抗人球蛋白試驗(yàn)在RhD、ABO血型抗原鑒定的應(yīng)用效果

劉敏靜,杜思遠(yuǎn),高艷珠,李健茹,趙子賢（廣東省江門市新會(huì)區(qū)人民醫(yī)院,廣東 江門 529100）

新生兒溶血病（Hemolytic disease of the newborn，HDN）是由母嬰血型不合、紅細(xì)胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（Erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD）缺乏、球形紅細(xì)胞增多癥等原因所引起的新生兒疾病，其中多數(shù)原因?yàn)槟笅胙筒缓蟍1]。后者是母體與新生兒紅細(xì)胞抗原不配合，激活母體免疫系統(tǒng)被動(dòng)產(chǎn)生免疫性的免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）G抗體進(jìn)入胎兒體內(nèi)，可使得新生兒的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)受到破壞，從而形成被動(dòng)免疫性溶血性疾病[2-3]。ABO血型不合是引起新生兒溶血病最常見的原因，大約3.5%的新生兒溶血病是因ABO血型不合所導(dǎo)致的[4]。Rh新生兒溶血病是由于母嬰Rh血型不合所致的IgM免疫抗體作用于胎兒紅細(xì)胞造成的高膽紅素血癥，可由人類紅細(xì)胞刺激引起同族免疫作用而產(chǎn)生[5]。抗人球蛋白試驗(yàn)（Antiglobulin test，AGT）是檢查不完全抗體的一種經(jīng)典方法，是利用抗人球蛋白血清與體內(nèi)致敏紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集的原理，檢查紅細(xì)胞是否致敏的試驗(yàn)[6]。但傳統(tǒng)的抗人球蛋白試驗(yàn)是一種以抗球蛋白法為基礎(chǔ)的凝聚胺法，在低離子介質(zhì)中可促進(jìn)紅細(xì)胞和血清之間的抗原抗體反應(yīng)。改良的抗人球蛋白法是在經(jīng)典法的基礎(chǔ)上，利用二硫蘇糖醇作為裂解液，將凝聚胺試劑作為加速劑，能提高檢測(cè)效果[7]。本文具體探討并對(duì)比了抗人球蛋白試驗(yàn)在RhD、ABO血型抗原鑒定中的應(yīng)用效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料 選擇2018年9月-2021年11月在本院建檔分娩的夫婦ABO血型不合或RhD血型不合的孕婦78例作為研究對(duì)象。

納入標(biāo)準(zhǔn)：單胎活妊娠；孕周≥28周；孕婦知情同意本研究；年齡20-45歲；醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究（批準(zhǔn)號(hào)為87725552）。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料缺乏者；合并腫瘤者；合并先天性免疫性疾病者。

抗A標(biāo)準(zhǔn)血清、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清購自上海生工公司，ABO標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞試劑盒購自大連TAKARA公司。抗D抗體購自Bio-rad公司，抗球蛋白試劑購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，低離子抗人球蛋白卡、凝聚胺介質(zhì)試劑購自珠海貝索生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

在78例孕婦中，年齡最小22歲，最大43歲，平均年齡（29.48±1.58）歲；平均體重指數(shù)（2 6.2 9±1.2 2）k g/m2；平均孕周（3 4.0 2±2.2 8）周；平均產(chǎn)次（1.87±0.24）次；平均孕次（2.58±0.28）次。

1.2 配偶血型鑒定 采用玻片正定型法、試管反定型法進(jìn)行配偶血型鑒定，在玻片正定型法中，將抗A定型試劑、抗B定型試劑各一滴分別滴于玻片上A、B處，分別取等體積10.0%紅細(xì)胞懸液或全血于抗A定型試劑和抗B定型試劑處，混勻后觀察凝集狀況進(jìn)行結(jié)果判定。在試管反定型法中，取孕婦血清1滴分別加入3支標(biāo)記好的小試管中，加入RhD試劑紅細(xì)胞，1000rpm/min離心1min，混勻后觀察凝集狀況進(jìn)行結(jié)果判定。

