胃癌患者癌組織及血清中lncRNA-GC1的表達及其對化療耐藥性的影響*

陳 域，郭 欣，陳蘆斌，石秦川,劉靖圓

(空軍第九八六醫院普通外科，西安 710054)

胃癌是最常見的消化道腫瘤，在我國發病率呈逐年上升趨勢，嚴重危害患者的生命健康[1-2]。內鏡活檢是目前診斷胃癌的金標準，然而由于患者檢查時的不適和檢查成本高昂，早期胃癌尤其是無癥狀個體篩查是臨床實踐中的一大困難[3]。順鉑是當前治療胃癌的重要化療藥物之一，可不同程度地改善患者預后，但化療耐藥的發生阻礙其應用[4-5]。因此，探索具有高靈敏度和特異度的胃癌診斷新方法及胃癌細胞化療耐藥的分子機制，尋找有效的治療靶點是當前的重要課題之一[6]。近年來，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)因功能多樣性、相對穩定性及易檢測性得到了許多研究者的關注[5]。lncRNA在細胞增殖、分化及凋亡等過程的調控中具有重要作用，已被證實可作為腫瘤篩查、治療效果及預后評估的潛在靶點[7-8]。研究表明，與胃癌相關的長鏈非編碼RNA-GC1(long non-coding RNA-GC1，lncRNA-GC1)作為一種RNA聚合酶Ⅱ轉錄物，可通過與組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)和賴氨酸乙酰基轉移酶2A (K-lysine acetyltransferase 2A，KAT2A)結合，激活與靶基因超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，SOD2)有關的組蛋白修飾，從而促進胃癌的進展[9]。本研究通過檢測胃癌患者癌組織和血清中lncRNA-GC1的表達水平，探討lncRNA-GC1在胃癌篩查中的價值，以及其對胃癌患者化療耐藥性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2021年1月于本院行手術治療的胃癌患者為研究對象。納入標準：(1)經組織病理學確診為胃癌；(2)年齡18～80周歲；(3)患者自愿參與研究。排除標準：(1)合并嚴重心、腦、肝、腎疾病；(2)合并其他系統惡性腫瘤；(3)臨床病理資料完整。最終，納入86例胃癌患者(胃癌組)，其中男54例，女32例，平均年齡(61.25±5.21)歲。同時，納入同期在本院體檢的86例健康體檢者作為健康對照組，其中男55例，女31例，平均年齡(61.82±5.54)歲。兩組性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，均衡可比。本研究所有程序均符合赫爾辛基宣言，獲得本院倫理委員會批準(KYLL2020-986-22)，所有患者均自愿參與研究且簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標本采集及資料收集

取所有胃癌患者術前和健康對照組血液標本2 mL，置于無抗凝劑的真空采血管中，3 000 r/min離心5 min，取上層血清，置于-80 ℃條件下待用。術中取患者胃癌組織和癌旁正常組織(距離癌組織≥5 cm)標本，在冰上剪碎、研磨，制成懸液，于-80 ℃條件下保存。收集胃癌患者的性別、年齡、腫瘤最大徑、浸潤程度、有無神經侵犯、有無淋巴結轉移和臨床分期等臨床病理學特征。

1.2.2實時熒光定量PCR測定lncRNA-GC1表達水平

提取研究對象組織(細胞)和血清標本總RNA，采用Nano-Drop 1000分光光度計檢測，參照反轉錄試劑盒說明書要求將RNA反轉錄為cDNA，-20 ℃保存待用。參照文獻[9]設計引物，由上海天昊生物科技有限公司合成。lncRNA-GC1上游引物序列為 5′-TGG GGT AAC TTA GCA GTT TCA AT-3′，下游引物序列為5′-GGC AAG CAG TAA TCT TAC ATG ACA C-3′，片段大小110 bp。內參基因U6的上游引物序列為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物序列為5′- AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，產物片段大小94 bp。反應體系包括0.75 μL E×12 TaqMan⑧基因表達檢測液，7.5 μL TaqMan PCR反應混合液，3 μL cDNA模板，再加雙蒸水(ddH2O)至15 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環，然后用熒光定量PCR儀定量測定。采用標準曲線法對lncRNA-GC1表達水平進行相對定量分析，應用2-ΔΔCT法計算結果。

1.2.3細胞培養和轉染細胞系構建

選取胃癌細胞MKN-45作為實驗對象，來自美國典型培養物中心(American Type Culture Collection，ATCC)細胞庫。37 ℃，5% CO2條件下進行細胞培養。將lncRNA-GC1全長序列克隆進pSin載體上，進一步構建慢病毒載體并建立穩定轉染胃癌細胞系MKN-45 GC1，對照細胞不進行轉染處理(MKN-45 Vec)。48 h后應用嘌呤霉素篩選穩定轉染細胞。

