頂空氣相色譜法測定乙酰氨基阿維菌素對照品中的殘留溶劑

季 璇，戴 青，趙富華，陸連壽，溫 芳，王 雷，韓寧寧，張秀英

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

阿維菌素類藥物是一類應用極為廣泛的廣譜高效抗寄生蟲藥，此類藥物能預防和殺滅家畜動物的螨蟲、線蟲等各種寄生蟲。其中阿維菌素B1a和B1b在目前已知的該類藥物中藥效最強，但阿維菌素類藥物具有較大毒性，目前市場上應用的都是阿維菌素的衍生物[1-2]。乙酰氨基阿維菌素(圖1)是阿維菌素B1a和B1b的4”位乙酰基取代而得，屬大環內酯類體內外殺蟲劑[3-5]。默克公司于1997年開發出了應用于奶牛和肉牛的乙酰氨基阿維菌素，使用時無需休藥期，且在牛奶中的殘留量很低，是高效、廣譜和低殘留的新一代獸用驅蟲藥物，保障了優質奶源的供應，在動物醫藥領域應用廣泛[6-8]。

在該藥物制備過程中會用到多種有機溶劑，其藥物殘留量會影響動物源性食品安全，在對照品定值中也必須對溶劑殘留量明確定量，保證對照品定值的準確性[9]。乙酰氨基阿維菌素對照品的合成工藝中用了甲醇和丙酮，精制所用的溶劑為乙醇，因此確定甲醇、丙酮和乙醇為殘留溶劑測定目標。但《中國獸藥典》(2020年版一部)[10]中的殘留溶劑測定方法僅對乙醇、乙腈和丙酮進行測定，并未建立本對照品可能產生的殘留溶劑甲醇的測定方法，且采用的是直接進樣法，而本方法所用的頂空氣相色譜法能夠避免溶液基質對檢測的干擾，對殘留溶劑具有富集作用，是一種更高效準確的質量控制方法[11-13]。截止到目前，國家獸藥基礎數據庫中顯示持有生產文號的原料藥生產企業有7家，注射液生產企業有67家，在原料藥和注射液的質量標準中均需用到乙酰氨基阿維菌素對照品，為滿足行業需求，保障動物源性食品安全，對該對照品進行制備。本文擬建立測定乙酰氨基阿維菌素對照品中3種殘留溶劑的頂空氣相色譜檢測法，并進行方法學研究。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent7890氣相色譜儀(包括7697A型頂空進樣器，安捷倫科技公司)；XP105電子天平(Mettler Toledo公司)。

1.2 試劑 乙醇、甲醇、丙酮對照品(中國計量科學研究院)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Thermo Fisher公司，色譜純)。

1.3 試藥 乙酰氨基阿維菌素對照品原料，浙江海正藥業股份有限公司。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液 取乙醇、甲醇和丙酮對照品各約2.5、1.5、2.5 g，精密稱定，分別置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，作為甲醇、乙醇和丙酮貯備液。乙醇對照品溶液：精密量取1 mL乙醇貯備液，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密稱取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；甲醇對照品溶液：精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密稱取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，精密量取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；丙酮對照品溶液：精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密稱取2.5 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，精密量取2 mL，置25 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.4.2 供試品溶液 取乙酰氨基阿維菌素約0.5 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加DMF 5 mL，搖勻，作為供試品溶液。

1.4.3 空白溶液 取DMF作為空白溶液。

1.4.4 線性與范圍試驗溶液 分別精密量取乙醇、甲醇和丙酮對照品貯備液適量，用DMF稀釋制成濃度分別為974、487、195、98、48、25、11 μg/mL的乙醇對照品溶液、濃度分別為606、303、121、61、30、15、8 μg/mL的甲醇對照品溶液和濃度分別為972、486、194、97、49、24、12 μg/mL的丙酮對照品溶液。

