水相法合成磷脂酰絲氨酸體系的優化研究

李令星，吳 寅，李富堅

（翁源廣業清怡食品科技有限公司，廣東韶關 512000）

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）具有提高大腦認知[1]、修復大腦損傷[2-3]等功能，在食品、保健品、醫藥等多個行業被廣泛應用[4-5]。隨著對PS功效應用的研究的不斷深入，其市場需求也日益增長。在PS眾多生產方法中，酶法反應因條件溫和、易控、高效簡單而成為生產主流。酶法反應將絲氨酸溶于水，磷脂酰膽堿（1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphocholine，PC）溶于有機溶劑，兩相反應。隨著人們對食品安全的愈發重視，溶劑殘留也愈發受到關注。本文研究了磷脂酰膽堿在純水相中合成磷脂酰絲氨酸的關鍵變量，為磷脂酰絲氨酸的工業化生產中提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

正己烷，異丙醇均為色譜純；乙酸、三乙胺、三氯甲烷均為分析純；大豆磷脂（哈爾濱九三，PC含量≥55.0%）；絲氨酸（浙江普洛）；磷脂酶D，公司自產發酵制備；PS標準品（Sigma）；PC標準品（Sigma）。

Agilent 1260液相色譜儀配ELSD檢測器（安捷倫）；分析天平BSA224S（賽多利斯）；高速離心機（湖北湘儀）；RE52CS旋轉蒸發儀（上海亞榮）。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱Lichrospher 100 dio（l100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A（正己烷∶異丙醇∶乙酸∶三乙胺=820∶170∶10∶0.8）；流動相B（異丙醇∶水∶乙酸∶三乙胺=850∶140∶10∶0.8），A、B兩相梯度洗脫：0～8.5 min，5%→36% B；8.5～12 min，36%→38% B；12～15 min，38%→100% B；15～15.5 min，100%→5% B；15.5～20 min，95% B；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器漂移管溫 度：85 ℃；氣體流速：2.5 L/min；柱溫：35 ℃[6]。

1.2.2 分析方法

分別精確稱取PS、PC標準品10 mg，用三氯甲烷定容至25 mL，混合均勻，制成標準品儲備液。用移液管準確吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL和9 mL 儲備液，用三氯甲烷定容至10 mL，制成標準溶液，繪制標準曲線。稱取10 mg樣品，用三氯甲烷定容至25 mL，搖勻，制成樣品溶液，并用標準曲線分析樣品的PS和PC含量。在選定色譜條件下，以PS、PC峰面積（W）為縱坐標，PS、PC濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為W（PS）= 74.55C+24.68，R=0.999 62；W（PC）=52.61C+ 72.36，R=0.999 29，表明PS和PC在選定濃度下具有良好的線性關系。

1.2.3 單因素實驗

稱取100 g PC和100 g絲氨酸，加入500 mL水和25 mL酶液，37 ℃反應4 h，反應結束后離心分離絲氨酸，沉淀負壓干燥后獲得PS產品，測定產品PS和PC含量。通過單因素實驗確定純水相法反應PS的最適條件。

（1）物料比對PC合成PS的影響。按表1稱取物料，加入25 mL酶液，37 ℃反應4 h，反應結束，離心、分離絲氨酸，沉淀負壓干燥后獲得PS產品，測定產品中PS和PC含量，確定最適物料比。

表1 PC合成PS的物料比

（2）酶液添加量對PC合成PS的影響。稱取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水，按PC添加量的5%、10%、15%、20%和25%，分別加入5 mL、10 mL、15 mL、20 mL和25 mL酶液，37 ℃反應 4 h，反應結束離心、分離絲氨酸，沉淀負壓干燥后獲得PS產品，測定產品中PS和PC含量，確定最適酶液添加量。

（3）反應時間對PC合成PS的影響。稱取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，37 ℃分別反應2 h、4 h、6 h、8 h和10 h，反應結束，離心分離絲氨酸，沉淀負壓干燥后獲得PS產品，測定產品中PS和PC含量，確定最適反應時間。

