4種檢測血清抗環(huán)瓜氨酸肽抗體的方法學(xué)比較*

周愛娥，湛曉琴，趙世巧，張 娟，賈雙榮

(重慶市中醫(yī)院檢驗科/川渝共建感染性疾病中西醫(yī)結(jié)合診治重慶市重點(diǎn)實驗室 400021)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性自身免疫性系統(tǒng)性炎癥性疾病，影響全世界0.5%～1.0%的成人[1]。為確保RA得到有效治療，早期診斷至關(guān)重要。多項研究顯示，抗環(huán)瓜氨酸肽(抗CCP)抗體能在癥狀產(chǎn)生前幾年被檢測到[2-3]，并且比類風(fēng)濕因子(RF)有更高的診斷特異度[4]。2010年美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會/歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟將抗CCP抗體的檢測納入了RA的分類標(biāo)準(zhǔn)中[5]。目前檢測抗CCP抗體的方法有多種，但由于其檢測方法缺乏國際參考物質(zhì)，不同方法的溯源性及試劑采用的環(huán)瓜氨酸表位存在差異，可能會導(dǎo)致臨床診斷效能存在差異。為了篩選出適合臨床實驗室應(yīng)用的方法，本研究以國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心室間質(zhì)評采用的定性方法(酶聯(lián)免疫法)作為參比方法，比較了免疫膠體金法、免疫透色比濁法和化學(xué)發(fā)光法與之的一致性，供臨床醫(yī)學(xué)實驗室參考。

1 資料與方法

一般資料

收集本院2020年12月至2021年2月門診和住院有關(guān)節(jié)炎癥狀的100例患者血清，其中用膠體金方法檢測抗CCP抗體陽性50例，陰性50例。樣本保存于-20 ℃，以備集中檢測。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器

膠體金抗CCP抗體檢測試劑盒和酶聯(lián)免疫試劑盒由上海科新生物技術(shù)股份有限公司提供(試劑批號：EC210101)；免疫透射比濁法試劑和校準(zhǔn)品由寧波美康生物科技股份有限公司提供(批號：200714101)，檢測儀器為德國西門子全自動生化分析儀Advia 2400；化學(xué)發(fā)光法試劑和校準(zhǔn)品由美國雅培公司提供(批號：11072UP00)，檢測儀器為美國雅培全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀i2000 SR。

1.2.2檢測方法

分別嚴(yán)格按照操作手冊用免疫膠體金法、免疫透色比濁法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法檢測收集的血清抗CCP抗體。膠體金法以肉眼觀察質(zhì)控線和檢測線均顯色判定為陽性。免疫透射比濁法、酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法的檢測范圍分別為25～300、25～1 600、0.5～200.0 U/mL，截斷值(cut-off值)分別為45、25、5 U/mL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用WS/T505-2017指南[6]方案進(jìn)行定性方法的符合率統(tǒng)計及95%CI計算。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用例數(shù)或百分比表示，Kappa系數(shù)檢驗驗證方法間的一致性，κ>0.7表示一致性強(qiáng)，>0.4～≤0.7表示一致性一般，≤0.4表示一致性弱。變量間的相關(guān)性分析采用線性回歸分析，并繪制散點(diǎn)圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫膠體金法與酶聯(lián)免疫法的一致性分析

分別用免疫膠體金法和酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體，檢測結(jié)果見表1。陽性符合率為100.0%(20/20)，95%CI(83.9%，100.0%)；陰性符合率為62.5%(50/80)，95%CI(51.6%，72.3%)；總體符合率為70.0%(70/100)，95%CI(60.4%，78.1%)；兩種方法檢測結(jié)果有明顯差異，一致性檢驗的κ=0.40(P<0.001)，一致性弱。

表1 免疫膠體金法與酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體性能比較(n)

2.2 免疫透色比濁法與酶聯(lián)免疫法的一致性分析

分別用免疫透色比濁法和酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體，檢測結(jié)果見表2。陽性符合率為90.0%(18/20)，95%CI(69.9%，97.2%)；陰性符合率為82.5%(66/80)，95%CI(72.7%,89.3%)；總體符合率為84.0%(84/100)，95%CI(75.6%,89.9%)，兩種方法檢測結(jié)果有明顯差異，一致性檢驗的κ=0.59(P<0.001)，一致性一般。

表2 免疫透射比濁法與酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體性能比較(n)

2.3 化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法的一致性分析

分別用化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體，檢測結(jié)果見表3。陽性符合率為100.0%(20/20)，95%CI(83.9%,100.0%)；陰性符合率為98.8%(79/80)，95%CI(93.1%，99.8%)；總體符合率為99.0%(99/100)，95%CI(94.4%，99.8%)，兩種方法檢測結(jié)果無明顯差異，一致性檢驗的κ=0.97(P<0.001)，一致性強(qiáng)。

2.4 線性回歸分析

分別將化學(xué)發(fā)光法、免疫透射比濁法與酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體的定量結(jié)果做線性回歸分析，剔除超檢測范圍的數(shù)據(jù)點(diǎn)后畫散點(diǎn)圖。化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法之間呈二次線性相關(guān)(R2=0.954)，見圖1；免疫透射比濁法與酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法均不成線性相關(guān)，見圖2、3。

表3 化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體性能比較(n)