1.4.5 回收率試驗溶液 乙醇回收率試驗溶液：分別精密量取乙酰氨基阿維菌素9份，每份約0.5 g，3份中分別精密加974 μg/mL的溶液5 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加974 μg/mL的溶液1 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加974 μg/mL的溶液0.2 mL和DMF 4.8 mL作為回收率溶液；甲醇和丙酮回收率試驗溶液：分別精密量取乙酰氨基阿維菌素9份，每份約0.5 g，3份中分別精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液5 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液1 mL和DMF 4 mL，3份中分別精密加606 μg/mL和972 μg/mL的混合溶液0.2 mL和DMF 4.8 mL作為回收率溶液。

1.5 色譜條件 色譜柱為Agilent-HP-5毛細管色譜柱(5%苯基-95%甲基聚硅氧烷為固定液)；起始溫度50 ℃，保持10 min，再以每分鐘10 ℃的速率升溫至180 ℃，頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時間為30 min，高純氮氣為載氣，氫火焰離子化檢測器為檢測器，進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度為250 ℃。

1.6 靈敏度測定方法 乙醇：檢測限溶液：精密量取乙醇對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，定量限溶液：精密量取1 mL乙醇貯備液，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1.2 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；甲醇：檢測限溶液：見1.4.1項甲醇對照品溶液配制方法，定量限溶液：精密量取1 mL甲醇貯備液，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；丙酮：檢測限溶液：精密量取丙酮對照品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，定量限溶液：精密量取1 mL丙酮貯備液，置250 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，在1.5項的色譜條件下檢測。

1.7 精密度測定方法 乙醇溶液：精密量取乙醇貯備液1.9 mL，置10 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；甲醇溶液：精密量取甲醇貯備液1 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置20 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得；丙酮溶液：精密量取丙酮貯備液2.4 mL，置100 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，用DMF稀釋至刻度，搖勻，即得，分別精密量取以上溶液各5 mL，置20 mL頂空瓶中，重復測定6次，在1.5項的色譜條件下檢測。

2 結果與分析

2.1 專屬性 分別精密量取5 mL空白溶液和對照品溶液于20 mL頂空瓶中進行檢測，乙醇、甲醇和丙酮與DMF的分離度均大于1.5，表明該條件能夠將3種有機溶劑充分富集，能夠滿足專屬性的要求(圖2)。

圖2 空白溶液(A)、乙醇對照品溶液(B)、甲醇和丙酮的混合對照品溶液(C)氣相色譜圖Fig 2 Gas chromatogram of blank solution (A), ethanol reference substance solution (B) and a mixed reference substance solution of methanol and acetone (C)

2.2 檢測限和定量限 以信噪比為3∶1和10∶1分別作為檢測限和定量限，測得乙醇的定量限為11 μg/mL，檢測限為5 μg/mL，甲醇的定量限為15 μg/mL，檢測限為4 μg/mL，丙酮的定量限為6 μg/mL，檢測限為2 μg/mL。

2.3 線性范圍與線性方程 分別精密量取乙醇、甲醇和丙酮的線性與范圍試驗溶液5 mL，分別置20 mL頂空瓶中，每份溶液制備2份，頂空進樣， 以

濃度和峰面積作線性曲線，用最小二乘法進行線性回歸。結果顯示，乙醇在11～974 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，線性方程為Y=0.34165X-1.5219，r=0.999，甲醇在15～606 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，線性方程為Y=0.3419X+1.7237，r=0.999，丙酮在12～972 μg/mL濃度范圍內線性關系良好，線性方程為Y=1.0804X+4.1559，r=1.000。

2.4 精密度 分別精密量取各精密度試驗溶液，置20 mL頂空瓶中，重復測定6次，記錄色譜圖，結果顯示，乙醇峰面積的RSD為10.0%，分別精密量取甲醇和丙酮濃度為15、24 μg/mL的溶液5 mL，重復測定6次，甲醇峰面積的RSD為6.6%，丙酮峰面積的RSD為2.5%(表1)。

