EIF5A2 和Ki67 在肝內膽管癌組織中的表達及臨床意義

李 剛 ，楊少華 ，沈 甍 ，謝 楠 ，張貫博 ，王家興 ，李金淞

（1）成都市第七人民醫院肝膽外科，四川 成都 610213;2）昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽胰外科二病區;3）消化內科，云南 昆明 650101）

肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma iCCA）是第二高發的原發性肝臟惡性腫瘤，占原發性肝臟惡性腫瘤的10%～15%[1-3]。近年來全世界范圍內肝內膽管癌的發病率和死亡率呈不斷上升的趨勢[4,5]，可能與非病毒性慢性肝病和代謝性疾病的普遍性增高有關[6,7]。肝內膽管癌病死率高，5 a 生存率僅25%～30%[3]，其預后遠差于肝細胞癌。真核翻譯起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2，EIF5A2）的編碼基因位于人3號染色體2 區6 帶[8]，該區域的染色體不穩定，極易出現擴增，導致其表達上調。EIF5A2 完成翻譯后需依次經DHS 和DOHH 酶催化[9]，轉化為成熟的、有生物學活性的蛋白分子，可在細胞核和細胞質間穿梭，負責特定mRNA 亞群的選擇性轉運和翻譯[10]，其在胰腺導管腺癌、結腸癌、肝細胞癌中表達均增高[11]，與較低的生存率、高TNM 分期、淋巴結轉移和腫瘤分化差等惡性表型顯著相關[12,13]。Ki67 可反映腫瘤細胞的增殖程度，用于預估患者預后[14]。本研究用免疫組織化學染色觀察EIF5A2 和Ki67 在肝內膽管癌中的表達水平，分析它們在肝內膽管癌中高表達與臨床病理特征的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集成都市第七人民醫院肝膽外科、昆明醫科大學第二附屬醫院肝膽外科2014 年9 月至2021 年12 月行肝內膽管癌根治手術患者的石蠟切片118 例，年齡38～74 歲，其中男性60 例，女性58 例，術后病理切片鏡下組織學特點并結合免疫組化（CK7、CK19、Glypican-3）確診為肝內膽管細胞癌，納入研究的患者病例資料完整。

1.2 HE 和免疫組化染色

對含腫瘤組織的蠟塊進行連續切片，取3 張連續的組織切片進行HE 染色、EIF5A2 和Ki67免疫組化染色。HE 染色：含腫瘤組織的載玻片在65 ℃烤片機上烘烤25 min，之后浸泡在二甲苯溶液中脫蠟，然后洗滌二甲苯并進行組織水化，蘇木精溶液染核5 min，自來水沖洗多余的蘇木精溶液，伊紅溶液染細胞質2 min，脫水后封片。免疫組化染色：烤片、脫蠟、水化過程同HE 染色，腫瘤組織切片均進行乙二胺四已酸抗原熱修復，高壓鍋內煮沸5 min 后磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗組織切片5 遍，EIF5A2 免疫組化染色：載玻片上滴加EIF5A2 多克隆抗體（Abcam，貨號：ab227537，稀釋比：1∶150），Ki67 免疫組化染色使用即用型兔抗人單克隆抗體（福州邁新，產品編號：RMA-0542），組織切片中加入Ki67 一抗后放入37 ℃恒溫箱孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 遍，切片上滴加山羊抗兔的二抗，在37 ℃恒溫箱中孵育0.5 h，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗5 遍后DAB 顯色，蘇木素溶液染核后封片。

1.3 免疫組化染色結果判讀

EIF5A2 和Ki67 的表達強弱由2 名病理科主治醫師采用半定量計分法進行分析，（1）評估腫瘤組織著色強度，基本無著色計 0 分（-），染色后呈淡黃色計 1 分（+），呈淺棕色計 2 分（++），呈棕褐色計 3 分（+++）；（2）評估染色面積，高倍鏡視野下以染色陽性區域的面積占整個視野面積的百分比進行計分，面積小于5%計0 分，6%～25%計1 分，26%～50%計2 分，51 %～75%計3 分，＞76%計4 分；將染色強度①與染色面積②相加，所得結果0～3 分為低表達，4～7 分為高表達。

1.4 統計學處理

數據應用SPSS19.0 進行統計分析，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗；EIF5A2 和Ki67表達的相關性分析采用χ2檢驗，P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE 染色及EIF5A2 和Ki67 在肝內膽管癌組織中的表達

118 例肝內膽管癌組織標本中HE 染色顯示，癌細胞核大且深染，異型性明顯，細胞質紅染，腫瘤細胞排列成管狀，腫瘤組織間包含豐富的纖維間質。免疫組化染色顯示EIF5A2 主要位于腫瘤細胞的細胞質和細胞核中，Ki67 在腫瘤細胞的細胞核中表達，見圖1。

圖1 肝內膽管癌HE 染色及EIF5A2、Ki67 免疫組化染色（×100，×200）Fig.1 Intrahepatic cholangiocarcinoma was stained with HE and immunohistochemical staining with EIF5A2 and Ki67（×100，×200）

2.2 EIF5A2 和Ki67 的表達與肝內膽管癌臨床病理特征的關系分析

118 例肝內膽管癌組織中EIF5A2 高表達60例（50.85%），Ki67 高表達81 例（68.64%），EIF5A2高表達與患者年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數量無關（P＞ 0.05），與TNM 分期和淋巴轉移有關（P＜ 0.05）；肝內膽管癌組織中Ki67 高表達與患者年齡、性別、腫瘤數量無關（P＞ 0.05），與TNM 分期、淋巴轉移、腫瘤直徑有關（P ＜0.05），見表1。

