便攜式生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用研究進展

王沂雯，劉晏霖，付瑞杰，劉浩然，周 靜，趙其陽，王成秋，焦必寧,*，何 悅,*

（1.西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2.農業農村部柑桔及苗木質量監督檢驗測試中心，重慶 400712）

真菌毒素是真菌產生的有毒次級代謝產物，能干擾細胞抗氧化系統的功能，降低細胞對毒素的抵抗能力，對人類和動物的健康危害極大。目前，研究者們現已分離出400多種真菌毒素，并對它們的結構和性能進行了相關研究。由于其特殊的物理、化學性質，導致毒性難以被外界條件所破壞。在眾多的真菌毒素中，對生命體具有較大毒性的主要有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、展青霉毒素（patulin，PAT）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等。值得注意的是，大多數真菌可以同時產生多種真菌毒素。因此，被真菌感染的農作物、飼料及食品往往同時受到多種真菌毒素的污染。

近年來，由真菌毒素造成的食品安全事件頻頻發生，眾多科學家們為實現對真菌毒素的有效監測進行了孜孜不倦地探索。目前已經開發了多種用于真菌毒素定量檢測的方法，如薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色譜法（highperformance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜串聯質譜法（liquid chromatogram tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等。以上方法可以實現真菌毒素準確、靈敏和多組分同時檢測，在實驗室中得到了廣泛的應用。但這些用于真菌毒素定量檢測的方法通常需要大型且精密的儀器、熟練的操作人員以及復雜的樣品前處理，限制了它們在真菌毒素現場檢測中的應用。因此，開發操作簡單、設備輕便、檢測速度快、靈敏度高、特異性強、重現性好、準確度高的生物傳感器以用于真菌毒素的即時檢測具有重要的科學意義。

便攜式生物傳感器由于其操作方便、體積小巧、檢測速度快、精確度高且檢測專一性強等優點，可滿足目標分析物現場即時檢測的需求，受到了研究者們的高度重視。其可以在專業實驗室外對目標物進行檢測，縮短了數據輸出的時間，方便且快捷。近些年來，研究人員將一些成本低、簡單易得的材料及商品化小型儀器用于便攜式生物傳感器的構建，致力于實現真菌毒素的即時檢測。本文綜述試紙條、個人血糖儀（personal glucose meters，PGM）、手持式pH計、氣壓計、智能手機、微流控芯片以及基于可視化、電化學、等離子體等輸出信號的便攜式生物傳感器在真菌毒素現場檢測應用中的研究進展，同時對真菌毒素的現場檢測這一領域的發展前景進行闡述。

1 便攜式生物傳感器中真菌毒素的識別元件

由于真菌毒素對食品的污染具有較高的風險性，并且還對人、畜、環境具有嚴重的危害性，因此，開發性能優異的檢測技術對農產品及食品中的真菌毒素進行實時監測成為迫切需要，以保障食品安全和人類健康。便攜式生物傳感器是對目標分析物進行微量檢測的小型器件，其工作原理為當識別元件和目標分析物結合之后，信號探針會產生與目標分析物濃度相關的信號，最后利用儀器儀表可讀出檢測信號。它具有便于攜帶、用戶友好的優點，能夠作為目標分析物即時檢測的有利工具。但其檢測靈敏度、響應速度和特異性易受識別元件的影響，因而在便攜式生物傳感器中其識別元件起著至關重要的作用。目前用于真菌毒素檢測的最常見的識別元件為抗體、核酸適配體和分子印記聚合物（molecular imprinted polymers，MIPs）。以下將對真菌毒素的抗體、核酸適配體和MIPs的制備和性能進行簡要介紹。

1.1 抗體

1.1.1 單克隆抗體

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）是一種由效應B淋巴細胞轉化而來的漿細胞分泌的，與抗原特異性結合的大型Y形蛋白質。mAb是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，因其高度特異性而被廣泛應用于疾病診斷及治療。隨著研究人員的深入研究，抗體已被廣泛地應用于構建酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法和免疫層析法中，實現了目標分析物的高靈敏、高特異性檢測。為了能夠將其更廣泛地應用于科學研究中，研究者們還通過不同的化學試劑將酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、-半乳糖苷酶）、熒光染料（異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白等）、生物素等修飾到抗體上。楚金申利用生物素--羥基琥珀酰亞胺酯修飾的二抗建立了ELISA法檢測玉米中的ZEN，檢出限為0.42 ng/mL，該方法的檢測時間為50 min。盧江等利用辣根過氧化物酶修飾的二抗建立了一種間接競爭化學發光酶免疫法實現了對玉米樣品中ZEN的檢測，檢出限為0.09 ng/mL。通過制備修飾型抗體可進一步建立更多的檢測方法用于食品中真菌毒素檢測。

目前，也有越來越多的研究人員致力于真菌毒素的抗體篩選，部分已篩選出的真菌毒素單克隆抗體如表1所示。多數真菌毒素mAb已逐步實現商品化，如AF、OT、PAT、ZEN。對于單克隆抗體的制備多采用雜交瘤技術，主要包括免疫動物、細胞融合和選擇性培養等過程。由于真菌毒素分子質量較小，屬于僅有反應原性而無免疫原性的半抗原，因此，為了得到真菌毒素的特異性抗體，必須選擇蛋白質大分子作為載體對毒素的結構進行修飾。常用的載體有牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）、雞卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）等。人工抗原制備好后再對鼠、兔等進行免疫以獲得高質量的抗體，經鑒定獲知抗體的類型及效價。例如，肖智等研制了AFBmAb。具體方法為：先將AFB轉化為其半縮醛形式AFB，接著AFB和BSA氨基發生醛胺縮合反應，隨后在硼氫化鈉還原作用下得到免疫原AFB-BSA復合物。AFB-BSA免疫BALB/C小鼠后，3只小鼠第4次免疫后抗血清效價均高于1∶250 000。李華采用保護-去保護策略使DON的3位C上的羥基與琥珀酸酐反應，使DON衍生后獲得一個羧基，得到衍生物3-半琥珀酰-DON（3-hemisuccinyl-DON，3-HS-DON）。再采用碳化二亞胺法將3-HS-DON與載體蛋白BSA進行偶聯，利用快速蛋白液相層析系統對偶聯產物進行分析，以確保制備得到3-HS-DON-BSA。用所制備的3-HS-DON-BSA作為免疫原，分別采用腹膜腔注射法和頸、背部多點注射法免疫BALB/C小鼠和豚鼠。經過間接ELISA法檢測，豚鼠血清的效價為1∶6 400，小鼠血清的效價為1∶12 800。值得注意的是，雖然抗體的制備來源廣泛，不僅可以借助老鼠還可以借助兔等其他動物來進行制備，但是抗體制備過程繁瑣、生產成本高、穩定性差、批次間差異大，因此近年來，廣大研究人員們致力于新型小分子抗體的研究。

