兩種氟苯尼考注射液在雞體內(nèi)比較藥動(dòng)學(xué)研究

楊 潔，李慧素，彭 麗，孟 蕾，張盼盼，吳寧鵬

(河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

氟苯尼考(Florfenicol，F(xiàn)FC)，是80年代后期成功研制的一種動(dòng)物專用酰胺醇類廣譜抗菌藥，1990年首次在日本上市，同年在韓國上市，而后相繼在挪威、法國、英國、奧地利、墨西哥及西班牙等上市[1]，我國于1999年批準(zhǔn)上市。氟苯尼考具有毒性低，對(duì)環(huán)境污染小，殺菌作用強(qiáng)、不易產(chǎn)生耐藥性和其他藥物沒有交叉耐藥性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于巴氏桿菌和大腸埃希菌感染，對(duì)呼吸道系統(tǒng)感染和腸道感染療效顯著[1-3]。我國至今已批準(zhǔn)氟苯尼考子宮注入劑、氟苯尼考可溶性粉、氟苯尼考注射液、氟苯尼考粉、氟苯尼考溶液、氟苯尼考預(yù)混劑、氟苯尼考膠囊等7種劑型在牛、豬、雞、魚、蠶等動(dòng)物上使用[4]。仿制藥品需選用原研品為參比制劑，但先靈葆雅動(dòng)物保健公司法國廠生產(chǎn)的氟苯尼考注射液僅批準(zhǔn)用于豬，我國獸藥典(2020版)批準(zhǔn)氟苯尼考注射液可用于豬、雞和魚使用，因此，選擇河南某公司生產(chǎn)的雞用氟苯尼考注射液為參比制劑，進(jìn)行比較藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，考察兩種制劑間的差異，以期為實(shí)驗(yàn)室自制氟苯尼考注射液工藝優(yōu)化提供參考。

1 材 料

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜儀(美國Waters公司，Acquity UPLC)；高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；電子分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；IKA MS3 basic漩渦儀(艾卡廣州儀器設(shè)備有限公司IKA中國))；TTL-DCⅡ型氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；Milli-QA10 超純水儀(美國MiLipore公司)。乙腈(色譜純，美國Merck公司)；磷酸二氫鉀、正己烷、乙酸乙酯(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；

1.2 藥品和試劑的配制 氟苯尼考注射液，10 mL∶1 g(實(shí)驗(yàn)室自制)。氟苯尼考注射液，10 mL∶1 g，批號(hào)：17101701(河南某公司生產(chǎn))。氟苯尼考對(duì)照品(純度99.1%，批號(hào)：K0301703，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制：精密稱取氟苯尼考對(duì)照品10.07 mg，于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃下保存，有效期為3個(gè)月；pH 7.0磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸二氫鉀0.68 g，加0.1 M NaOH溶液29.1 mL，用水稀釋至100 mL；乙腈水飽和的正己烷：向正己烷溶液中加入乙腈水(23∶77)即可。

2 方 法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇體重約1.83±0.24 kg的健康黃羽肉雞30只，公母各半，購自鶴壁市永達(dá)食品有限公司，常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，飼料為不含抗菌藥物的全價(jià)日糧。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和給藥方案 30只雞隨機(jī)分為兩組，每組各15只。給藥時(shí)以氟苯尼考計(jì)，均按照20 mg/kg bw的劑量單劑量肌內(nèi)注射給藥。

2.3 血樣采集 給藥前禁食12 h，給藥4 h后恢復(fù)正常飲食。雞采用側(cè)臥方式保定，用2.5 mL注射器翼下靜脈采血。分別在給藥前及給藥后0.167、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、24、48 h采血，每次采血約1.5 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，4000 r/min離心10 min取上層血漿，-20 ℃保存。

2.4 檢測(cè)條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈：水(23∶77)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長：223 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.5 血漿樣品前處理 血漿樣品自然解凍后，取血漿500 μL于離心管中，加入500 μL pH 7.0磷酸鹽緩沖液，混勻后再加入2 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，以10000 r/min離心10 min，吸取全部上清液于15 mL離心管中，用乙酸乙酯重復(fù)提取1次，合并有機(jī)相，于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑?.5 mL流動(dòng)相復(fù)溶，混勻后再加0.5 mL乙腈水飽和的正己烷，渦旋混勻，6000 r/min離心10 min，吸取下層澄清液體。過0.22 μm濾膜過濾，供超高效液相色譜儀測(cè)定。

2.6 方法學(xué)

