禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒單抗制備及在外源病毒檢測(cè)中的應(yīng)用

陳曉春，趙 煒，蘇 佳，王 嘉，侯力丹，黃小潔，吳華偉，李俊平

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(Reticuloendotheliosis，RE)是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)群引起的幾種禽類(lèi)的一群病理綜合征，主要包括矮小綜合征、淋巴組織及其他組織形成的慢性腫瘤、急性網(wǎng)狀細(xì)胞腫瘤等[1]，能引起嚴(yán)重的免疫抑制。該病在禽群中普遍存在，而且一旦種禽感染，可通過(guò)垂直傳播迅速波及整個(gè)群體。疫苗中污染REV被認(rèn)為是近些年引起RE傳播和流行的主要途徑，報(bào)道最多的是被REV污染的禽痘疫苗和馬立克氏病疫苗使用后引起的嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2-3]，其次是禽成髓細(xì)胞性白血病病毒作為反轉(zhuǎn)錄酶的來(lái)源而廣泛用于生化研究，其種毒含有低水平的REV[4]。2004年，丁家波等利用間接免疫熒光法(Indirect immunofluorescence assay, IFA)、PCR和核酸雜交等方法，對(duì)國(guó)內(nèi)多家企業(yè)生產(chǎn)的禽痘病毒疫苗和禽痘病毒(Fowl pox virus, FPV)臨床分離株進(jìn)行了REV污染和基因整合情況研究，發(fā)現(xiàn)所有疫苗樣品的FPV基因組和臨床分離株中均檢出REV核酸陽(yáng)性或病毒陽(yáng)性，這是我國(guó)首次關(guān)于FPV基因組中整合進(jìn)REV基因組成分的報(bào)道[5]。2005-2009年，李俊平等對(duì)203批次禽用活疫苗采用IFA法進(jìn)行REV污染檢測(cè)，結(jié)果檢出雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗和雞痘活疫苗(鵪鶉化弱毒)2個(gè)品種共8個(gè)批次呈陽(yáng)性(3.9%)[4]。

目前，我國(guó)已強(qiáng)制要求獸用活疫苗生產(chǎn)必須使用SPF雞胚，徹底杜絕用非免疫雞胚制備活疫苗，在一定程度上保證了禽用疫苗的質(zhì)量和養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。《歐洲藥典》和《英國(guó)藥典(獸藥)》只對(duì)生產(chǎn)禽源疫苗的種毒和生產(chǎn)原材料(主要是SPF雞胚)進(jìn)行REV污染的檢測(cè)，對(duì)成品中是否污染REV沒(méi)有要求檢測(cè)?！度毡巨r(nóng)林水產(chǎn)省獸醫(yī)生物制品標(biāo)準(zhǔn)》要求對(duì)成品進(jìn)行REV污染檢測(cè)。我國(guó)從2010年版《中國(guó)獸藥典》開(kāi)始將REV和禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)的檢測(cè)列入禽外源病毒檢測(cè)必檢項(xiàng)目[3]。REV檢測(cè)采用IFA方法進(jìn)行，使用的一抗為SPF雞制備的多克隆抗體，染色效果良好。但制備多克隆抗體過(guò)程繁瑣、周期長(zhǎng)、成本高，而且多克隆抗體本身的特異性也有待提高。為降低制備成本，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)的特異性，本研究制備了針對(duì)REV主要囊膜蛋白gp90的單克隆抗體，并建立了基于單抗的IFA方法，用于外源性REV檢驗(yàn)。

1 材 料

1.1 細(xì)胞與動(dòng)物 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、BALB/c小鼠等單克隆抗體制備用材料均由北京六合華大蛋白研發(fā)中心有限公司提供。雞胚成纖維細(xì)胞(Chick embryo fibroblast, CEF)按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行制備。