表1 真菌毒素抗體Table 1 Antibodies against mycotoxins

1.1.2 納米抗體

研究者們發現駱駝科動物（駱駝、羊駝）體內存在一種抗體亞類，由重鏈的一個可變區域組成，完全沒有輕鏈，將其稱為重鏈抗體（heavy chain antibody，HCAB）。對重鏈抗體可變區（variable heavy chain domain，VHHs）進行重組表達，便可得到僅包含VHHs的單個結構域抗體（single domain antibody，sdAb），又稱VHH抗體，由于其大小只有普通抗體的1/10左右，故又被稱為納米抗體（nanobody，Nb）。Nb制備過程主要包括羊駝免疫、噬菌體文庫構建和抗體篩選3個階段。由于Nb具有分子質量小、組織穿透性強、抗原親和力高、能識別隱藏表位、免疫原性低、結構穩定、水溶性好、生產成本低等優點，越來越多有毒有害物質的Nb被分離出來，并用于食品分析中免疫分析的檢測。He Ting等用AFB-BSA免疫羊駝后，構建了Nb的噬菌體顯示庫。選擇兩個AFB的特異性Nb進行實驗，開發了一種Nb 26的競爭性ELISA法，其半抑制劑量（half inhibition concentration，IC）為0.754 ng /mL，線性范圍為0.117～5.676 ng/mL。結果顯示，所分離的Nb是測定AFB的理想選擇。Liu Xing等在大腸桿菌細胞中表達OTA的Nb（Nb15、Nb28、Nb32、Nb36），并與OTA特異性mAb 6H8的熱穩定性進行比較。在95 ℃處理5 min或90 ℃處理75 min后，所有Nb仍然可以保持其抗原結合活性。然后選擇在ELISA中敏感度最高的Nb28進一步研究，實驗得出IC為0.64 ng/mL，線性范圍為0.27～1.47 ng/mL。

1.2 核酸適配體

核酸適配體簡稱適配體，又被稱為“化學抗體”，是通過指數富集配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術在體外核酸分子文庫中篩選獲得的堿基長度通常在20～60之間的單鏈DNA或RNA序列。適配體作為一種新型分子識別元件，利用自身折疊成特定的空間結構與靶物質高特異性結合。其靶物質可以是小分子、蛋白質、金屬離子，甚至是特定的細胞。與蛋白質抗體相比，適配體具有分子質量小、靶分子廣泛、穩定性好、易功能性修飾、易合成、成本低等優點。正是由于上述獨特的優勢，適配體作為一種理想的分子識別元件，已被廣泛應用于多個領域。研究者們可根據檢測需要對目標物的適配體進行相應的修飾，例如，陶醉將辣根過氧化物酶修飾到伏馬毒素B的適配體上，構建了基于適配體-辣根過氧化物酶的檢測方法，通過肉眼觀察和測定450 nm處的吸光度實現了對目標物定性和定量檢測，在優化條件下檢出限為0.30 ng/mL；喻婕將適配體修飾到金納米顆粒（Au nanoparticles，AuNPs）表面，以實現信號放大，通過AuNPs的特征吸收峰與待測AFB濃度的相關性來檢測目標物質量濃度，AFB檢出限為4.1 pg/mL。對于適配體的修飾工作研究者們還在進一步根據實際檢測需要不斷完善。

為了豐富真菌毒素高效、高特異性的檢測手段，廣大研究人員也逐漸投入到真菌毒素適配體的篩選中。目前適配體的篩選仍然以SELEX技術為基礎，但是傳統的SELEX技術耗時長、過程繁瑣，已不能滿足實際需要，因此研究者們對該技術進行了改進，如目前已報道的氧化石墨烯-SELEX、人類基因組-SELEX、石英晶體微天平-SELEX和計算機輔助-SELEX等。與傳統的SELEX技術相比，氧化石墨烯-SELEX技術不需要對靶標進行固定，簡化固定程序，并保持了靶標的天然構象，篩選出的適配體親和力強；人類基因組-SELEX技術使用天然RNA/DNA作為核酸庫，減少了序列隨機性，與目標物實際核酸序列更貼近；石英晶體微天平-SELEX可實時觀測篩選過程，不需要分離結合和游離的核酸分子；計算機輔助-SELEX可在提升篩選效率的同時節省實驗成本。但這些改進的SELEX技術仍存在一些不足，如：石英晶體微天平-SELEX技術在經過多次輪篩之后會使篩選效率下降；計算機輔助-SELEX技術沒有統一軟件實現小分子適配體篩選。因此，在適配體高效篩選上仍有很大的發展空間。對于真菌毒素的篩選研究者們還在不斷的摸索。Ma Xiaoyuan等利用SELEX技術篩選出了AFB的適配體。經過10 輪篩選和擴增，富集后得到30個適配體序列。結合同源性和結構分析以及親和力和特異性實驗，最終獲得了對AFB具有最佳親和力和特異性的適配體序列。該適配體序列和AFB的解離常數（）為11.39 nmol/L。Malhotra等采用兩個SELEX過程（稱為SELEX1和SELEX2）來篩選AFM的適配體。在SELEX1中，使用外切核酸酶生產ssDNA，而在SELEX2中，使用快速冷卻將dsDNA轉化為ssDNA，共獲得41個不同的適配體序列（36個AFM適配體序列，5個AFB適配體序列）。值的測定結果表明，AFM適配體的值在35～1 515 nmol/L范圍內，AFB適配體的值在96～221 nmol/L范圍內。此外，同一種毒素經不同課題組篩選，獲得了序列不相同的多條適配體，部分適配體序列詳見表2。