1.2.4噻唑藍(MTT)實驗檢測細胞活力

將胃癌細胞系MKN-45 GC1及其對照細胞MKN-45 Vec接種于96孔細胞培養板中，每孔種植細胞數為5×103個，每種細胞平行重復3孔，24 h后細胞培養基換成含0、3、6、12 μg/mL順鉑的培養基，48 h后進行MTT實驗，檢測570 nm處吸光度(A570)值，以空白孔為參照評估各孔的增殖活力。

1.2.53-D細胞培養實驗檢測細胞增殖和生長能力

將胃癌細胞系MKN-45 GC1及其對照細胞MKN-45 Vec接種于24孔細胞培養板中，每孔種植細胞4×103個，培養基體積為500 μL，每種細胞平行重復3孔，在細胞種植后48 h更換含0.6 μg/mL順鉑的培養基處理細胞48 h，在第8天拍照檢測并定量分析細胞增殖能力。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 胃癌患者組織和血清lncRNA-GC1表達水平

胃癌患者癌組織lncRNA-GC1表達水平高于癌旁組織，差異有統計學意義(1.45±0.16vs.0.82±0.07，t=15.362，P<0.001)，見圖1A；胃癌組血清lncRNA-GC1表達水平高于健康對照組，差異有統計學意義(0.78±0.13vs.0.54±0.05，t=6.887，P<0.001)，見圖1B。

A：胃癌患者癌組織與癌旁正常組織中lncRNA-GC1表達水平比較；B：胃癌組與健康對照組血清lncRNA-GC1表達水平比較。

2.2 胃癌組織lncRNA-GC1表達水平與臨床病理特征的相關性

胃癌患者癌組織中lncRNA-GC1表達水平與腫瘤最大徑、神經侵犯、淋巴結轉移有關，腫瘤最大徑≥5 cm的患者癌組織lncRNA-GC1表達水平高于腫瘤最大徑<5 cm者，有神經侵犯的患者癌組織lncRNA-GC1表達水平高于無神經侵犯者，有淋巴結轉移的患者癌組織lncRNA-GC1表達水平高于無淋巴結轉移者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織lncRNA-GC1表達水平與臨床病理特征的相關性

續表1 胃癌組織lncRNA-GC1表達水平與臨床病理特征的相關性

2.3 胃癌患者血清lncRNA-GC1表達水平與臨床病理特征的相關性

胃癌患者血清lncRNA-GC1表達水平與腫瘤最大徑、淋巴結轉移和臨床分期有關，腫瘤直徑≥5 cm的患者血清lncRNA-GC1表達水平高于腫瘤直徑<5 cm者，有淋巴結轉移的患者血清lncRNA-GC1表達水平高于無淋巴結轉移者，腫瘤分期Ⅲ+Ⅳ的患者血清lncRNA-GC1表達水平高于腫瘤分期Ⅰ+Ⅱ者，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.4 血清lncRNA-GC1水平診斷胃癌的ROC曲線分析

ROC曲線分析結果顯示，血清lncRNA-GC1水平診斷胃癌的ROC曲線下面積(AUC)為0.849[95%CI(0.790，0.907)，P<0.001]，靈敏度為83.0%，特異度為81.4%，見圖2。

圖2 血清lncRNA-GC1水平診斷胃癌的ROC曲線

2.5 lncRNA-GC1對胃癌細胞MKN-45增殖生長能力及順鉑耐藥性的影響

實時熒光定量PCR實驗結果顯示，MKN-45 GC1細胞lncRNA-GC1表達水平較MKN-45 Vec細胞明顯升高，見圖3A。MTT實驗結果表明，MKN-45 GC1細胞活力較MKN-45 Vec細胞明顯升高；在分別加入3、6、12 μg/mL順鉑后，MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細胞的細胞活力均明顯下降，且MKN-45 GC1細胞活力均明顯高于MKN-45 Vec細胞，見圖3B。此外，3-D細胞培養實驗顯示，MKN-45 GC1細胞增殖能力明顯高于MKN-45 Vec細胞；在加入6 μg/mL順鉑后，兩種細胞增殖能力均受到抑制，且MKN-45 GC1細胞增殖能力高于MKN-45 Vec細胞，見圖3C。

