促滲劑對八桂止痛乳膏體外經皮吸收的影響

張錦麗 ，梅佳華 ，廖承成 ，胡 丹 ，黃 虹 ，李元文

（1）麗江市中醫醫院皮膚科，云南 麗江 674100;2）云南中醫藥大學中藥學院，云南 昆明 650500;3）云南中醫藥大學第一臨床醫學院，云南 昆明 650021;4）北京中醫藥大學東方醫院皮膚性病科，北京 100000）

八桂止痛乳膏（原名：消炎止痛散）是根據國家級名老中醫劉復興主任自創外用驗方消炎止痛散優化制作而來。其主要組成為桂枝、透骨草、三棱、莪術、八角楓、昆明山海棠、大黃，具有消炎止痛、活血化瘀之功效[1-2]。方中以桂枝為君藥。通過臨床隨機對照試驗和小鼠模型的抗炎鎮痛作用實驗[3]，表明抗炎鎮痛是此復方的一大特點，且散劑外用在多年的臨床運用中，療效顯著，極大的減輕患者的疼痛。但該方在臨床應用過程中仍有諸多不足，為提高患者治療疾病依從性，在傳統中醫基礎理論的指導下，應用現代制藥技術不斷優化處方及制備工藝，將此散劑改良為膏劑。前期課題中通過單因素及正交設計等方法已選出最佳基質配方，現為提高中藥膏劑中有效成分透過皮膚，發揮更好的臨床療效，處方中加入適合的透皮吸收促滲劑是必不可少的。在便攜性和操作性上，進行劑型轉化。結合相關文獻研究，篩選出氮酮作為本實驗促滲劑，制備含促滲劑的八桂止痛乳膏，使藥物更持久深層透過皮膚，觀察不同濃度的氮酮對八桂止痛乳膏的透皮吸收影響。但由于該中藥膏劑里中藥物成分復雜，部分有小毒，現階段難以做到對每種成分進行可控性操作，所以選擇該方君藥主要成分桂皮醛作為體外經皮實驗的檢測目標，用以測定有效成分的釋放量。為將來不斷開發臨床新藥與研究中醫藥提供思路及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260 Series 高效液相色譜儀（安捷倫公司）；TK-12B 型透皮擴散儀（上海市鍇凱科技貿易有限公司）；CP124C 電子天平（奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

八桂止痛乳膏；桂皮醛標準品（中國食品藥品檢定研究院 批號為：110710-201821）；甲醇（天津市風船化學試劑科技有限公司）；石油醚（成都市科隆化學品有限公司）；75%乙醇（昆明遠方制品生物有限公司）；生理鹽水（昆明南疆制藥有限公司），甲醇、石油醚均為分析純。

1.3 動物

昆明種小鼠，雄性，18～22 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0004。

1.4 統計學處理

實驗數據用SPSS 26.0 軟件進行單因素方差分析，以表示。

2 結果

2.1 HPLC 測定桂皮醛含量方法的建立

2.1.1 色譜條件色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-水（32∶68）；檢測波長為290 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備取桂皮醛對照品，稱定，加甲醇制成每mL 含桂皮醛0.418 mg 的溶液，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備取1 g 八桂止痛乳膏于體外透皮擴散池，取不同時間乳膏透過皮膚到接收介質中的溶液，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備取桂枝陰性乳膏，按2.1.3 項下方法取接收介質中的溶液，搖勻，過濾，取續濾液，即得。

2.1.5 專屬性考察按2.1.1 項下色譜條件，桂皮醛與其他組分色譜峰均達到基線分離，陰性樣品溶液無任何干擾，見圖1。

圖1 八桂止痛乳膏中桂皮醛HPLC 圖Fig.1 HPLC figure of Cinnamaldehyde in the Bagui Zhitong cream