表2 真菌毒素適配體Table 2 Aptamer for mycotoxins

1.3 分子印記聚合物

MIPs表示能夠與目標分析物相互作用從而選擇性地結合識別元件，它可以識別蛋白質、紅細胞、病毒及毒素等物質。與天然抗體相比，MIPs具有更好的結合性和選擇性，此外，MIPs耐高溫、高壓和酸堿，可回收，易于儲存，已被廣泛應用于環境污染物分析、食品質量與安全、生物樣品分離與富集等多個領域。在MIPs合成過程中，所合成聚合物的官能團對特定的模板分子具有選擇性，完成聚合之后，移除模板分子從而在聚合物基體中產生識別位點。MIPs有許多合成方法，其方法的選擇取決于MIPs的大小、應用領域等，其中最為常用的是非共價鍵相互作用。MIPs合成技術的完善與進步也推動了基于MIPs生物傳感器的發展。Wang Qingling等建立了一種基于三聯吡啶釕[Ru(bpy)]摻雜硅納米顆粒（RuSi NPs）結合MIPs的電化學發光傳感器，運用電化學發光技術以及印記技術檢測玉米樣品中的OTA，其檢出限為0.027 pg/mL。Huang Zhipeng等以MIL-101為載體，以香豆素-3-羧酸為ZEN的模板，甲基丙烯酸為功能性單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯羥基丙烯酸甲基乙酯為交聯劑，制備了MIPs用于谷物樣品中ZEN的檢測。Wyszomirski等以5,7-二甲氧基香豆素作為AFB的替代品用于MIPs合成。結果表明，甲基丙烯酸和烯丙胺都可作為功能單體，對AFB和5,7-二甲氧基香豆素均有類似的結合作用。MIPs是一項有前景的識別原件，在檢測方面有很大的創新空間，但是因其缺少天然生物識別分子的柔性結構，在一定程度上影響了其親和力與靈敏度，從而限制了其在實際生產中的應用。

2 便攜式生物傳感器在真菌毒素檢測中的應用

2.1 基于側流層析試紙條的便攜式生物傳感器

側流層析試紙條（lateral flow strips，LFSs）是以條狀纖維層析材料為固相，借助毛細作用使樣品在層析材料上進行移動，并通過直接顯色的標記物或酶促顯色反應在短時間內獲得直觀檢測結果的檢測方法。與傳統的檢測方法相比，基于LFSs的檢測方法具有特異性強、成本低、易操作、不需要大型儀器設備等優點，同時也是目前報道最多、應用最廣的現場檢測方法。此外，基于LFSs的檢測方法可通過肉眼觀察判定檢測結果。因此，該類方法表現出的結果可視性和即時性為現場檢測提供了一個很好的平臺，已被研究者們廣泛應用于微生物、真菌毒素、農藥等的檢測中。基于LFSs的檢測方法有三類信號輸出方式：一類為通過顏色變化判定目標分析物的比色檢測方法；一類為通過熒光信號的變化判定目標分析物的熒光檢測方法；一類為通過磁信號變化判定目標分析物的檢測方法。下面分別對這三類信號輸出方法對真菌毒素的檢測進行一一闡述。

2.1.1 比色側流層析試紙條

基于顏色變化的比色LFSs是LFSs的重要組成部分，因其制作成本低、操作簡便、檢測速度快且不需要昂貴的檢測儀器而引起了研究者的廣泛興趣。比色LFSs可以根據其檢測線顏色的變化實現目標分析物的可視化檢測，因此在真菌毒素分析領域中得到了廣泛的應用。

2.1.1.1 納米金標記側流層析試紙條

AuNPs具有合成技術簡單、在多孔膜中的遷移率好、顏色鮮艷等優點，在LFSs領域備受青睞。AuNPs在LFSs上大量聚集時會產生紅色或粉色的斑點，可實現目標物的定性或半定量的檢測，被廣泛地應用于真菌毒素的檢測中。Hu Shurong等首次采用AuNPs標記的免疫LFSs用于根莖藥材中AFB的快速檢測。該方法采用AFB-BSA標記試紙條的檢測線，二抗標記控制線。當陰性樣品溶液滴在樣品墊上時，通過毛細管力將AuNPs標記的抗體復合物重新溶解在樣品溶液中，隨后該混合物遷移到檢測線和控制線。檢測線的AFB-BSA和控制線的二抗均能捕獲AuNPs標記的抗體復合物，使AuNPs在試紙條的檢測線和控制線聚集，檢測線和控制線均顯色；而當陽性樣品溶液滴在樣品墊上時，樣品溶液中AFB和檢測線上的AFB-BSA相競爭，導致試紙條上檢測線顏色變淺，只在控制線上表現出明亮的顏色。試紙條上控制線的設置是為了確保試紙條的有效性。在優化實驗條件下，所構建的免疫LFSs對AFB的檢出限低至0.1 ng/mL，檢測時間僅需15 min。盡管中藥基質具有復雜性，但該方法仍以簡單的程序實現了對藥材根莖中AFB的高選擇性、高靈敏性的快速檢測。基于相似的原理，Anfossi等建立了基于AuNPs標記的LFSs實現了葡萄酒和葡萄汁中OTA的快速檢測（5 min），檢測靈敏度為1 ng/mL。由于食品中真菌毒素的含量極低，為了提高AuNPs標記的LFSs靈敏度，其通過引入了“金標銀染”信號放大技術對檢測信號進行放大。“金標銀染”放大技術的基本原理為利用還原劑將銀離子還原并沉積在AuNPs的表面，形成一層銀外殼。由于銀具有較高的摩爾吸光系數，因此“金標銀染”能顯著放大檢測信號，將該方法的靈敏度提高了10余倍。