（4）反應溫度對PC合成PS的影響。稱取100 g PC和80 g絲氨酸，加入300 mL水和20 mL酶液，分別在28 ℃、37 ℃、42 ℃、45 ℃和50 ℃反應6 h，反應結束，離心分離絲氨酸，沉淀負壓干燥后獲得PS產品，測定產品中PS和PC含量，確定最適反應溫度。

2 結果與分析

2.1 產品圖譜

經HPLC檢測及圖譜分析（圖1），產品中PS含量為54.52%（保留時間9.891 min），反應前原料中PC含量為58.35%，反應結束后，PC含量為4.33%（保留時間8.384 min），PC轉化率為93.40%。

圖1 產品圖譜

2.2 物料比對PC合成PS的影響

由 表2可 知，當 水∶PC=1∶1（mL∶g）時，水量不足，物料混合不充分，PS生成率不高；水∶PC=3∶1（mL∶g）時，水量剛好合適，物料混合充分，反應效能達到最高；水∶PC=5∶1（mL∶g）時，水量過多，PC有更多活動空間，PC逐漸凝聚成團，減少了與絲氨酸接觸的機會，導致PS合成反而降低，因而水∶PC=3∶1（mL∶g）為宜。當絲氨酸∶PC=0.5∶1（g∶g）時，絲氨酸添加量較少，無法與PC充分接觸，反應不充分；絲氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）時，絲氨酸添加量正好合適，與PC充分接觸，反應效能達到最高；絲氨酸∶PC=1∶1（g∶g）時，絲氨酸已過量，但PS合成也不會繼續加大，且前期絲氨酸用量加大，后期則需要更多純水洗去多余的絲氨酸，因而絲氨酸∶PC=0.8∶1（g∶g）最適宜。綜合考慮。水、PC和絲氨酸的比例為3∶1∶0.8（mL∶g∶g）時最合適。

表2 物料比對PC合成PS的影響

2.3 酶液添加量對PC合成PS的影響

由表3可知，隨著酶用量逐漸增大，PS合成率逐漸增加，當酶液添加量為PC的20%時，PS合成效能最大，當酶添加量超過PC的20%后，PS合成反而降低。在酶添加量較少時，活性因子不能充分接觸底物，因而PS合成率不高，當酶添加量超出最適添加量后，磷脂酶將本已合成的PS分解成為磷脂酸（PA），導致PS合成率降低。綜合考慮，最適酶液添加量為PC的20%。

表3 酶添加量對PC合成PS的影響

2.4 反應時間對PC合成PS的影響

由表4可知，隨著反應時間的增加，PS合成率逐漸加大，當反應時間為6 h時，PS合成效能最大，繼續反應，磷脂酶開始反作用于PS，使PS分解，導致PS合成率降低。綜合考慮，反應時間為6 h最 適宜。

表4 反應時間對PC合成PS的影響

2.5 反應溫度對PC合成PS的影響

由表5可知，隨著反應溫度的升高，PS合成率逐漸增大。當反應溫度達到45 ℃時，PS合成效能最大，繼續提高反應溫度，磷脂酶逐漸失活，失去作用。當反應溫度達到50 ℃時，磷脂酶完全失去活性，無法催化PC合成PS，因而選定反應溫度為45 ℃。

表5 反應溫度對PC合成PS的影響

3 結論

本文通過單因素實驗優化了水相法合成磷脂酰絲氨酸在工業生產中的關鍵變量，結果表明，最適用水量∶大豆磷脂∶L-絲氨酸的比例為3∶1∶0.8（mL∶g∶g）、酶液添加量為PC的20%、反應溫度45 ℃、反應時間6 h。在最適反應條件下獲得PS含量為54.52%，符合新資源食品質量要求，PC轉化率為93.40%。為無溶劑合成PS在工業化生產中提供重要依據。