膽綠素治療作用的研究進展

白文婭，楊 淵，霍思穎，楊 鑫，邵建林

（昆明醫科大學第一附屬醫院麻醉科，云南 昆明 650032）

衰老紅細胞的代謝在維持機體正常生理功能方面必不可少，紅細胞被巨噬細胞破壞后，釋放出血紅素（血紅蛋白），血紅素在脾臟的網狀內皮細胞內被血紅素氧合酶（HO）催化成膽綠素（Biliverdin）、一氧化碳（CO）和鐵離子（Fe2+），膽綠素又被膽綠素還原酶（biliverdin reductase，BVR）還原成膽紅素（Bilirudin）。研究發現在正常生理范圍內的膽綠素、膽紅素具有多種生理作用[1]。此外有研究發現，在膽綠素和膽紅素相互轉化的過程，可以形成一個抗氧化的循環系統，并將其稱為膽綠素-膽紅素氧化還原系統，膽綠素、膽紅素發揮生理作用與此系統息息相關。因此通過對膽綠素、膽紅素、膽綠素還原酶結構與代謝以及生理特性的研究，對目前許多疾病的預防和治療具有重要意義。本文系統闡述了膽綠素、膽紅素的結構與代謝、膽綠素-膽紅素氧化還原系統、以及膽綠素的作用及機制，以期為未來膽綠素在臨床當中的應用提供理論依據。

1 膽綠素的結構與代謝

膽綠素是一種無毒、水溶性、帶有2 條丙氨酸側鏈的線性四吡咯分子。研究發現，在爬行動物、兩棲動物、鳥類和魚類當中，膽綠素是血紅素代謝的終產物[2]。做為蛋殼的主要成分之一，膽綠素可通過清除氧自由基、減少突變、抑制病毒復制等作用，保護胚胎免受外界刺激的損傷[3-4]。但在哺乳動物體內，膽綠素在數分鐘內即可被膽綠素還原酶還原成膽紅素[5]。

膽綠素有α、β、γ、δ 4 個亞基，由于血紅素α 位碳原子具有高度選擇性，所以哺乳動物體內95%～97%的膽綠素異構體是膽綠素-Ⅸα，其余3%～5%為膽綠素-IXβ/δ，前者由膽綠素還原酶A 催化，后者由膽綠素還原酶B 催化[6]。在膽綠素轉化成膽紅素的過程中，兩個膽綠素分子與膽綠素還原酶結合，其中一個膽綠素分子接受還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide A denosine phosphare hydrogen，NADPH）提供的氫原子，另一個膽綠素分子通過鄰近的精氨酸殘基向第一個膽綠素分子提供一個質子，接著膽綠素還原酶水解膽綠素分子中的γ-甲基橋，最終生成膽紅素[7]。此外有研究發現，經十二指腸給藥后，在腸道菌群的作用下，膽綠素可轉化為更穩定的膽紅素磺酸鹽[8]，但具體的化學反應過程還需要進一步探索。

2 膽紅素的結構與代謝

膽紅素是一種親脂性的線性四吡咯分子，通常筆者所指的膽紅素是膽紅素-IXα，它是由膽紅素還原酶A 催化膽綠素-IXα 而來。膽紅素在人體的正常范圍為1.71～17.1 μmol/L，如若超過34.2 μmol/L 將會對機體產生毒性作用。20 世紀40 年代，由德國科學家Hans Fisher 首次提出膽紅素的化學結構[9]，研究認為膽紅素分子內的氫鍵是保持其穩定構象及生理功能的關鍵，也正是這些氫鍵使膽紅素具有明顯的親脂性，從而影響其本身的代謝[10]。此外膽紅素分子還能夠通過結合氧自由基，使C10 位上的氫原子由無活性轉化為有活性，從而發揮抗氧化作用[11]。

在哺乳動物體內，80%～85%的膽紅素由血紅素代謝而來，15%～20%來源于骨髓中破壞的紅細胞前體等物質。由細胞色素P450提供氧氣分子和電子，血紅素氧合酶打開血紅素環，接著膽紅素還原酶利用NADPH 提供的質子和電子，將膽綠素還原成間接膽紅素（未結合膽紅素）[12]。未結合膽紅素釋放入血后，迅速被血液中的白蛋白識別結合，使膽紅素不能發揮細胞毒性作用。然后膽紅素隨血液循環進入到肝臟，在尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉移酶（UGTs）的作用下，發生葡萄糖醛酸化反應，形成直接膽紅素，直接膽紅素在細胞表面的多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistancerelated protein，MRP）的作用下以濃度梯度的方式排泄入膽汁[13]，最后通過腸道及腎臟排出或者經過腸肝循環再次利用。