基于先前的闡述，適配體相較于抗體具有價格低廉、穩定性好、易于標記等優勢，因此科研工作者研究了以適配體為識別元件的LFSs對真菌毒素的檢測性能。例如，Zhou Weilu等開發了一種基于適配體的LFSs，實現了對黃芪中OTA的現場檢測。在最佳條件下，所開發的LFSs對OTA的檢出限是1 ng/mL，且與幾種同源毒素沒有顯著的交叉反應，整個檢測過程可在15 min內完成。以上結果表明在LFSs開發方面，適配體具有與抗體相比擬的檢測靈敏度。此外，Wu Shijia等也采用適配體為識別元件，研制了檢測ZEN的LFSs，對ZEN的檢測范圍為5～200 ng/mL，檢出限為20 ng/mL。

值得注意的是，由于農產品及食品往往同時受到多種真菌毒素的污染，當用傳統檢測裝置對單一目標物逐一檢測時，在增加時間成本同時也會增加經濟成本。因此開發簡單、快捷且可以同時檢測多種真菌毒素的裝置顯得尤為重要。Zhang Xian等則研制出可同時定量檢測玉米、小麥和飼料樣品中OTA和ZEN的LFSs。該免疫LFSs對OTA的檢出限為0.32 ng/mL，檢測范圍為0.53～12.16 ng/mL；對ZEN的檢出限為0.58 ng/mL，檢測范圍為1.06～39.72 ng/mL。隨后，Hou Silu等報道了一種基于25 nm AuNPs的多重免疫層析法，可同時定性檢測小麥和玉米樣品中的伏馬毒素B、DON和ZEN。該免疫LFSs具有較高的靈敏度，對伏馬毒素B、DON和ZEN的檢出限分別為60.0、12.5、6.0 ng/mL，且檢測結果與LC-MS檢測結果一致。

2.1.1.2 多色納米粒子標記側流層析試紙條

雖然上述基于AuNPs的免疫層析法可實現對真菌毒素的高靈敏和快速檢測，但由于同時檢測多種真菌毒素時，因其不同條帶表現相同的顏色，極易因為視覺干擾導致最終結果讀出錯誤。因此，開發避免視覺干擾的免疫LFSs十分重要。例如，一些研究者通過增加測試線之間的距離來避免視覺的干擾，但是提高了膜的成本和延長了檢測時間。為了更好地解決這一問題，di Nardo等研制了一種基于藍色沙漠玫瑰狀AuNPs和紅色球形AuNPs的多色免疫LFSs實現了對小麥粉中AFB、伏馬毒素的同時檢測。AFB和伏馬毒素的檢出限分別是2 μg/kg和1 000 μg/kg，檢測時間為10 min。此外，Xu Lin等開發了一種多色免疫LFSs實現了對玉米和谷類動物飼料中AFB、ZEN和T-2毒素的同時測定。他們將以上3種毒素的mAb分別標記綠色、藍色和紅色的羧基改性納米顆粒，得到信號探針。AFB、ZEN和T-2檢出限分別是0.5、2.0、30.0 ng/mL；檢測速度快，僅需20 min便可完成以上3種真菌毒素的分析，且該多色納米粒子標記的LFSs具有較強特異性和較高穩定性，在真菌毒素的現場檢測中具有巨大的應用前景。