圖1 化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體的相關(guān)性分析

圖2 免疫透射比濁法與酶聯(lián)免疫法檢測抗CCP抗體的相關(guān)性分析

2.5 化學(xué)發(fā)光法的精密度驗證

依據(jù)EP15-A2文件選取兩個水平濃度(4.2、15.8 U/mL)質(zhì)控品，每天檢測3次，連續(xù)檢測5 d，共計15個數(shù)據(jù)。批內(nèi)不精密度分別為4.1%和3.2%，批間不精密度分別為5.8%和3.9%。滿足廠家說明及臨床要求。另根據(jù)WS/T505-2017指南選取50%濃度(C50)±20%(4.2、6.0 U/mL)兩個濃度樣品。兩樣品經(jīng)連續(xù)檢測40次均分別得出100%陰性和100%陽性結(jié)果。4.2～6.0 U/mL區(qū)間落在陽性率為5%～95%的濃度區(qū)間(C5～C95區(qū)間)內(nèi)，說明灰區(qū)范圍窄，精密度良好。

2.6 化學(xué)發(fā)光法準(zhǔn)確度驗證

用化學(xué)發(fā)光法檢測國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心2021年第1次抗CCP抗體室間質(zhì)評5個樣品(202111～202115)，結(jié)果依次為陽性、陽性、陰性、陰性、陽性，成績?yōu)?00%通過。

圖3 免疫透射比濁法與化學(xué)發(fā)光法檢測抗CCP抗體的相關(guān)性分析

3 討 論

1998年，SCHELLEKENS等[7]首先發(fā)現(xiàn)瓜氨酸蛋白異常積累于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)中，人體免疫系統(tǒng)以該蛋白作為攻擊靶標(biāo)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，提示與RA發(fā)病機(jī)制有關(guān)。由于抗CCP抗體診斷和預(yù)測RA的特異度高，彌補(bǔ)了RF特異性差的缺點(diǎn)，二者結(jié)合檢測提高了RA診斷準(zhǔn)確率[8]。檢測抗CCP抗體的方法目前已發(fā)展到第3代。第1代以大鼠重組的含瓜氨酸殘基的絲氨酸為抗原，檢測人體血清中的抗體，但由于結(jié)合率差，其靈敏度較低。第2代和第3代采用人工合成的環(huán)瓜氨酸肽[9]，比第1代檢測有更高的靈敏度和特異度[10]。研究發(fā)現(xiàn)，第2代與第3代檢測在靈敏度和特異度上無明顯差別[11]，但第3代CCP抗原由于提供了新的抗原表位，在RA風(fēng)險分層中起到了新的作用[12]。

本研究以基于酶聯(lián)免疫法的第2代抗CCP抗體檢測方法作為比較方法，比較其他幾種方法(均采用第2代抗CCP抗原)是否適合于臨床實驗室。免疫膠體金法檢測抗CCP抗體是通過肉眼判讀的定性方法，無需特殊儀器，有利于條件有限的實驗室快檢。但是通過本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫膠體金法與酶聯(lián)免疫法的總體符合率為70.0%，陰性符合率僅為62.5%，有30份樣品檢測陽性而酶聯(lián)免疫法檢測為陰性。免疫膠體金法易受加樣、判讀時間、層析板工藝批次不一致等因素影響，不易進(jìn)行質(zhì)量控制，易導(dǎo)致假陽性結(jié)果，干擾臨床醫(yī)生的判斷，因此建議實驗室使用靈敏度高、特異度好的定量檢測方法。

采用大型生化分析儀(免疫透射比濁法)檢測抗CCP抗體有許多優(yōu)勢。由于其自動化程度高，精密度好，可以實現(xiàn)大樣本的快速檢測，試劑穩(wěn)定也易進(jìn)行質(zhì)控。但是，本研究中免疫透射比濁法與酶聯(lián)免疫法比較發(fā)現(xiàn)總體符合率為84.0%，陽性符合率和陰性符合率均不高，這可能與使用的抗原不純或抗原表位不一致有關(guān)。

酶聯(lián)免疫法是第2代抗CCP抗體的基礎(chǔ)檢測方法，雖然有著很好的表現(xiàn)，但很難自動化，檢測時間長，檢測結(jié)果易受到人為操作偏差的干擾。本研究對比酶聯(lián)免疫法與化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者有著很高的總體符合率[95%CI(94.4%，99.8%)]，但酶聯(lián)免疫法有2例假陽性結(jié)果是通過2次復(fù)查排除的，分析原因可能是洗板污染造成。此外，二者定量結(jié)果存在二次線性相關(guān)性。劉國瑞等[13]比較雅培i2000 SR(化學(xué)發(fā)光法)與德國歐蒙試劑(酶聯(lián)免疫法)檢測的結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者相關(guān)性良好，但化學(xué)發(fā)光法的臨床診斷特異度、陽性預(yù)測值及診斷一致率要高于手工酶聯(lián)免疫法。化學(xué)發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法定量檢測結(jié)果雖然呈二次線性相關(guān)，但是結(jié)果不具有可比性，因此臨床在監(jiān)測抗體水平變化時，建議患者在同一實驗室采用同一種方法檢測，便于結(jié)果的比較。性能驗證試驗顯示，化學(xué)發(fā)光法有著良好的精密度和準(zhǔn)確性，能夠滿足臨床需求。雖然檢測抗CCP抗體的化學(xué)發(fā)光試劑廠商眾多，標(biāo)準(zhǔn)化困難，但目前相關(guān)報道顯示化學(xué)發(fā)光的方法學(xué)表現(xiàn)優(yōu)異。徐雪亮等[14]研究顯示，羅氏電化學(xué)發(fā)光法和德國歐蒙手工酶聯(lián)免疫法的檢測結(jié)果一致率可達(dá)96.7%。CHO等[15]驗證了西門子Atellica化學(xué)發(fā)光試劑的檢測靈敏度和特異度達(dá)到80.3%和97.2%。

綜上所述，由于化學(xué)發(fā)光儀器自動化程度高，檢測時間短，能有效避免交叉和攜帶污染，準(zhǔn)確度更高，試劑穩(wěn)定易于質(zhì)量控制，更適合實驗室日常開展。