1.3 抗人球蛋白試驗(yàn)方法 所有孕婦都給予經(jīng)典抗人球蛋白法（經(jīng)典法）、改良抗人球蛋白法（改良法）測(cè)定孕婦血清中IgG抗A(B)效價(jià)、抗D抗體，檢查前取試驗(yàn)患者紅細(xì)胞懸液50μl；取微柱凝膠抗人球蛋白檢測(cè)卡，加入紅細(xì)胞懸液，置入卡式離心機(jī)離心5min，觀察凝集反應(yīng)，對(duì)顯示陽性的標(biāo)本進(jìn)一步實(shí)施分型操作。比如在改良法中，用蒸餾水按1∶20的比例稀釋濃縮洗滌液，加入孕婦血清和裂解液各0.2ml，混勻后在37℃環(huán)境中孵育30min。選擇小試管16支，各加洗滌液0.1ml，倍比稀釋血清與紅細(xì)胞懸液形成洗滌液。向小試管中加入洗滌液，混合后離心1min，留取紅細(xì)胞，然后加入抗IgG抗體0.05ml，觀察紅細(xì)胞凝集情況。

兩種方法的結(jié)果判斷方法如下：以肉眼可見紅細(xì)胞凝集(+)的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)即為抗A(B)抗體、抗D抗體的抗體效價(jià)。

根據(jù)效價(jià)結(jié)果陽性和陰性結(jié)果的判定原則，所有效價(jià)≥1∶64的標(biāo)本可判定為陽性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 本次研究統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS22.00，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。計(jì)量數(shù)據(jù)與計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差、n%等表示，對(duì)比為t檢驗(yàn)與卡方χ2檢驗(yàn)等。

2 結(jié)果

2.1 新生兒溶血病鑒定情況對(duì)比 在78例孕婦中，改良法判斷為ABO新生兒溶血病44例，RhD新生兒溶血病6例；經(jīng)典法判斷為ABO新生兒溶血病41例，RhD新生兒溶血病5例，對(duì)比無差異（P＞0.05）。見表1。

表1 兩種方法對(duì)新生兒溶血病鑒定情況對(duì)比[n(%)]

2.2 IgG抗A(B)效價(jià)對(duì)比 經(jīng)典法的IgG抗A(B)效價(jià)陽性率為9.0%（7/78），改良法的IgG抗A(B)效價(jià)陽性率為25.6%（20/78），改良法的IgG抗A(B)效價(jià)陽性率高于經(jīng)典法（χ2=7.569，P＜0.05）。見表2與表3。

表2 經(jīng)典法測(cè)定IgG抗A(B)的效價(jià)(n=78)

表3 改良法測(cè)定IgG抗A(B)的效價(jià)(n=78)

2.3 Ig抗D效價(jià)對(duì)比 經(jīng)典法的Ig抗D效價(jià)陽性率為2.6%（2/78），改良法的Ig抗D效價(jià)陽性率為11.5%（9/78），改良法的Ig抗D效價(jià)陽性率高于經(jīng)典法（χ2=4.792，P＜0.05）。見表4與表5。

表4 經(jīng)典法測(cè)定Ig抗D的效價(jià)(n=78)

表5 改良法測(cè)定Ig抗D的效價(jià)(n=78)

3 討論

新生兒溶血病在臨床上比較常見，可導(dǎo)致胎兒紅細(xì)胞被破壞，新生兒出現(xiàn)水腫、黃疸、貧血，甚至出現(xiàn)死胎。新生兒溶血病的主要病因是母嬰血型不合，包括ABO血型不合與RhD血型不合[8]。ABO血型鑒定與RhD血型鑒定是臨床重要檢驗(yàn)項(xiàng)目，是判斷母嬰血型相容性的重要依據(jù)。由于各種因素的影響，當(dāng)前對(duì)于血型鑒定多采用血清檢驗(yàn)方法，雖然有一定的效果，但是低效價(jià)血清抗體檢測(cè)操作比較復(fù)雜，也容易出現(xiàn)各種假陽性。抗人球蛋白試驗(yàn)是將抗人球蛋白血清加入已經(jīng)致敏的紅細(xì)胞鹽水懸液中，紅細(xì)胞表面的抗球蛋白與抗人球蛋白血清中的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，使紅細(xì)胞發(fā)生凝集[9]。本研究顯示在78例孕婦中，改良法判斷為ABO新生兒溶血病44例，RhD新生兒溶血病6例；經(jīng)典法判斷為ABO新生兒溶血病41例，RhD新生兒溶血病5例，對(duì)比無差異（P＞0.05），表明經(jīng)典法與改良法對(duì)于新生兒溶血病的診斷具有良好的一致性，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