2.1.2 熒光側流層析試紙條

熒光LFSs離不開熒光標記物質的合理選擇。具有熒光特性的物質是指一類在受到外界特定波長的光激發時，吸收能量后電子從基態躍遷到激發態，電子在返回基態時釋放出光子，產生熒光的物質。熒光物質主要包括有機熒光染料和無機納米粒子。在眾多有機熒光染料中，屬于水溶性3-吲哚菁型生物熒光標示染料的Cy5，易于與抗體進行偶聯，并且具有較好的熒光強度，因而常用于熒光LFSs的開發中。例如，Zhu Chao等將Cy5標記在AFB適配體上，檢測線和控制線分別標記AFB和適配體的互補鏈，通過競爭結合的原理，實現了AFB的高靈敏檢測，檢出限低至0.1 ng/mL。該Cy5標記的熒光LFSs在11種食物和飼料樣本的AFB分析中表現出良好的靈敏度和特異性。然而，由于Cy5為有機熒光染料，其具有熒光穩定較差、易于被光漂白的缺點，不適宜于長時間觀察檢測結果。量子點（quantum dots，QDs）作為一種新型的熒光納米材料，與有機熒光染料相比，QDs具有較寬的激發光譜、較窄的發射光譜、一元激發多元發射、較高的熒光穩定性等獨特優勢，在熒光LFSs的構建中具有較大的應用潛力。例如，Wang Libing等首次提出了一種基于適配體修飾QDs的熒光LFSs。該熒光LFSs通過競爭結合的原理實現了對OTA的檢測。當樣品溶液中不存在OTA時，QDs標記的適配體與測試線上標記的DNA探針1雜交，測試線上顯示較強的熒光信號；當樣品溶液中存在OTA時，OTA與QDs標記的適配體結合，測試線上的熒光信號減弱，基于測試線上熒光信號的強弱實現了樣品中OTA質量濃度的測定。實驗得到OTA檢出限為1.9 ng/mL，檢測時間僅需10 min。上轉換納米粒子（upconversion nanoparticle，UCNP）作為一類新型的熒光納米材料，與傳統的有機熒光染料和QDs不同之處在于其具有反斯托克斯（Stocks）的發光特性。具體而言，UCNP具有長波激發、短波發射的特點，因而在生物傳感領域可克服樣品或基質自發熒光的缺點，使得背景熒光信號顯著降低，進而提高了檢測的靈敏度，是當前熒光生物傳感器領域的熱點研究材料。例如，Wu Shijia等將UCNP與適配體相結合建立了用于OTA檢測的熒光LFSs。在該方法中，研究者先合成了羧基修飾的UCNP，再通過化學鍵合與氨基修飾的OTA適配體連接，形成信號探針。當樣品中沒有OTA時，信號探針將與標記在測試線上的OTA適配體互補DNA雜交，過量的探針與標記在控制線上的聚腺苷酸進行雜交。在980 nm激光激發下，控制線和測試線上均觀察到綠色熒光信號；當樣品中含有OTA時，OTA首先會與信號探針上適配體結合，結合產物沿硝化纖維素膜移動到達測試線時，信號探針和標記在測試線上的OTA適配體互補DNA的結合被削弱，但是該結合產物仍會與控制線上的聚腺苷酸堿基進行雜交反應。因此，在980 nm激光激發下，測試線上觀察到綠色熒光信號減弱，控制線上綠色熒光信號變化不大。最后用分析軟件測量兩條線的熒光強度，進行定量分析。在最優實驗條件下，該LFSs可在12 min內實現OTA的高靈敏檢測，線性范圍為5～100 ng/mL，檢出限為1.86 ng/mL。

2.1.3 磁信號側流層析試紙條

磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）主要包括四氧化三鐵納米粒子、三氧化二鐵納米粒子和鎳納米復合材料等。MNPs具有合成簡便、生物安全性高、獨特的磁性能使其在生物傳感領域具有廣泛的應用。MNPs在靶分子的檢測過程中可去除各種非目標物質，實現靶分子的分離和富集，減少基質干擾，放大檢測信號。此外，基于MNPs磁信號變化的檢測技術，與光學檢測技術相比，具有獨特的優勢。例如，生物樣品幾乎不表現出磁性能，因此基于磁信號的檢測背景信號干擾小，使其在檢測食品基質的真菌毒素時無需進行復雜的前處理步驟便可獲得較高的檢測靈敏度。此外，MNPs的磁信號穩定性好，不會隨著時間的延長而發生顯著的變化，方便對檢測結果隨時復查。Liu Daofeng等研發了一種改良的LFSs（兩步法）用于原乳中的AFM的檢測。與傳統的LFSs相比，該LFSs使用了兩種免疫磁性納米粒子（immunoma-gnetic nanoparticles，IMNPs），分別偶聯了高抗體濃度的IMNPs用以捕獲試驗樣品中的AFM、低抗體濃度的IMNPs用以AFM檢測信號的獲取。該LFSs對AFM的檢出限為0.02 mg/L，與傳統的LFSs相比較，靈敏度提高了25 倍。Guo Liang等將十八烷胺涂層的硒化鎘/硫化鋅量子點和油酸改性氧化鐵納米顆粒封裝成兩個具有不同疏水性能的復合材料，合成了具有獨特核/殼結構的雙功能的MNPs。在最佳檢測條件下，該方法線性范圍為5～150 pg/mL。在醬汁提取物和黑醬油中所得到的檢出限分別為3 pg/mL和49 pg/mL。

2.2 基于個人血糖儀的便攜式生物傳感器

PGM是一種測量血糖水平的電子儀器，因其便于攜帶、檢測快速、操作簡便、檢測結果直觀且準確而被廣泛應用于家庭健康實時監測中。Yu Xiang等創新性地以蔗糖酶為紐帶，將PGM用于非葡萄糖分子的檢測中，研究結果發表在雜志上。受到該研究的啟發，以PGM為檢測器件的真菌毒素便攜式傳感器的研究陸續展開。為實現真菌毒素與葡萄糖分子的關聯，從而最終實現PGM對真菌毒素的檢測，目前的信號傳導方式主要有兩種：一種是基于酶介導葡萄糖生成的信號傳導方式，另一種是基于靶標誘導葡萄糖釋放的信號傳導方式。

2.2.1 基于酶介導葡萄糖生成的信號傳導方式

Yu Xiang等利用PGM構建了用于OTA定量檢測的便攜式生物傳感器。在該項研究中他們使用競爭法定量檢測OTA。具體方法為制備OTA的mAb修飾的MNPs（MNPs-mAb）、DNA修飾的OTA（OTA-DNA）以及轉化酶修飾的DNA互補鏈（轉化酶-cDNA）用于OTA的檢測。當樣品液中不含OTA時，OTA-DNA與MNPs-mAb結合，加入轉化酶-cDNA后，DNA與cDNA雜交，使得轉化酶被MNPs捕獲，加入蔗糖后，溶液中產生大量的葡萄糖，PGM檢測出的信號值大；當樣品液中含有OTA時，OTA相較于OTA-DNA與MNPs-mAb的結合力更強，此時加入轉化酶-cDNA，轉化酶無法被MNPs捕獲，最終使得PGM檢測出的信號值小。在該工作中，以轉化酶為紐帶，通過樣品中OTA質量濃度與PGM測定的葡萄糖濃度之間的關系實現了OTA的定量檢測，最終得到OTA檢出限為6.8 ng/mL。上述方法需將DNA修飾在OTA上，以便與食品中的OTA競爭結合mAb，這無疑增加了檢測成本以及操作難度。OTA適配體本質上是一段DNA序列，因此以適配體為識別元件時則無需制備OTA-DNA，更易于構建基于PGM的便攜式傳感器實現OTA的檢測。例如，Long Feng等使用適配體為識別元件，構建了一種基于PGM的便攜式傳感器用于OTA檢測。具體方法為：首先，通過簡單的親和素-生物素反應制得了MNPs-適配體；其次，將轉化酶修飾連接在與適配體部分互補的DNA鏈上，得到轉化酶-cDNA。當OTA不存在時，MNPs-適配體與轉化酶-cDNA結合，磁分離后上清液中無轉化酶-cDNA，加入蔗糖后，蔗糖無法水解產生葡萄糖，用PGM檢測時所得信號值低；當OTA存在時，OTA與其適配體特異性結合，導致轉化酶-cDNA從雙鏈DNA結構中解離，磁分離后，上清液中存在大量的轉化酶-cDNA，加入蔗糖后，蔗糖水解產生大量葡萄糖，用PGM進行檢測時所得信號值高。利用該便攜式傳感器對緩沖液和紅酒中的OTA進行檢測，檢出限分別為3.31 μg/L和3.66 μg/L。