1.2 病毒

1.2.1 REV REV-T株由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存；CY 1111株(2011年，山東，蛋雞)[6]、SY 1209株(2012年，遼寧，蛋雞)[6]、HS/1412 R株(2014年，遼寧，蛋雞)[7]、HLJR 0901株(2009年，黑龍江，蛋雞)[8]，均由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；HA 1101株(2011，江蘇，蛋雞)[9]，由揚(yáng)州大學(xué)教育部禽類(lèi)預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；IBD-C 1605株(2015，山東，REV污染疫苗)[10]、REV 161214株(2016，河北，蛋雞)、SDAUS-1株(2016，河北，公雞精液)，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.2 ALV ALV-A(RAV-1株)、ALV-B(RAV-2株)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存；ALV-C(RAV-49)、ALV-J(HPRS-103)由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；ALV-K(SDAUAK 11株)[11]由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.3 其他病毒 雞新城疫病毒(NDV)La Sota株、雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)B87株、火雞皰疹病毒(HVT)Fc126株、雞馬立克氏病毒活疫苗(MDV)CVI 988株、禽腺病毒I群(FAdV-I)YR36株,均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.3 菌種、載體 表達(dá)載體pET-30a、表達(dá)菌BL21及蛋白表達(dá)與純化試劑均由北京六合華大蛋白研發(fā)中心有限公司提供。

1.4 其他試劑 FITC標(biāo)記的抗小鼠IgG，sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；M199細(xì)胞培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品。

2 方 法

2.1 免疫原的制備 根據(jù)GenBank上公布的REV序列，采用DNAStar軟件對(duì)SU蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)、親疏水性、抗原性和功能區(qū)的分析，選取抗原表位相對(duì)集中的53～362 aa蛋白序列作為目的片段。對(duì)該區(qū)域的核苷酸片段(1098 bp)進(jìn)行合成，并在5′和3′端加入EcoRⅠ和XhoI酶切位點(diǎn)，用于載體的克隆。序列合成在北京六合華大蛋白研發(fā)中心有限公司進(jìn)行。

用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoI分別對(duì)合成的序列和質(zhì)粒pET-30a進(jìn)行雙酶切，將純化回收的片段和表達(dá)載體酶切產(chǎn)物用DNA Ligation Kit連接后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞(BL21)。挑取單克隆菌株培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定后，用IPTG(0.5 mmol/L)16 ℃誘導(dǎo)過(guò)夜，離心收獲菌體，超聲破菌(500 W，180次，每次5 s，間隔5 s)。通過(guò)鎳柱純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度在85 %以上時(shí)，作為單抗的免疫原。

2.2 單克隆抗體的制備與鑒定 用上述純化蛋白按每只小鼠30 μg～60 μg的劑量，多次皮下注射4只BALB/c雌性小鼠。采用間接ELISA檢測(cè)小鼠抗體效價(jià)，對(duì)血清效價(jià)較高的小鼠，用免疫原50 μg進(jìn)行腹腔注射免疫沖擊一次，免疫后3日，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合。將上述融合細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)SU蛋白包被的ELISA板進(jìn)行兩次篩選，挑選ELISA陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞株上清采用IFA方法篩選與REV全病毒具有良好反應(yīng)性的細(xì)胞株。然后選取免疫熒光檢測(cè)為陽(yáng)性的細(xì)胞株采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至細(xì)胞克隆抗體陽(yáng)性率達(dá)100 %，擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮中保存。對(duì)篩選出的雜交瘤細(xì)胞株分別進(jìn)行亞型鑒定、細(xì)胞穩(wěn)定性檢測(cè)、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)。

2.3 腹水的制備 經(jīng)鑒定合格后，制備小鼠腹水。取9周齡BALB/c小鼠10只，腹腔注射降植烷，每只0.5 mL。7～10 d后每只小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106～1×107/0.5mL，7～10 d后觀察小鼠狀態(tài)，待小鼠腹部明顯膨大、行動(dòng)不便時(shí)，抽取小鼠腹水，3000 r/min離心10 min，取上清，-40 ℃保存。間隔2～3 d，若腹水再次產(chǎn)生，可再次采集。

2.4 效價(jià)測(cè)定 將REV-T株病毒液用含2%新生牛血清的M199培養(yǎng)液稀釋成100 TCID50/0.1mL，接種已長(zhǎng)成良好CEF單層的96孔板，100 μL/孔。然后置37 ℃、含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)5 d，冷甲醇固定。將腹水進(jìn)行1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800、1∶25600、1∶51200、1∶102400稀釋?zhuān)瑴y(cè)定效價(jià)。

2.5 特異性試驗(yàn) 對(duì)接種了ALV(RAV-1株和RAV-2株)、NDV(La Sota株)、IBDV(B87株)、FAdV-I(YR36株)、HVT(Fc126株)、MDV(CVI 988株)等病原(毒株信息見(jiàn)1.2項(xiàng))的帶毒細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)特異性熒光，以確定該單抗的特異性。