2.1.6 線性關系考察精密稱取桂皮醛對照品適量分別配制成0.1045、0.209、0.418、0.836、1.672、2.09、4.18 μg/mL 系列對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測定不同濃度桂皮醛對照品溶液的峰面積，檢測結果見表1。對檢測結果進行線性回歸，得到的線性回歸方程為，結果表明桂皮醛在0.104 5～4.18 范圍內線性關系良好，見圖2。

圖2 桂皮醛線性擬合結果Fig.2 Linear fitting results for cinnamaldehyde

表1 HPLC 測定桂皮醛含量標準曲線Tab.1 The standard curve of Cinnamaldehyde content detected by HPLC

2.1.7 精密度實驗分別取0.1045、0.418、4.18 μg/mL 的桂皮醛標準品溶液各3 份，共9 份樣品進行精密度實驗。按“2.1.1”項下色譜條件進行進樣分析，檢測樣品中桂皮醛的峰面積，結果顯示低、中、高濃度標準溶液精密度的RSD 值分別為0.57%、0.27%、0.11%，表明該方法測定桂皮醛含量精密度良好，檢測結果見表2。

表2 桂皮醛含量測定精密度實驗Tab.2 Precision test for determination of cinnamaldehyde content

2.1.8 穩定性考察精密量取八桂止痛乳膏體外經皮滲透液1.0 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾后分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，測量樣品中桂皮醛的峰面積。結果顯示樣品穩定性的RSD 值為2.80%，表明樣品在24 h 內具有較好的穩定性，檢測結果見表3。

表3 樣品穩定性試驗Tab.3 Stability test of samples

2.1.9 重復性考察取八桂止痛乳膏體外經皮滲透樣品6 份進行重復性考察，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，檢測樣品中桂皮醛峰面積，結果顯示樣品重復性的RSD 值為2.47%，表明該方法測定樣品中桂皮醛含量重復性好，見表4。

表4 桂皮醛含量測定重復性試驗Tab.4 Repeatability test of the determination of cinnamaldehyde content

2.1.10 加樣回收率精密量取八桂止痛乳膏體外經皮滲透接收液樣品0.5 mL（含桂皮醛0.43 μg）9 份，分別加入低濃度、中濃度、高濃度的對照品溶液各3 份，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，檢測其加樣回收率。結果顯示低濃度、中濃度、高濃度的標準品分別加入到八桂止痛乳膏體外經皮滲透液中，其桂皮醛的平均加樣回收率分別為102.79%、101.76%、100.70%，RSD 值分別為1.51%、1.87%、0.85%。加樣回收率計算公式為：加樣回收率=（C-A）/B×100%，其中A 為供試品中所含桂皮醛的含量；B 為對照品加入桂皮醛含量；C 為檢測到桂皮醛含量，見表5。

表5 加樣回收率的測定結果Tab.5 The determination results of sample recovery rate

2.2 體外經皮滲透實驗

2.2.1 離體小鼠皮膚的制備昆明種小鼠（18～20 g），雄性，共10 只。適應性飼養24 h。將小鼠固定好，剃去腹部的長毛，然后再用脫毛膏將剩余短毛去除。將其脫頸椎處死后，即刻剪下小鼠去毛部位皮膚，反面平鋪，分離皮下組織及脂肪，0.9% 鹽水反復沖洗至干凈，0.9%鹽水中浸入無破損皮膚，在 -20 ℃冷凍保存，備用。