由于食品中真菌毒素的含量極低，研究者們將基于分子機器的信號放大技術用于構建超敏便攜式傳感器，以實現食品基質中痕量真菌毒素的檢測。DNA步行者傳感器包含軌道DNA鏈和步行DNA鏈，通常情況下研究者們將軌道DNA鏈固定于電極或納米材料上，步行DNA鏈的運動需要在在酶催化和鏈雜交反應驅動下才能進行。步行DNA鏈一旦被激活，DNA步行者分子機器就可以重復機械周期，從而實現檢測信號的放大。DNA步行者具有可預測、快速的可編程特性，已被應用于不同的目標生物傳感器的開發。Yang Xinsheng等構建了基于脫氧核酶驅動的DNA步行者分子機器，用于AFB的高靈敏檢測。該方法的具體原理是在軌道DNA鏈上設計脫氧核酶的底物序列，并在其一端修飾蔗糖酶，一端修飾巰基，通過金硫鍵的相互作用將軌道DNA鏈固定在電極表面，此外步行DNA鏈上設計了脫氧核酶的酶序列。無AFB存在時，AFB的適配體與軌道DNA鏈上的底物鏈互補配對，使得步行DNA鏈上的酶鏈無法與軌道DNA鏈上的底物鏈結合，致使DNA步行者分子機器無法啟動；AFB存在時，AFB與其適配體特異性結合，脫離了金電極表面，此時加入步行DNA鏈，步行DNA鏈上的酶鏈與軌道DNA鏈上的底物鏈結合，在鉛離子輔助下，將軌道DNA鏈上的底物鏈切成兩段，從金電極表面釋放出軌道鏈上的蔗糖酶和步行DNA鏈。隨著步行DNA鏈在軌道鏈上的持續行走，大量的蔗糖酶被釋放。通過收集釋放的蔗糖酶，溶液中的蔗糖被蔗糖酶轉化成葡萄糖，最后通過PGM進行檢測信號的讀取。在優化實驗條件下，該方法對面包中AFB的檢出限低至10 pmol/L。

2.2.2 基于靶標誘導葡萄糖釋放的信號傳導方式

除了上文中所介紹的基于酶介導葡萄糖生成的信號傳導方式以外，還有基于靶標誘導葡萄糖釋放的信號傳導方式。如Tang Dianping等制備了聚乙烯亞胺包覆的介孔二氧化硅納米容器（polyethylenimine-coated mesoporous silica nanocontainers，PEI-MSN）和AFB的mAb標記的AuNPs（mAb-AuNPs），用于構建均相免疫檢測新方法，實現了PGM對AFB快速、高靈敏在線檢測。該方法的具體原理是PEI-MSN可將大量的葡萄糖分子裝載進入其孔道中，由于mAb-AuNPs與PEI-MSN帶有相反的電荷，它們之間的靜電作用可使mAb-AuNPs作為“門”以避免葡萄糖分子從PEI-MSN中逃逸出來；在AFB存在下，由于mAb與AFB的親和力遠遠大于其與PEI-MSN的親和力，從而導致mAb-AuNPs從PEI-MSN表面脫落，最終導致葡萄糖從孔道里釋放出來，利用PGM對釋放出來的葡萄糖進行信號讀取，可實現AFB的高靈敏檢測，檢出限為5 ng/kg。

2.3 基于溫度計的便攜式生物傳感器

受到前文描述的將PGM應用于非葡萄糖分子現場檢測的啟發，科研工作者將越來越多的其他類型的小型化商用儀器作為信號讀取設備，只需建立適當的信號傳導方式，便可實現靶分子的現場檢測。在眾多小型化商用儀器中，溫度計在我們的日常生活中使用最為廣泛，是人們普遍會使用的小型儀器。并且，相較于血糖儀，溫度計的價格也更低廉。因此，溫度計可以用于構建便攜式生物傳感器，用于農藥殘留、真菌毒素、生物小分子等的檢測中。

由于真菌毒素分子質量較小，采用傳統的免疫檢測法對真菌毒素進行檢測時往往采用競爭免疫法。在競爭免疫法中，通常需要制備包被抗原或者抗原修飾的信號探針，以便和待測樣品中的游離抗原競爭結合其mAb，最終實現靶分子的檢測。需要注意的是，制備包被抗原或者抗原修飾的信號探針時，需要消耗大量的抗原，且在分離純化的過程中使得抗原進入到環境中。由于真菌毒素作為抗原，其具有較大的毒性，因此采用該方法會對環境造成污染，也會對研究人員造成危害。為了克服這一問題，Chen Yanjie等創新性地通過噬菌體展示技術獲得ZEN的模擬表位肽，并在該模擬表位肽上修飾具有良好光熱性能的螺旋碳納米管作為信號探針（peptides@HN-HCNTs）。ZEN與peptides@HNHCNTs競爭結合固相載體上的mAb，導致近紅外激光照射下的溫度升高量與ZEN的濃度成反比。該方法可成功應用于谷物中ZEN的便攜式檢測，線性檢測范圍為10～10ng/mL，檢出限為1.06h10ng/mL。