表1 精密度試驗結果Tab 1 Results of Precision test

2.5 準確度 分別精密量取各濃度回收率試驗溶液，置20 mL頂空瓶中，結果顯示，乙醇的回收率為92.1%～109.9%，甲醇的回收率為94.4%～109.5%,丙酮的回收率為92.5%～102.4%，均在90%～110%范圍內(表2)。

表2 回收率試驗結果Tab 2 Results of recovery rate test

2.6 耐用性 在方法研究中，對載氣流速、柱溫、進樣口和檢測溫度進行了一定范圍的變動，結果表明，系統適用性均符合要求，測定結果不受影響。

2.7 樣品的測定 取供試品溶液頂空進樣，結果顯示，供試品甲醇和丙酮的含量均低于定量限，因此可忽略不計，按外標法計算供試品中乙醇的含量為0.05%(表3)。

表3 乙酰氨基阿維菌素殘留溶劑測定結果Tab 3 Results of residual solvents of eprinomectin

3 討論與結論

3.1 進樣方式選擇 氣相色譜法測定樣品中的殘留溶劑目前有直接進樣和頂空進樣兩種方法。美國藥典采用直接進樣法對乙酰氨基阿維菌素中的殘留溶劑乙腈、甲醇、乙酸異丙酯和庚烷進行測定，廣東省獸藥飼料質量檢驗所等2017年采用直接進樣法對乙酰氨基阿維菌素產品中的乙醇、乙腈和丙酮三種殘留溶劑進行測定[14]，能夠滿足一定的檢驗需求，但直接進樣法檢測過程中溶液基質會對殘留溶劑的測定有較大的干擾，而本文所用的頂空氣相色譜分析法可以使其氣化后進樣，氣化的殘留有機溶劑的濃度與溶液中相比有很大增加，對乙酰氨基阿維菌素對照品中的殘留溶劑具有良好的富集作用，能夠檢測出該對照品中的3種殘留溶劑。另外進樣室在較低溫度下操作，可避免藥品組分分解，避免了樣品溶液基質的干擾，并可減少樣品本身可能對色譜系統帶來的嚴重污染。

3.2 溶劑選擇 乙酰氨基阿維菌素在水中幾乎不溶，因此本文參照《中國獸藥典》一部“0861殘留溶劑測定法”的要求，選用N，N-二甲基甲酰胺作為乙酰氨基阿維菌素的溶劑，該溶劑對乙醇、甲醇和丙酮均具有良好的溶解性，且色譜圖基線較平直，因此選用N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑。

3.3 色譜條件選擇 由于乙醇、甲醇和丙酮的沸點均低于80 ℃，N，N-二甲基甲酰胺的沸點遠高于80 ℃，且該溫度下峰面積穩定，因此確定頂空瓶的平衡溫度為80 ℃；對頂空瓶平衡時間進行篩選，結果顯示平衡30 min后頂空瓶內氣液達到平衡。

本試驗所用乙酰氨基阿維菌素對照品的合成工藝中用了甲醇和丙酮，精制所用的溶劑為乙醇，而《中國獸藥典》(2020年版一部)中該品種的殘留溶劑測定方法僅對乙醇、乙腈和丙酮進行測定，并未建立本對照品可能產生的殘留溶劑甲醇的測定方法，本試驗采用頂空氣相色譜法對乙酰氨基阿維菌素對照品中的3種殘留溶劑乙醇、甲醇和丙酮進行了測定，得出了該對照品中乙醇殘留溶劑的含量，該方法的分離度、重復性和回收率等指標均滿足《中國獸藥典》中有機溶劑殘留測定法的要求，簡便準確，回收率高，為獸藥檢測技術的發展提供支撐。經測定，對照品中含有乙醇，限度符合藥典要求，工藝中雖用到了甲醇和丙酮，但在對照品中未檢出。