2.2.2 擴散裝置與接收介質的選擇取備用小鼠的皮膚并解凍，將其固定在TK-12B 型擴散池的一端，使皮膚表層面向供給室，八桂止痛乳膏1 g精密稱取置于供給室中，與皮膚緊密接觸并涂抹均勻。注滿30%乙醇生理鹽水溶液至接收室中，使與真皮層緊密接觸，（37±0.5）℃，100 r/min 恒速磁力攪拌，分別在0.5，1，2，4，6，8，10，12，24 h 取樣3 mL，同時補充相等體積的接收液。用0.22 μm 微孔濾膜過濾樣品后，在高效液相色譜儀中注入10 μL，測定其含量，并按公式計算累積滲透量Q=（V總Cn+ΣCn-1V?。?A，其中，V總為擴散池接收室的體積，Cn為第n 個取樣點測得的接收液中藥物濃度，Cn-1為第n-1 個取樣點測得的接收液中藥物濃度，V取為取樣體積，A 為滲透面積。以不同時間的Q 對t 作圖，并對作圖后直線部分的Q 對t 進行線性回歸，所得斜率視為藥物的經皮吸收速率Jss[μg/（cm2·h）]。增滲倍數ER=Jss含透皮吸收促進劑/Jss空白。

2.2.3 八桂止痛乳膏的制備取桂枝粉碎成粗粉，加水浸泡12 h，采用蒸餾法提取揮發油，將揮發油加入無水硫酸鈉脫水。藥渣與其余5 味藥加水煎煮2 次，合并以上藥液，濃縮至相對密度1.20 g/mL（60 ℃）。取處方量硬脂酸、液狀石蠟、羊毛脂置容器內，水浴加熱至融化；另取羥苯乙酯、蒸餾水、三乙醇胺、甘油置于其他容器中加熱溶解，再加入處方量的浸膏，攪拌均勻；在同等溫度下，將水液以細流均勻、緩慢加入到油液中，同時進行攪拌，直至冷凝，即得八桂止痛乳膏。

2.2.4 不同氮酮濃度對八桂止痛乳膏體外經皮滲透的影響制備含1%氮酮、3%氮酮、5%氮酮、7%氮酮、10%氮酮的八桂止痛乳膏，再按“2.2.2”項下方法進行操作，以Q 對t 作圖，用以考察八桂止痛乳膏在不同氮酮濃度作用下的經皮吸收滲透效果。結果表明，加入5%氮酮乳膏中桂皮醛的Q24和Jss最大，表明八桂止痛乳膏的Jss隨著氮酮濃度的增加先增大后減小。含不同濃度氮酮的八桂止痛乳膏累積釋放量數據見表6，Qt 圖見圖3，不同濃度氮酮對八桂止痛乳膏的促滲效果見表7。

表7 不同氮酮濃度對八桂止痛乳膏的促滲效果（n=3）Tab.7 Promoting effect of different concentrations of azone on transdermal permeation of Bagui zhitong cream（n=3）

圖3 不同氮酮濃度的八桂止痛乳膏Q-t 圖Fig.3 Q -t figure of different concentrations of azone BaGui Zhitong cream

表6 體外經皮滲透實驗累積釋放量（，n=3）Tab.6 The cumulative release amount of the experiment in vitro transdermal permeation（，n=3）

表6 體外經皮滲透實驗累積釋放量（，n=3）Tab.6 The cumulative release amount of the experiment in vitro transdermal permeation（，n=3）

3 討論

本研究結果示，不含有透皮吸收促進劑的八桂止痛乳膏中，桂皮醛累積釋放量方程為Q=0.236 5 t+0.599 6，24 h 的Jss為0.24±0.09，加入不同濃度氮酮后Jss均有升高，提示氮酮可促進桂皮醛透皮吸收，從促滲倍數可以看出，乳膏中加入氮酮后均不同程度促進桂皮醛體外經皮滲透，其中含5%氮酮的八桂止痛乳膏促滲效果最好，增滲倍數為陰性對照的2.125 倍。隨著氮酮濃度的不斷增加，透皮累積釋放量及經皮吸收速率反而降低。氮酮濃度過高的八桂止痛乳膏黏稠性增加，可能對某些成分產生一定的抑制作用，不利于桂皮醛的釋放，進一步降低了皮膚的水合作用，延緩了皮膚的吸收擴散。