2.4 基于pH計的便攜式生物傳感器

pH計是用來檢測溶液酸堿度的電子器件，可以準確地測定溶液的pH值，作為易攜帶、操作簡便、成本低和實驗結果可量化的儀器，在構建生物傳感器中得到了廣泛的應用。目前，研究者們已經構建了以pH計為讀出裝置的生物傳感器來檢測細菌、DNA、真菌毒素等不同類型的靶標物。例如，Wang Lixu等將AFB標記在脲酶上（AFB-脲酶），采用競爭免疫法實現了pH計對AFB的高靈敏度、高選擇性檢測。具體方法為：首先將AFB的mAb修飾在MNPs上，獲得用于AFB檢測的IMNPs。無AFB存在時，IMNPs與AFB-脲酶結合，加入尿素，脲酶催化尿素水解，導致溶液pH值升高；當AFB存在時，IMNPs與AFB的結合能力強于與AFB-脲酶的結合能力，此時，IMNPs無法捕獲脲酶，加入尿素后，尿素無法被水解，導致溶液pH值不發生變化。AFB在0.62～23.42 ng/L范圍內，pH值與AFB質量濃度的對數呈線性關系。該便攜式生物傳感器可以用于食品基質中AFB高靈敏度、高選擇性檢測，具有很好的應用前景。需要注意的是使用該方法對AFB進行檢測時，需進行多次分離、洗滌步驟，導致操作過程比較繁復。該方法屬于非均相檢測，而均相檢測不需要進行分離和洗滌的步驟，因此操作簡便更適宜于現場分析。

DNA水凝膠是一種三維網絡結構的聚合物，由兩條聚丙烯酰胺-DNA鏈和一條核酸適配體組成，其腔體可裝載酶分子以及納米粒子。當靶標物存在時，靶標物與其適配體特異性結合導致適配體發生構象變化，誘導DNA水凝膠瓦解，從而釋放出包被的酶分子或納米粒子，最終實現靶標物的均相檢測。例如，Zhao Mengmeng等制備可用于AFB檢測的DNA水凝膠，并將脲酶包裹在DNA水凝膠中。加入包含AFB的樣品溶液后，AFB與其適配體結合，導致DNA水凝膠瓦解，致使脲酶被釋放到溶液中，釋放的脲酶催化尿素水解，導致溶液pH值升高，通過pH計對溶液pH值的測定，可實現AFB的便攜式檢測，該方法對AFB的檢出限為0.1 μmol/L。

2.5 基于手持氣壓計的便攜式生物傳感器

壓力的測量已經被廣泛應用于多種檢測領域當中。在封閉的器皿中，氣體的生成可使壓力增加。通過將分子識別轉化為密閉器皿中氣體的生成，便可實現目標物的檢測及含量的推算。

Zhang Weiqi等利用競爭免疫法實現了便攜式氣壓計對AFB的高靈敏檢測。具體方法為：首先將AFB的包被抗原AFB-BSA吸附在微孔板底部，再同時加入樣品提取液和AFB的mAb。當樣品液中不含有AFB時，mAb與微孔板上的包被抗原特異性結合，接著加入二抗標記的金-鉑核殼納米粒子（Au@PtNPs-IgG），Au@PtNPs-IgG與mAb特異性結合，由于Au@PtNPs具有過氧化氫酶活性，在該體系中加入HO后，HO被Au@PtNPs催化分解產生O，利用手持式氣壓計記錄體系的壓力，得到較高的壓力信號；當樣品液中含有AFB時，mAb與AFB的結合能力強于其與AFB-BSA的結合能力，此時，微孔板無法捕獲Au@PtNPs-IgG，加入HO后，HO無法被分解，導致檢測體系無壓力信號的增大。該研究中，氣壓計的信號值與AFB質量濃度成反比。在最優條件下，AFB線性范圍為0.09～16.0 ng/mL，且其檢出限為0.03 ng/mL。

2.6 基于智能手機的便攜式生物傳感器

當今社會，因為智能手機的普遍存在且便于攜帶，研究者們將智能手機也運用到了生物傳感器的構建當中。Jin Birui等開發了一種新的LFSs，用于同時檢測水樣中的Hg、OTA、沙門氏菌。具體方法為：首先合成具有紅、綠、藍發射峰的UCNPs，作為產生熒光信號的檢測探針；其次將不同的UCNPs分別修飾在不同目標物的適配體上裝載于樣品墊上，將不同目標物的適配體互補鏈固定在3 條檢測線上。向樣品墊上加入樣品，若樣品中沒有目標物時，UCNPs修飾的適配體與測試線上互補鏈結合，將LFSs插入便攜式閱讀器，智能手機上軟件所顯示的檢測線熒光強度強；相反，智能手機上軟件所顯示的檢測線熒光強度弱。該生物傳感器使我們能夠使用LFSs同時檢測和量化多個目標，最終從智能手機上所顯現的相應色帶的顏色強度得出結果。該方法可在30 min內完成檢測，其中對OTA的檢出限為3 ng/mL。

2.7 基于微流控芯片的便攜式生物傳感器

在眾多的便攜式生物傳感器構建當中，微流控芯片也是近些年來備受親睞的便攜式檢測的理想工具。微流控芯片技術是把生物、化學、醫學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程的微型生物化學分析系統，是檢測細胞、核酸、蛋白質及其他生物樣品重要手段，具有方便快捷、靈敏且成本低等優點，已被廣泛應用于便攜式快速檢測中。