2.6 單抗反應(yīng)性協(xié)作標(biāo)定 委托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)家禽腫瘤病實(shí)驗(yàn)室、揚(yáng)州大學(xué)教育部禽類(lèi)預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)該單抗進(jìn)行不同REV毒株反應(yīng)性和不同亞型ALV毒株反應(yīng)性驗(yàn)證試驗(yàn)。毒株信息見(jiàn)1.2項(xiàng)。

2.7 IFA方法的建立

2.7.1 IFA試驗(yàn)程序

2.7.1.1 病毒感染細(xì)胞板的制備 將陽(yáng)性病毒用含2%新生牛血清的M199培養(yǎng)液稀釋成100 TCID50/0.1mL，接種已長(zhǎng)成良好CEF單層的96孔板，100 μL/孔。然后置37 ℃、含5% CO2的溫箱中培養(yǎng)5 d，進(jìn)行間接免疫熒光染色。

2.7.1.2 固定 采用冷甲醇固定細(xì)胞板，自然晾干，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.7.1.3 加一抗(單克隆抗體) 將待檢的單克隆抗體用PBS稀釋適宜倍數(shù)，加入REV感染細(xì)胞板中，37 ℃孵育。

2.7.1.4 洗滌 棄去板孔中的一抗，用PBS洗滌并輕微振蕩洗滌。

2.7.1.5 熒光二抗染色 盡量棄盡洗液，每孔加入用PBS作適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37 ℃避光孵育。

2.7.1.6 洗滌 方法同2.7.1.4項(xiàng)。

2.7.1.7 觀察 在倒置熒光顯微鏡下用藍(lán)色激發(fā)光(波長(zhǎng)490 nm)觀察。被感染的CEF細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，有完整的細(xì)胞形態(tài)，周?chē)锤腥炯?xì)胞不著色，視野發(fā)暗。

2.7.1.8 結(jié)果判定 正常細(xì)胞對(duì)照背景最暗且無(wú)特異性熒光。根據(jù)熒光強(qiáng)弱，其結(jié)果可判為-(無(wú)特異性熒光，背景純凈)、+(1個(gè)視野內(nèi)有1個(gè)左右的特異性熒光)、++(1個(gè)視野內(nèi)有1～10個(gè)特異性熒光)、+++(1個(gè)視野內(nèi)有10個(gè)以上特異性熒光)。

利用小型榨油機(jī)榨取油脂，其出油率在21.1%～24.6%，其中三層模式的出油率平均最高，達(dá)到23.5%，此時(shí)毛葉山桐子油料最終含水量在8%，這與其他油料作物（如油菜）安全水分相近[12]。榨取的毛油酸價(jià)和過(guò)氧化值分別在 3.1～3.4 mg/g，2.1～2.9 mmol/kg，并且各處理各干燥層數(shù)值無(wú)顯著差異（p＞0.05），均低于國(guó)家對(duì)菜籽、油茶籽等毛油的品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，優(yōu)于崔艷南等人[13]研究的未處理的工廠化毛葉山桐子毛油品質(zhì)，這與干燥前處理與設(shè)備均有關(guān)系。

2.7.2 IFA試驗(yàn)最適工作條件的確定

2.7.2.1 一抗工作濃度的確定 按照2.7.1項(xiàng)程序，以REV單克隆抗體作為一抗，工作濃度設(shè)1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400稀釋度，以呈現(xiàn)“+++”熒光強(qiáng)度的最大稀釋倍數(shù)作為一抗的最適工作濃度。

2.7.2.2 二抗工作濃度的確定 以上述確定的反應(yīng)條件，將二抗分別作1∶100、1∶200、1∶400稀釋?zhuān)M(jìn)行IFA反應(yīng)，以呈現(xiàn)“+++”熒光強(qiáng)度的最大稀釋倍數(shù)作為二抗的最適工作濃度。

2.7.2.3 一抗作用時(shí)間的確定 以上述確定的反應(yīng)條件，分別以30 min、45 min、60 min作為一抗作用時(shí)間，進(jìn)行IFA反應(yīng)，觀察比較一抗作用時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，確定一抗最適作用時(shí)間。

2.7.2.4 二抗作用時(shí)間的確定 以上述確定的反應(yīng)條件，分別以30 min、45 min、60 min作為二抗作用時(shí)間，進(jìn)行IFA反應(yīng)，觀察比較二抗作用時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，確定二抗最適作用時(shí)間。