中藥軟膏的記載最早可見于《山海經》中提及的“羯羊脂”，戰國時代也有記錄，如膏臊、豕膏等。廣泛應用于皮膚美容、肛腸、骨傷科等各個方面。中醫學認為外用藥物是通過腠理、肌肉等途徑，其性味入臟腑，祛邪益氣扶正，達到治療效果，即“藥達病所，投之可至”[4]。從吸收角度而言，藥物經過皮膚的滲透作用，可以使藥效直達患處，局部血藥濃度在一段較長時段內保持較高的水平，可通過皮下累積后緩慢釋放從局部到達全身作用[5]。皮膚科外用藥廣泛，劑型多樣化，表皮作為主要的藥物吸收途徑，同時皮膚角質層要求藥物具有一定的溶脂性[6]，氮酮可增加角質層細胞間的流動，降低藥物擴散阻力，基于以上理論基礎，氮酮對親油、親水性藥物和活性成分等均有顯著的促滲作用，藥理活性很低，是一類評價較高的促滲劑[7-8]，并適用于成分復雜的中藥制劑，故本研究中選擇親脂性、親水性促滲劑氮酮是可行的。八桂止痛散是國家級名老中醫劉復興教授自創的經驗方，本方劉老常臨床常常用于治療帶狀皰疹、帶狀皰疹后神經痛等各類皮膚痛證，可達到 消炎止痛、活血化瘀的效果。在云南省中醫醫院使用數十年，收到良好臨床療效，本課題組為進一步增加八桂止痛散的臨床療效，對原有劑型進行必要的改良，嘗試將散劑改進為乳膏劑型，便于患者進行使用，增加依從性。

促滲劑的應用主要在于輔助載體增強其透皮作用[9-11]，有研究表明，聯合使用促滲劑可增加中藥透皮吸收效果。中藥劑型的改良是未來中醫藥發展的重要途徑。值得進一步探索。但過于注重促滲效果時，可能會增加藥物本身的毒性、刺激性作用，給局部皮損帶來不必要的過敏反應及其他不良反應。故今后需要進一步研究及觀察。本實驗及前期實驗中觀察到，八桂止痛散經過劑型改良后，在止痛效果，起效時間等方面均顯示出良好的優勢。經皮給藥方法在藥物吸收過程中具有避免肝臟的首過消除效應、延長有效作用時間、避免胃腸道的不良反應等優點[12]。但大部分中藥復方中成分復雜，就以此方來說，莪術、大黃中藥飲片中含有揮發油成分，本身也可促進復方中其他成分的透皮吸收，而本次檢測內容只選取桂皮醛，較為單一，難以真實的反映全方的促滲效果；且實驗用離體皮膚的保存辦法、性質及狀態對藥物的經皮滲透效果影響較大[13]。無論在哪一種促進藥物經皮吸收的方法上，都在很大程度上的改變了表皮的選擇透過性，或打開了新的內外連接渠道，或干擾皮膚角質層的脂質結構，影響了表皮的屏障作用[14]。伴隨藥物理化性質的不同，透過藥物濃度也不一致，同時也不可忽略皮膚角質層的屏障功能與其年齡、性別、環境及部位的影響。

中醫外治理論歷史悠久，但中藥復方成分復雜，療效廣泛，如何增加中草藥中有效成分的透過，把握有效藥量的透過大小、持續時間，如何削弱有毒成分等，這些問題仍待解決。隨著國家對中醫藥的不斷重視，中醫藥現代化是我國中醫藥改革的必經之路。中藥劑型需要不斷完善，經皮給藥方法的越來越收到重視，并獲得越來越多的關注[15-17]。在中醫基礎知識的指導下，合理應用現代醫學技術，探討化學或天然促滲劑及乳膏基質對單味或復方中藥毒性、藥效增減的影響，中藥配伍中是否存在相互促滲的作用，對中藥藥物到達病所進行直接研究，必要時采用病理學手段客觀描繪促滲結果，將中醫藥推向國際化更進一步。