2.6.1 特異性 取空白血漿、待測(cè)血漿樣品，按2.5項(xiàng)血漿樣品前處理后和濃度2.5 μg/mL 氟苯尼考對(duì)照品同時(shí)上機(jī)檢測(cè)，觀察出峰附近有無干擾。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7份空白血漿樣品，按2.5項(xiàng)血漿樣品前處理下操作至氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確移取0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10 μg/mL 氟苯尼考系列濃度各0.5 mL，溶解殘余物。上機(jī)檢測(cè)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.6.3 檢測(cè)限和定量限 取空白血漿樣品，進(jìn)行不同濃度的添加回收試驗(yàn)，按2.5項(xiàng)血漿樣品前處理處理樣品，再按2.4項(xiàng)檢測(cè)條件分析測(cè)定，依照信噪比S/N≥3為檢測(cè)限(Limit of detection，LOD)，S/N≥10為定量限(Limit of quantification，LOQ)。

2.6.4 準(zhǔn)確度與精密度 取空白血漿，配制成0.1、2、4、8 μg/mL四個(gè)添加濃度的氟苯尼考溶液，每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品，共做3個(gè)批次，按2.5項(xiàng)血漿樣品前處理方法處理樣品，再按2.4項(xiàng)檢測(cè)條件分析測(cè)定。

2.6.5 穩(wěn)定性 取空白血漿，配制成0.1、2、4、8 μg/mL四個(gè)添加濃度的氟苯尼考血漿樣品，分別置于4 ℃下放置48 h，-20 ℃條件下存放30 d，反復(fù)凍融3次后，按2.5項(xiàng)血漿樣品前處理方法處理樣品，再按2.4項(xiàng)檢測(cè)條件分析測(cè)定，考察樣品放置穩(wěn)定性。

2.7 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)UPLC-UV分析所得血藥濃度，用WinNonlin 8.1藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行非房室模型計(jì)算各組藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，SPSS 20.0比較藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的差異顯著性，并用GraphPad Prism 6.0制作藥時(shí)曲線圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)結(jié)果

3.1.1 特異性 在本試驗(yàn)條件下測(cè)得氟苯尼考的保留時(shí)間為2.7 min，血漿樣品中氟苯尼考與血漿雜質(zhì)峰分離效果較好，峰形良好，血漿中其它物質(zhì)對(duì)氟苯尼考的測(cè)定無干擾(圖1)。

A：空白血漿色譜圖；B：氟苯尼考血漿樣品色譜圖；C：氟苯尼考對(duì)照品色譜圖(std 2.5 μg/mL)；A：Chromatogram of the blank plasma；B：Chromatogram of florfenicol plasma sample；C：Chromatogram of florfenicol(std 2.5 μg/mL)；圖1 氟苯尼考色譜圖Fig 1 Chromatogram of florfenicol

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在0.1～10.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，氟苯尼考色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，回歸方程為y=83443x-279.5，r=0.9999，呈良好的線性關(guān)系，符合分析要求。

3.1.3 檢測(cè)限和定量限 依照信噪比S/N≥3為檢測(cè)限，S/N≥10為定量限，氟苯尼考在血漿中的檢測(cè)限為0.05 μg/mL，定量限為0.1 μg/mL。

3.1.4 準(zhǔn)確度與精密度 空白血漿添加樣品在0.1～8 μg/mL范圍內(nèi)，平均回收率在93.2%～97.1%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)在1.4%～6.2%之間，回收率穩(wěn)定，適用于雞血漿樣品中氟苯尼考的測(cè)定，具體見表1。

表1 雞血漿中氟苯尼考血藥濃度方法回收率及精密度Tab 1 Florfenicol result of recovery test in chicken plasma

3.1.5 穩(wěn)定性 氟苯尼考血漿樣品分別在4 ℃下放置48 h，-20 ℃條件下存放30 d，反復(fù)凍融3次后，檢測(cè)結(jié)果表明，平均回收率在92.1%～97.5%之間，變異系數(shù)在1.7%～5.2%之間，穩(wěn)定性保持良好，具體結(jié)果見表2。

表2 血漿樣品穩(wěn)定性結(jié)果Tab 2 results of plasma sample stability

3.2 藥動(dòng)學(xué)特征 雞單劑量(20 mg/kg bw)肌內(nèi)注射氟苯尼考參比制劑和受試制劑后，兩種制劑的平均血藥濃度見表3，主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表4，不同時(shí)間測(cè)得的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

表3 兩種制劑的平均血藥濃度(μg/mL)Tab 3 Mean plasma concentrations of the two preparations

表4 兩種制劑的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of the two preparations

圖2 兩種制劑的平均藥時(shí)曲線圖Fig 2 Mean plasm concentration-time curves of two preparations

4 討 論

4.1 前處理方法的優(yōu)化 血漿中氟苯尼考的提取，大多采用乙腈[5-7]、乙酸乙酯[8-11]或pH 7.0磷酸鹽緩沖液和乙酸乙酯[12-14]等作為提取液，本文分別比較了三者的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯比乙腈的回收率高，可達(dá)到86%以上，但當(dāng)先加pH 7.0磷酸鹽緩沖液，再加乙酸乙酯時(shí)，回收率更高，可達(dá)到90%以上，因此最終采用磷酸鹽和乙酸乙酯組合提取。這可能與0.5%氟苯尼考水溶液pH值為4.5～6.5呈弱酸性，而乙腈主要起沉淀蛋白作用，但磷酸鹽緩沖液具有鹽平衡緩沖作用，乙酸乙酯能從水溶液中有效萃取氟苯尼考有關(guān)[15]。樣品用流動(dòng)相復(fù)容后，發(fā)現(xiàn)溶液比較渾濁，又加入乙腈水飽和正己烷進(jìn)一步除脂，溶液澄清且能更好的溶解上機(jī)檢測(cè)。