表2 胃癌患者血清lncRNA-GC1表達水平與臨床病理特征的相關性

A：MKN-45 GC1與MKN-45 Vec細胞lncRNA-GC1表達水平比較；B：MTT實驗檢測不同水平順鉑作用后MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細胞活力比較；C：3-D細胞培養實驗檢測MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細胞的增殖能力；a：P<0.01;b：P<0.05。

3 討 論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，對人類健康造成了極大的威脅。然而，目前胃癌的發生、發展機制和化療耐藥機制還未完全明確[10]。lncRNA已被證實在包括胃癌在內的多種惡性腫瘤中表達異常[11]。顧秀玉等[12]研究發現，lncRNA在胃癌患者癌組織和血清中的表達明顯增加，其表達水平與胃癌患者的腫瘤大小、分化程度、脈管癌栓、神經侵犯及平均生存時間有關；部分lncRNA可作為胃癌篩查及預后判斷的分子標志物。韓涵等[13]研究顯示，lncRNA-GC1在胃癌組織中明顯高表達，并且與患者的腫瘤體積大小、淋巴結轉移和病理學分級具有相關性，此外，細胞實驗顯示lncRNA-GC1可促進胃癌細胞的增殖生長和對順鉑的耐藥性。GUO等[14]在最近的研究中報道，lncRNA-GC1在胃癌患者血清外泌體中表達明顯增加，并且可作為肺癌早期診斷的無創性分子生物標志物。本研究檢測了lncRNA-GC1在胃癌患者組織及血清中的表達水平，分析了其與患者臨床病理特征的相關性，評估了血清lncRNA-GC1作為胃癌篩查分子標志物的可行性，并探討了lncRNA-GC1在胃癌細胞增殖和順鉑化療耐藥中的作用。

本研究結果顯示，胃癌患者癌組織lncRNA-GC1表達水平明顯高于癌旁組織，血清lncRNA-GC1表達水平也明顯高于健康對照組，提示lncRNA-GC1表達水平升高可能與胃癌的發生機制有關。此外，胃癌患者癌組織lncRNA-GC1表達水平與腫瘤最大徑、神經侵犯、淋巴結轉移有關，血清lncRNA-GC1表達水平與腫瘤最大徑、淋巴結轉移和臨床分期有關。既往研究顯示，腫瘤的疾病進展在一定程度上與腫瘤大小、神經侵犯、淋巴結轉移等有關[15]。因此，lncRNA-GC1表達水平升高可能與胃癌的疾病進展有關。盡管既往研究已表明血清外泌體lncRNA-GC1表達水平可作為肺癌早期診斷的有效分子標志物[16-17]，但考慮到血清檢測快速、方便、廉價的優勢，本研究應用ROC曲線分析了血清lncRNA-GC1診斷胃癌患者的效能，結果顯示，血清lncRNA-GC1水平對胃癌的診斷效能較好，靈敏度為83.0%，特異度為81.4%，具有一定的臨床應用價值。

本研究還進行了細胞實驗，探究lncRNA-GC1對胃癌化療耐藥的影響。結果顯示，轉染后的MKN-45 GC1細胞lncRNA-GC1水平明顯高于MKN-45 Vec細胞，說明轉染成功。MTT實驗結果表明，MKN-45 GC1細胞的細胞活力較MKN-45 Vec細胞明顯升高；加入順鉑后，MKN-45 GC1和MKN-45 Vec細胞的細胞活力均明顯下降，且MKN-45 GC1細胞活力高于MKN-45 Vec細胞。3-D細胞培養實驗顯示，MKN-45 GC1細胞的增殖能力明顯高于MKN-45 Vec細胞；加入6 μg/mL順鉑后，兩種細胞的增殖能力均受到抑制，且MKN-45 GC1細胞增殖能力強于MKN-45 Vec細胞。以上結果表明，lncRNA-GC1可促進胃癌細胞MKN-45的增殖生長，并促進細胞對順鉑的耐藥。

本研究仍存在一些局限性：(1)所有研究對象均來自同一醫院，可能存在選擇偏倚；(2)納入患者的樣本量較小；(3)未進行術前、術后及復發胃癌患者血清lncRNA-GC1表達水平的比較，對lncRNA-GC1在胃癌中診斷價值的評估還不夠全面。在今后的研究中會進一步完善這些不足，以獲得更為準確的結果。

綜上所述，lncRNA-GC1在胃癌患者組織和血清中表達上調，可作為胃癌篩查及預后判斷的分子標志物，并且體外細胞實驗表明lncRNA-GC1可促進胃癌細胞MKN-45的增殖生長，促進細胞對順鉑的耐藥。