ABO血型不合導(dǎo)致的新生兒溶血病是由于母嬰ABO血型不合，可使得胎兒的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)受到免疫性破壞，從而誘發(fā)溶血[10-11]。IgG抗A(B)抗體效價(jià)與溶血程度有一定的相關(guān)性，但是也與新生兒A(B)抗原強(qiáng)弱、胎盤屏障作用、血型物質(zhì)含量等有關(guān)。Rh血型抗體只能由人類紅細(xì)胞作為抗原刺激引起同族免疫作用而產(chǎn)生，血清中含有Rh抗體的孕婦，如果受孕一個(gè)Rh陽性胎兒，Rh抗體可通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，破壞胎兒紅細(xì)胞引起新生兒溶血病[12]。而出現(xiàn)胎盤出血與產(chǎn)道損傷，紅細(xì)胞便可進(jìn)入母體內(nèi)，刺激母體產(chǎn)生Rh抗體，當(dāng)母體再次妊娠可再次誘發(fā)新生兒溶血病的發(fā)生[13-14]。本研究顯示，經(jīng)典法的IgG抗A(B)效價(jià)陽性率為9.0%（7/78），改良法的IgG抗A(B)效價(jià)陽性率為25.6%（20/78），改良法的IgG抗A(B)效價(jià)陽性率高于經(jīng)典法（χ2=7.569，P＜0.05）。經(jīng)典法的Ig抗D效價(jià)陽性率為2.6%（2/78），改良法的Ig抗D效價(jià)陽性率為11.5%（9/78），改良法的Ig抗D效價(jià)陽性率高于經(jīng)典法（χ2=4.792，P＜0.05），表明改良法的應(yīng)用能提高對(duì)于新生兒溶血病與各血型效價(jià)的檢測(cè)陽性率。從機(jī)制上分析，經(jīng)典法是利用抗人球蛋白血清可與體內(nèi)已經(jīng)被不完全抗體或補(bǔ)體致敏的紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理，可有效確定母嬰血型不合導(dǎo)致的新生兒溶血病。抗人球蛋白試驗(yàn)為一項(xiàng)經(jīng)典的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)，但是經(jīng)典法忽略了自身抗體的存在，可能存在檢測(cè)誤差[15-17]。但大量陽性患者由于存在自身抗體，導(dǎo)致配血發(fā)生困難，可出現(xiàn)與所有供者樣本凝集的現(xiàn)象，且難以鑒定出同種抗體[18]。而凝聚胺是多價(jià)陽離子聚合物，可促進(jìn)紅細(xì)胞和血清之間的抗原抗體反應(yīng)，加速抗體致敏紅細(xì)胞，可破壞紅細(xì)胞間相互排斥的電位，可以提高試驗(yàn)的陽性率[19-21]。但是陰性結(jié)果仍需做抗球蛋白試驗(yàn)以防漏診，還需以鹽水試驗(yàn)作對(duì)照。在改良法中，將凝聚胺試劑作為加速劑可使紅細(xì)胞致敏能力增強(qiáng)，縮短裂解時(shí)間，增強(qiáng)裂解效果[22]。本研究由于經(jīng)費(fèi)限制，納入孕婦數(shù)量比較少，對(duì)比方法也比較少，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

總之，不同抗人球蛋白試驗(yàn)在RhD、ABO血型抗原鑒定的應(yīng)用都有很好的效果，改良法的應(yīng)用能提高對(duì)于新生兒溶血病與各血型效價(jià)的檢測(cè)陽性率。