2.8 人工感染試驗(yàn) 取雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)、雞新城疫病毒活疫苗(La Sota株)和雞馬立克氏病活疫苗(CVI 988株)三種疫苗各1批，樣品處理前每500羽份分別加入含50 TCID50、10 TCID50、5 TCID50、1 TCID50的REV-T株陽(yáng)性病毒，同時(shí)設(shè)定未添加REV的疫苗對(duì)照組，按照《中國(guó)獸藥典》2015年版三部附錄3304進(jìn)行樣品處理、接種和傳代培養(yǎng)，采用上述建立的IFA方法進(jìn)行熒光染色，確定該方法最小檢出限。同時(shí)采用REV多克隆抗體進(jìn)行比較和驗(yàn)證。

3 結(jié)果與分析

3.1 重組SU蛋白的表達(dá) 重組菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破菌，離心，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果在沉淀中檢測(cè)到大量的目的蛋白，說(shuō)明該重組蛋白表達(dá)形式為包涵體表達(dá)(圖1)。

M：Marker；1：超聲后上清； 2：超聲后沉淀M：Marker; 1：Supernatant after ultrasound； 2：Precipitation after ultrasound圖1 REV-SU蛋白可溶性分析Fig 1 Solubility analysis of REV-SU protein

3.2 重組SU蛋白的純化與鑒定 純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)SDS-PAGE凝膠掃描分析估計(jì)蛋白濃度為0.5 mg/mL，純度為85%。SDS-PAGE結(jié)果顯示在約46 kD處有明顯蛋白條帶(圖2)。

M：Marker；1：蛋白原樣；2：流穿；3： 15 mmol/L 咪唑洗脫；4： 60 mmol/L咪唑洗脫；5： 500 mmol/L 咪唑洗脫；6： 0.5 mg/mL BSAM：Marker; 1：Original protein; 2：Flow through; 3：Eluted by 15 mmol/L imidazole; 4：Eluted by 60 mmol/L imidazole; 5：Eluted by 500 mmol/L imidazole; 6： 0.5 mg/mL BSA圖2 REV-SU蛋白純化SDS-PAGE圖Fig 2 SDS-PAGE of purified REV-SU protein

3.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選 采用REV-T株對(duì)ELISA陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行IFA篩選，結(jié)果篩選出1株與病毒產(chǎn)生特異性熒光的雜交瘤細(xì)胞，命名為Mab-SU-2A2株。結(jié)果見(jiàn)圖3。

3.4 雜交瘤細(xì)胞的鑒定結(jié)果 純凈性檢驗(yàn)結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞株Mab-SU-2A2株無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)支原體生長(zhǎng)，無(wú)外源病毒污染，純凈性良好；該細(xì)胞株亞型為IgG2a亞型；連續(xù)培養(yǎng)10代，培養(yǎng)上清IFA效價(jià)均在1∶10～1∶20，穩(wěn)定性好。

3.5 腹水效價(jià)測(cè)定 大量制備小鼠腹水，用IFA方法測(cè)定抗體效價(jià)，結(jié)果表明，Mab-SU-2A2株單抗腹水稀釋至1∶51200時(shí)，細(xì)胞仍可見(jiàn)特異性綠色熒光(圖4)，IFA效價(jià)為1∶51200。

圖4 單抗2A2腹水效價(jià)測(cè)定結(jié)果Fig 4 Determination of IFA titer of Mab 2A2 ascites

3.6 特異性試驗(yàn) 對(duì)接種了ALV(RAV-1株和RAV-2株)、NDV(La Sota株)、IBDV(B87株)、FAdV-I(YR36株)、HVT(Fc126株)、MDV(CVI 988株)病原的帶毒細(xì)胞進(jìn)行REV單抗熒光染色，均未檢測(cè)到特異性熒光，說(shuō)明該單抗特異性良好。

3.7 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果 三家實(shí)驗(yàn)室協(xié)作標(biāo)定結(jié)果顯示，Mab-SU-2A2株單克隆抗體對(duì)于不同的REV毒株具有良好的反應(yīng)性，分離株分別分離自山東、遼寧、黑龍江、吉林、河北等地，分離年份從2011年至2016年，樣品來(lái)源包括蛋雞、公雞精液及受污染的IBDV疫苗(圖5)；與分離自不同年份的A、B、C、J、K等亞群的ALV毒株均無(wú)交叉反應(yīng)(圖6)，特異性良好。

圖5 單抗2A2與不同REV毒株反應(yīng)性結(jié)果Fig 5 Reaction between Mab-Su-2A2 with different REV strains