3 膽綠素-膽紅素氧化還原系統

如前所述，在膽綠素與膽紅素相互轉化的過程中，構成了一個可以不斷的消耗氧自由基的循環系統，將其稱為膽綠素-膽紅素氧化還原系統[14]（圖1）。根據膽紅素與膽綠素的結構與代謝特點，很多人就提出疑問，為什么要再次經過復雜的還原步驟，將無毒的膽綠素轉化成有毒的膽紅素？后來的研究發現這一轉化過程可能與以下原因有關：（1）膽紅素能與kelch 樣ECH 關聯蛋1（Keap1）蛋白結合，激活核因子E2 相關因子2（Nrf2），上調血紅素氧合酶的表達[15]；（2）在此系統中可以激活膽綠素還原酶，膽綠素還原酶不僅在機體的生理代謝過程中也同樣發揮著不可替代的作用[16-17]，且可放大膽綠素/膽紅素的生理作用[18]；（3）也有研究認為正是此氧化還原系統的存在，使膽綠素和膽紅素的抗氧化能力明顯強于其他抗氧化劑[19]。

圖1 膽綠素、膽紅素氧化還原系統Fig.1 The biliverdin-bilirubin redox recycling system

4 膽綠素的作用及機制

4.1 膽綠素的抗氧化作用及機制

氧化損傷是指在外界各種不利因素的刺激下，導致機體的氧化和抗氧化作用失衡，引起活性氧的生成過多和/或清除障礙，最終通過多種機制引起組織器官的損傷。由于膽綠素和膽紅素在相互轉化的過程種，可以不斷的消耗氧自由基，所以膽綠素的抗氧化作用一直是近年來研究的熱點之一。研究發現，一分子的膽綠素可消耗4.7 分子的氧自由基，從而在許多疾病中發揮重要作用[20]。Manish 等[21]研究表明，膽綠素可以通過清除氧自由基，抑制NADPH 氧化酶的活性，增加糖尿病患者的血糖耐受。還有研究發現，膽綠素可通過不斷的消耗氧自由基，減輕腦死亡致大鼠肺損傷[22]。此外在神經系統的神經遞質傳遞過程中，膽綠素/膽紅素通過消耗超氧陰離子，減少神經元死亡，起到神經保活作用[23]。Maria J 等[24]研究發現，在由膽汁酸堆積引起的氧化應激反應中，膽綠素可以不依賴于膽紅素還原酶或者血紅素氧合酶系統，減輕肝細胞損傷。在由中波紫外線引起的角膜以及皮膚損傷過程中，膽綠素可通過抑制MAPK 信號通路抑制脂質過氧化，從而減輕氧化損傷[25-26]。

4.2 膽綠素的抗炎作用及機制

炎性反應是導致許多疾病發生發展的主要原因之一。其中NF-κB 信號通路，JAK-STAT 信號通路以及MAPK 信號通路是細胞內3 條主要的炎癥信號通路。活性氧是主要的炎性介質，因此我們有理由相信膽綠素在發揮抗氧化作用的同時，也具有一定的抗炎作用。龔睿等[27]研究證實，膽綠素可以通過影響NF-κB 信號通路，進而抑制NLRP3 炎性體的形成。在膽紅素還原酶的協同作用下，膽綠素可通過eNOS/NO/TLR4 信號軸抑制炎癥反應[28]。在肝缺血再灌注損傷中，膽綠素可通過NF-κB 或者PI3K/Akt 信號通路，降低細胞粘附分子的表達，抑制單核細胞浸潤改善肝功能[29]。膽綠素還可通過MAPK 等信號通路減輕肺缺血再灌注損傷[30]。本課題組利用大鼠MACO/R模型也研究發現，與未經膽綠素處理組（單純腦缺血-再灌注組，C 組）相比，SD 大鼠于再灌注前15 min，再灌注后4 h，第2 天開始每天2 次經腹腔注注射35 mg/kg 的膽綠素后（腦缺血-再灌注損傷+膽綠素處理組，BV 組），SD 大鼠再灌注后1 d，2 d，3 d，4 d，5 d 的神經功能損傷程度減輕；再灌注48 h 后的腦梗死體積減小；再灌注3 h，6 h，12 h 后腦缺血-再灌注側TNF-α、IL-6、IL-1β表達下調；此外膽綠素還可降低缺血側腦組織中小膠質細胞的表達和Iba-1/CD68 蛋白的表達，通過抑制小膠質細胞活化而減輕大鼠腦缺血再灌注損傷[31-32]，且通過全轉錄組基因分析發現，差異表達的基因主要富集與NF-κB 信號通路[33]。由于膽綠素的抗炎作用，膽綠素也與膿毒癥性休克、下頜關節炎等疾病的發生發展密切相關[34-35]。