表1 EIF5A2 和Ki67 表達水平與肝內膽管癌臨床病理特征的關系[n（%）]Tab.1 Relationship between EIF5A2 and Ki67 expression levels and clinicopathological features of intrahepatic cholangiocarcinoma [n（%）]

2.3 EIF5A2 和Ki67 在肝內膽管癌中表達的相關性

118 例肝內膽管癌免疫組化染色結果中EIF5A2 與Ki-67 兩種蛋白均為高表達者49 例，占 EIF5A2 高表達患者的81.67%（49/60），EIF5A2高表達而Ki-67 低表達的肝內膽管癌組織切片11 例；EIF5A2 低表達但Ki-67 呈高表達的患者有32 例，占EIF5A2 低表達患者的55.17%（32/58），兩者均陰性者26 例；由χ2檢驗得知，EIF5A2的表達與Ki-67 的表達呈正相關，差異具有統計學意義（r=0.285，P=0.002），見表2。

表2 EIF5A2 和Ki67 在肝內膽管癌中表達的相關性Tab.2 Correlation of EIF5A2 and Ki67 expression in intrahepatic cholangiocarcinoma

3 討論

肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma iCCA）主要起源于膽管上皮細胞[15-16]，也可能起源于肝祖細胞[17]，近期的研究表明肝內膽管癌也可能起源于HA-tag 陽性的肝細胞[18]。形態學可分為腫塊型、管周浸潤型和管內型，依據分子學特征分為增殖型和炎癥型[19]。我國學者以肝內膽管癌蛋白質組學的表達差異，將肝內膽管癌分為炎癥型、間質型、代謝型和分化型[20]。肝內膽管癌對放化療敏感性差[21]，缺乏有效的靶向治療和免疫治療，手術切除是唯一可達到根治的治療方式[22]，但手術后仍極易出現轉移和復發，造成了患者5 a 生存率低，絕大多數肝內膽管癌患者死亡是由于腫瘤復發轉移導致的，一項國際多中心的研究結果顯示肝內膽管癌行根治性肝切除后復發率高達71%[23]。因此更好地了解肝內膽管癌復發轉移的分子機制對于改善患者預后是極為重要的。

EIF5A2 是一個新的候選癌基因，可促進腫瘤細胞增殖及侵襲轉移[9,24]，在人類惡性消化道腫瘤中有所涉及，我們前期的研究其在肝內膽管癌組織中表達增高[25]，但它與肝內膽管患者的癌臨床病理特征的相關性尚未見報道。既往研究發現，EIF5A2 的高表達與這些胃癌患者的高TNM 分期、淋巴和遠處轉移和較差的總生存期相關[12]；結腸癌中EIF5A2 的過表達促進了腫瘤的轉移[13]；此外Tang 等[26]報道，與未發生轉移或靜脈浸潤的HCC 組織相比，發生轉移或靜脈浸潤的HCC 組織中EIF5A2 的表達顯著增加。筆者的研究結果發現EIF5A2 的表達與年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤數量無關（P＞ 0.05），與TNM 分期和淋巴轉移有關（P ＜0.05），說明EIF5A2 增強了肝內膽管癌細胞的侵襲轉移能力，與既往研究基本一致。一些腫瘤研究中報道了EIF5A2 增強癌細胞侵襲轉移能力的機制，結腸癌研究中發現高水平的EIF5A2 有助于c-myc 結合到MTA1 的啟動子區，進而上調MTA1 蛋白的表達，從而增強了結腸癌細胞的運動性和侵襲性[27]。基質金屬蛋白酶在腫瘤細胞侵襲轉移中起關鍵性的作用[28,29]，皮膚黑色素瘤的研究發現腫瘤細胞核中EIF5A2 增多與強MMP2 表達直接相關[30]，促進腫瘤侵襲轉移。肝細胞癌中EIF5A2 可能通過激活 p38 MAPK 和JNK/c-Jun 通路增強 MMP-2 活性促進血管形成[31]，促進腫瘤經血道轉移。EIF5A2 在肝內膽管癌中高表達，臨床病理特征分析發現其促進了腫瘤細胞的侵襲轉移能力，筆者將進一步研究EIF5A2 促肝內膽管癌細胞的侵襲轉移的分子機制。

Ki67 是評價細胞增殖的重要指標，也是實體瘤診斷和判斷預后的生物標志物，既往研究發現肝內膽管癌組織中Ki67 的表達遠高于正常肝內膽管組織[32]，本研究中Ki67 在肝內膽管癌陽性表達率為68.64%（81/118），其表達與年齡、性別、腫瘤數量無關（P＞ 0.05），與TNM 分期、淋巴轉移、腫瘤直徑有關（P ＜0.05），與既往研究基本一致[33]，此外Qiang 等[14]在肝內膽管癌的研究還發現高表達的Ki67 與血管浸潤相關。在卵巢癌中發現，EIF5A2 的過表達與腫瘤分化差、高pT/pN和FIGO 分期以及Ki-67 的陽性率升高均有顯著的正相關[34]，同樣，筆者通過Spearman 相關性分析得知，肝內膽管癌中EIF5A2 與Ki-67 的表達呈正相關，差異具有統計學意義（r=0.285，P=0.002），肝內膽管癌中EIF5A2 是否直接調控Ki-67 及具體的調控機制還有待進一步研究。

綜上所述，肝內膽管癌組織中EIF5A2、Ki67 的陽性率較高，兩者的表達呈正相關，其表達與高TNM 分期和淋巴轉移有關，說明EIF5A2和Ki67 促進了肝內膽管癌的發生及侵襲轉移，有助于預判肝內膽管癌患者的臨床分期及預后。