圖6 單抗2A2與不同ALV毒株反應(yīng)性結(jié)果Fig 6 Reaction between Mab-Su-2A2 with different ALV strains

3.8 IFA方法條件優(yōu)化 經(jīng)優(yōu)化，確定IFA最適反應(yīng)條件為：一抗1∶800稀釋?zhuān)饔脮r(shí)間60 min；二抗1∶200稀釋?zhuān)饔脮r(shí)間60 min。

3.9 人工感染試驗(yàn) 結(jié)果表明，采用REV單克隆抗體作為一抗對(duì)污染了不同劑量REV的雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)、雞新城疫病毒活疫苗(La Sota株)和雞馬立克氏病活疫苗(CVI 988株)三種疫苗進(jìn)行檢測(cè)的最低檢出量分別為5 TCID50、5 TCID50、10 TCID50，與雞抗REV多克隆抗體作為一抗進(jìn)行熒光染色結(jié)果相當(dāng)(分別為5 TCID50、10 TCID50、10 TCID50)，且背景更加純凈(圖7)。

A：10 TCID50污染組REV單抗染色；B：疫苗對(duì)照組REV單抗染色；C：10 TCID50污染組REV多克隆抗體染色；D：疫苗對(duì)照組REV多克隆抗體染色A：Stained with REV Mab in 10 TCID50 contaminated group; B：Stained with REV Mab in negative control; C：Stained with REV Pab in 10 TCID50 contaminated group; D：Stained with REV Pab in negative control圖7 活疫苗中人工感染REV的IFA檢測(cè)Fig 7 IFA detection of artificial-infected REV in live vaccine

4 討論與結(jié)論

REV感染可引起雞群生產(chǎn)性能下降和免疫功能低下，一旦疫苗污染REV，可對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此對(duì)禽用活疫苗進(jìn)行REV污染檢測(cè)是確保疫苗產(chǎn)品質(zhì)量和嚴(yán)格控制REV的重要手段?！吨袊?guó)獸藥典》2010年版三部收錄了外源性REV檢驗(yàn)方法[12],該方法的頒布實(shí)施對(duì)禽用生物制品的質(zhì)量控制起到了至關(guān)重要的作用。2021年，李雪蓮隨機(jī)抽取4種市售活疫苗，利用RT-PCR法、《中國(guó)獸藥典》IFA檢測(cè)法和SPF雞檢查法檢測(cè)活疫苗中的REV污染，比較三種檢測(cè)方法的優(yōu)劣。結(jié)果表明，RT-PCR法方便、快捷，但會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性；SPF雞檢查法結(jié)果可靠，但周期較長(zhǎng)，成本高；IFA檢測(cè)法與傳統(tǒng)雞檢查法相比具有快速、準(zhǔn)確、成本低的優(yōu)點(diǎn)，便于臨床推廣應(yīng)用[13]?！吨袊?guó)獸藥典》2010年版和2015年版中該方法采用REV多克隆抗體作為熒光染色的一抗，在實(shí)施過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，受細(xì)胞狀態(tài)、接種樣品品種等因素的影響，偶爾會(huì)出現(xiàn)檢測(cè)背景不清的現(xiàn)象。

gp90蛋白是一種膜表面糖蛋白，在不同時(shí)期和地域的REV分離株基因組中其氨基酸同源性超過(guò)95%[14]，保守性好，常被作為REV檢測(cè)和禽病毒性淋巴瘤(MDV和ALV)鑒別診斷的一個(gè)重要靶標(biāo)蛋白[15-16]。因此本研究將REV囊膜蛋白gp90(SU)作為免疫原制備了單克隆抗體。該單抗與不同REV毒株均具有良好的反應(yīng)性，且與不同ALV毒株和常見(jiàn)禽源病毒均沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性良好。采用該單克隆抗體建立的IFA方法可檢出至少5 TCID50的REV感染，與多克隆抗體作為檢測(cè)一抗具有同等效力，且檢測(cè)背景更加純凈清晰。該成果已被《中國(guó)獸藥典》2020年版三部收錄[17]，用于禽用生物制品及原材料中外源性REV的檢測(cè)，為有效控制我國(guó)禽用活疫苗質(zhì)量、完善國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和動(dòng)物疫病防控提供了技術(shù)支持。

致謝：感謝哈爾濱獸醫(yī)研究所高玉龍研究員、揚(yáng)州大學(xué)錢(qián)琨博士、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)趙鵬教授對(duì)本文給予的大力支持和幫助！