4.3 膽綠素抑制免疫反應的作用及機制

免疫反應是一種機體清除異己成分或者突變自體成分的防御機制，但過度的免疫反應會毒機體造成許多不可避免的損傷。尤其是在器官移植過程中，需要采取有效的措施抑制過度免疫反應。免疫反應總是與炎癥反應密不可分，膽綠素在發揮抗氧化、抗炎的同時，也具有一定的免疫抑制作用。膽綠素可通過抑制T 細胞增殖，提高受體對同種異體心臟移植物的耐受性，其機制可能是膽綠素可降低活化T 細胞核因子（nuclear factor of activated T cell，NFAT）的表達及抑制NF-κB 信號通路的活化有關[36]。Ferenc Zsila 等[37]利用光譜等技術發現，內源性膽綠素可能為α1-酸糖蛋白（α1-acid glycoprotein，AAG）的配體，AAG 是人類血清的急性期成分，能夠調節免疫反應，而膽綠素則可通過與AAG 結合抑制免疫反應。膽綠素還可用來治療一些免疫炎癥性疾病，如痛風性關節炎[38]，膠原蛋白誘導的關節炎[39]。Melissa P.Homsher 等[40-41]研究發現，當發生免疫反應時，白鵪鶉脾臟中的膽綠素濃度會降低，進一步表明膽綠素可能與免疫反應有關，但具體的機制仍待一進步闡明。

4.4 膽綠素抑制血管平滑肌細胞增殖的作用及機制

血管平滑肌細胞在應對炎性刺激以及氧化應激損傷的過程中，常常會發生異常過度增殖，進而引起內皮功能障礙及動脈硬化性疾病。同時在器官移植等手術過程中，由于需要對血管進行操作，不可避免的會引起血管平滑肌細胞的增殖和損傷，最終導致器官缺血、血管狹窄、心肌梗死等嚴重并發癥[42]。因此抑制血管平滑肌細胞的過度增殖的研究具有重要意義。膽綠素可通過影響MAPK 信號通路，抑制細胞周期蛋白D1、A 和細胞周期數依賴性蛋白激酶（Cyclin-dependent kinase，CDK）的表達，抑制細胞增殖，減輕動靜脈移植或者球囊成形術過程中的血管損傷[43]，影響動脈硬化性疾病的結局[44]。Moraes 等[45]研究發現，血管平滑肌細胞異常增殖的過程中，可引起膽綠素異常增多，這些物質又可以反饋的抑制血管平滑肌細胞的增殖，減輕炎癥因子以及氧自由基對血管平滑肌的損傷。此外還有研究表明，膽綠素可以通過影響表皮生長因子受體的表達，以及PI3K/Akt 信號通路，抑制頭頸癌細胞的增殖[46]。

4.5 膽綠素調控細胞凋亡的作用及機制

細胞凋亡是由一系列分子和信號通路參與調控的細胞自主有序的死亡方式。在氧化應激損傷、炎癥反應的過程中，必然伴有細胞凋亡的發生。膽綠素調控細胞凋亡的機制可能與其清除氧自由基，影響線粒體功能，抑制凋亡相關蛋白的表達有關[47]。呂倩等[48]研究發現，膽綠素可通過抑制氧化損傷，減少順鉑誘導的細胞凋亡。此外，孫潔蕓等研究證實，膽綠素可通過抑制人Ⅱ型肺泡上皮細胞凋亡，從而減輕肺缺血-再灌注損傷[49]。也有研究發現，在腦缺血-再灌注損傷中，膽綠素可通過抑制凋亡相關蛋白的表達，從而減輕腦缺血-再灌注損傷[50]。縱然有很多研究證實，膽綠素可以抑制細胞凋亡的發生，但是細胞凋亡是由多個分子，多條信號通路參與的，因此未來筆者需要更多的研究來證實膽綠素抑制細胞凋亡的分子機制。

4.6 膽綠素的最新應用研究進展

雖然在哺乳動物體內，膽綠素易被還原成膽紅素，使其不能像膽紅素那樣可以做為臨床許多疾病的診斷參考指標。但是隨著科學技術的進步，目前仍然可以利用一些新的技術來測定膽綠素濃度，例如低通量、高效液相色譜或涉及測定吸光度變化率的酶測定方法，或者利用膽綠素與紅外熒光蛋白選擇性結合的特性，利用熒光免疫方法測定膽綠素濃度[51-52]，而且目前已有研究證實可以將膽綠素和一些化合物或者蛋白結合，形成穩定不易降解的化合物[53]，這就為未來膽綠素做為一種臨床診斷和檢測指標，甚至于臨床治療提供了依據。作為一種線性四吡咯分子，膽綠素不僅具有優越的生物相容性，還具有明確的代謝途徑，最近越來越多的研究利用膽綠素制成穩定的膽綠素納米劑，進而在臨床當中進行診斷和治療[54-55]。相信隨著新技術的發展，膽綠素未來在臨床的應用將會取得突破性的進展。

5 小結

綜上所述，膽綠素做為血紅素主要的代謝產物之一，依靠膽綠素-膽紅素氧化還原系統，發揮抗氧化、抗炎、抑制免疫反應、穩定血管內皮細胞、調控細胞凋亡等作用，進而使其在許多疾病發生發展的過程中具有潛在的治療作用（圖2）。而且隨著對其探索的不斷深入，以及目前醫學技術的飛速發展，膽綠素未來在臨床的應用將會取得突破性的進展。

圖2 膽綠素作用及機制圖Fig.2 Role of biliverdin in different pathophysiological processes