用中可能存在的交叉感染、毒性和免疫原性等風險，具有良好的生物相容性及較高的經濟性。CGF柔軟致密的纖維蛋白支架中包裹多種生長因子，纖維蛋白支架作為一種臨時基質，有助于延長生長因子的釋放時間。但CGF的生物活性不持久，在生物物理和生物化學環境中，生長因子的釋放動力學將直接影響其生物活性模式。隨著纖維蛋白支架降解，血小板團逐漸分解，生長因子緩慢釋放到局部微環境中，延長生長因子的釋放時間可能符合再生重建的長期過程。CGF通過與其他生物材料結合，可以建立一個連續的藥物傳遞系統，這可能有助于延長CGF的生物活性持續時間。而且CGF中生長因子的具體組成及含量至今還在探究中，已知的生長因子的作用途徑也極其有限。基于CGF的再生治療的關鍵是通過引入連續的藥物傳遞系統來增加生長因子的數量和釋放時間，因此，探究CGF中生長因子的組成和含量有利于支持其臨床應用。

以上研究探討了CGF對多種干細胞增殖及成骨分化的作用，然而仍有一些干細胞未進行相關實驗，如牙囊干細胞、人脫落乳牙干細胞等，CGF對這些干細胞的作用仍待進一步探究和驗證，以選出最合適的干細胞，經過相關基因轉染的干細胞也應在考慮范圍內。目前CGF對干細胞的最佳作用濃度仍存在一定爭議。大部分實驗結果表明，CGF促進干細胞增殖的作用呈現劑量依賴性，但也有部分研究顯示在低濃度下CGF提取物對細胞增殖和分化的正向作用呈劑量依賴性，而高濃度CGF對細胞增殖和分化有抑制作用。分析原因可能與CGF中血小板計數及制備、儲存等有關，還需要進一步探究。此外，近幾年支架材料發展迅速，不同支架的運用可改善干細胞的附著，延長生長因子的釋放時間并提高活性。因此也需要考慮將CGF、干細胞與新型支架材料聯合運用，以期發揮出CGF的最大生物活性優勢。