4.2 藥動(dòng)學(xué)特征 氟苯尼考在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究報(bào)道較多，劉芳等[11]報(bào)道雞分別內(nèi)服15 mg/kg bw的10%氟苯尼考粉和19.91%氟苯尼考粉后，Cmax分別為5.11 μg/mL和5.78 μg/mL，Tmax分別為1.90 h和0.60 h，t1/2分別為7.51 h和9.16 h，MRT為5.69 h和4.36 h，AUC0→t分別為25.749(μg/mL)h和26.47(μg/mL)h；Ehab等[16]報(bào)道雞內(nèi)服20 mg/kg bw兩種10%氟苯尼考口服液后，Cmax分別為9.02 μg/mL和9.20 μg/mL，Tmax分別為1.02 h和1.05 h，t1/2分別為1.41 h和1.35 h，MRT為2.72 h和2.62 h，AUC0→t分別為26.45(μg/mL)h和26.06(μg/mL)h；Liu Y等[6]報(bào)道4周齡肉雞內(nèi)服20 mg/kg bw氟苯尼考后，Cmax為3.87 μg/mL，Tmax為0.63 h，t1/2為3.27 h，MRT為16.96 h，AUC0→t分別為8.58(μg/mL)h；Husamettin等[13]報(bào)道雞內(nèi)服40 mg/kg bw氟苯尼考溶液后，Cmax為7.46 μg/mL，Tmax為1.5 h，AUC0→t為51.95(μg/mL)h；EMA[17]報(bào)道肉雞單次靜注54.4 mg/kg bw氟苯尼考注射液后，血清中氟苯尼考濃度從5 min的58.5 μg/mL，到8 h下降到0.069 μg/mL，10 h后未檢出，t1/2為0.61 h；本試驗(yàn)雞單次肌注20 mg/kg bw受試制劑后，t1/2為(3.39±2.65)h，Tmax為(0.66±0.30)h，Cmax為(7.06±2.35)μg/mL，AUC0→t為(19.05±5.79)(μg/mL)h，MRT為(3.25±1.25)h。可以看出，雞在給藥劑量相同，給藥方式和藥物制劑不同時(shí)，Ehab試驗(yàn)達(dá)峰濃度和藥時(shí)曲線下面積最大，Liu Y試驗(yàn)達(dá)峰最快，本試驗(yàn)消除半衰期最長；雞在給藥方式相同，給藥劑量和藥物制劑不同時(shí)，Ehab試驗(yàn)雞內(nèi)服氟苯尼考口服液達(dá)峰濃度最高，劉芳試驗(yàn)內(nèi)服10%氟苯尼考粉達(dá)峰最慢，Husamettin試驗(yàn)雞內(nèi)服40 mg/kg bw氟苯尼考溶液藥時(shí)曲線下面積最大。

在不同動(dòng)物體內(nèi)肌注20 mg/kg bw氟苯尼考注射液后：張志娟等[9]報(bào)道豬體內(nèi)Cmax為5.74 μg/mL，Tmax為2.4 h，t1/2為11.78 h，MRT為16.96 h，AUC0→t為85.21(μg/mL)h；Holmes等[18]報(bào)道成年羊駝體內(nèi)Cmax為4.31 μg/mL，Tmax為1 h，t1/2為17.59 h，MRT為21.01 h，AUC0→t為51.83(μg/mL)h；Sheetal等[19]報(bào)道山羊體內(nèi)Cmax為3.07 μg/mL，Tmax為0.5 h，t1/2為0.65 h，MRT為6.24 h，AUC0→t為20.6(μg/mL)h。可以看出，氟苯尼考在不同動(dòng)物體內(nèi)，給藥劑量和給藥方式相同的情況下，雞體內(nèi)達(dá)峰濃度最高，山羊體內(nèi)達(dá)峰最快，成年羊駝體內(nèi)消除最慢，豬體內(nèi)藥時(shí)曲下面積最大，平均駐留時(shí)間最長。

綜上所述，雞單劑量肌內(nèi)注射20 mg/kg bw受試制劑和參比制劑后，雖然藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無顯著性差異(P>0.05)，但相比參比制劑，受試制劑的消除半衰期短，達(dá)峰快，達(dá)峰濃度低，藥時(shí)曲線下面積小，平均駐留時(shí)間短，相對(duì)生物利用度較低，僅為87.55%，兩種制劑的工藝可能差異較大。