Ma Yanli等利用DNA水凝膠和微流控芯片構建了便攜式生物傳感器實現了對AFB的檢測。具體方法為：用兩條聚丙烯酰胺-DNA鏈和AFB適配體構建成DNA水凝膠，在其腔體裝載PtNPs。加入含有AFB的樣品液后，AFB與適配體特異性結合使適配體構象變化，導致水凝膠迅速瓦解，釋放出PtNPs，將上清液加入到微流控芯片中，PtNPs催化HO分解生成O，通過氣體驅動芯片中的紅色墨水移動，通過測量紅色墨水移動的距離計算出樣品中AFB的濃度。用該方法對啤酒中AFB進行檢測，檢出限為1.77 nmol/L。

2.8 其他便攜式生物傳感器

除了上述所提到的LFSs、PGM、pH計和微流控芯片等以外，研究者們還用到了其他設備對真菌毒素進行檢測。

便攜式阻抗探測器也受到了研究人員的關注，因其體積較小、便于攜帶、結果讀出快捷方便被用來構建生物傳感器以實現對毒素的檢測。Goud等設計了一種電化學阻抗探測器傳感器用于檢測AFB。該檢測是以絲網印刷碳電極（screen printed carbon electrodes，SPCEs）為基底進行的，通過重氮鹽共價結合將AFB的適配體固定在電極表面，AFB與適配體結合導致阻抗發生變化，最后通過阻抗探測器結果變化進而判定AFB的質量濃度。同時在該研究中，研究人員還對兩個適配體序列（seq A和seq B）的分析性能進行了比較，結果顯示，使用seq A和seq B對AFB的檢出限分別為0.12 ng/mL和0.25 ng/mL。研究者們為實現更快捷、方便的檢測，通過3D打印技術將電極制成USB兼容傳感器。Li Zhanming等提出了一種基于絲網印刷交錯微電極（screenprinted interdigitated microelectrodes，SPIMs）和阻抗探測器相結合的電化學生物傳感器，實現了對水稻中AFB低成本、高選擇、高靈敏度檢測。采用3D打印技術制成USB兼容傳感器，在該USB傳感器內部設計有一凹槽，凹槽中放置SPIMs，并在其表面修飾AFB的mAb，最后用BSA對其進行封閉。AFB與mAb的結合將導致阻抗發生變化，在檢測中將該USB兼容傳感器與阻抗探測器相結合可實現樣品中的AFB便攜式檢測，在最佳條件下，該方法對AFB的檢出限為5 ng/mL，總檢測時間小于1 h。

光電化學生物傳感器由于獨特的優勢，已經得到了廣泛的研究和應用。但是電化學工作站和光源的需求限制了便攜式光電化學生物傳感器的發展。Hao Nan等開發了一種便攜式太陽能驅動的光電化學可視化生物傳感器用于檢測玉米汁中OTA，該生物傳感器是在一個小的銦錫氧化物電極上制作的，它分為兩個模塊，一個是檢測模塊，另一個是參考模塊，每個模塊由兩個區域組成，分別為光電傳感區域和視覺區域。光電傳感區域采用三維石墨烯水凝膠納米復合材料構建，視覺區域采用電致變色材料普魯士藍構建。當OTA質量濃度變化時將導致電子遷移量變化從而引起視覺區域顏色變化，通過這兩個模塊上的視覺區域的色度比得到檢測物的質量濃度。線性檢出范圍為1～500 ng/mL，檢出限為0.29 ng/mL。該傳感器由于其高精度和便攜性，將為生物分析、食品檢測等領域的研究帶來光明的前景。

Joshi等構建了一種利用便攜式表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器，對啤酒中DON和OTA進行競爭性免疫測定。SPR即為一種光入射金屬表面產生的物理光電現象，通過測折射率進而判定目標物含量的技術。應用該方法對啤酒中DON、OTA進行檢測，得出DON檢出限為17 ng/mL，OTA的檢出限為7 ng/mL（或濃縮75 倍后OTA檢出限為0.09 ng/mL）。該方法可用于啤酒中DON現場檢測，無需預濃縮；而啤酒中的OTA則需要額外的富集步驟，該方法不太適用于OTA的現場檢測。

表3整理了上述基于便攜式生物傳感器的毒素檢測方法。

表3 基于便攜式生物傳感器的毒素檢測方法Table 3 Mycotoxin detection method based on portable biosensor

3 結 語

真菌毒素的廣泛存在使食品安全問題頻發。傳統的真菌毒素檢測方法大多需要大型儀器設備、專業人員和成本偏高的材料，這些因素極大地限制了這些檢測方法在現場檢測中的推廣使用。因此開發操作簡單、快速、靈敏且可用于即時檢測真菌毒素的便攜式生物傳感器十分重要。便攜式生物傳感器的構建是現場即時檢測的必然趨勢。

目前不斷出現的便攜式生物傳感器在檢測真菌毒素方面取得了很好的成就，但是仍存在一些問題，有待進一步的完善：1）在食品當中往往會存在有兩種或多種真菌毒素，在檢測不同真菌毒素時，會因檢測所需條件的差異而導致檢測程序復雜化，因此開發多種真菌毒素同時檢測的生物傳感器很有必要；2）食品基質復雜，在真菌毒素的檢測當中會帶來影響，因此，需要進一步提高這些傳感器的抗干擾能力。

未來的便攜式檢測儀器將往更靈敏、抗干擾能力更強、質量輕、功能豐富、電池工作時間長、數據存儲方便、價格便宜、有防撞防水外殼、在戶外顯示清晰的方向發展，以滿足實際生活中對樣品即時檢測的需要。總之，廣大研究者們需要拓寬思維，實現多學科的結合，從而構建出操作簡單、快速、靈敏、抗干擾的便攜式生物傳感器，實現對真菌毒素的現場即時檢測。