正交優化黃連多糖提取工藝及其對α-葡萄糖苷酶的作用研究

王長鳳

黃連為毛茛科黃連屬植物黃連(CoptischinensisFranch)、三角葉黃連(CoptisdeltoidenC. Y. Cheng et Hsiao)或云南黃連(Coptisteetawall.)的干燥根莖，是臨床治療中常用的中藥材。黃連味苦，性寒，具有清熱祛濕、瀉火解毒的功效[1-3]。黃連多糖是黃連的重要活性成分，現代藥理學研究發現黃連多糖具有降血糖、抗氧化、抗病毒等生物活性作用[4-6]。

目前黃連多糖的提取方法多為水提取法，該方法簡單、容易操作，但是其多糖提取率不高，容易造成多糖損失[7]。此研究利用超聲輔助提取黃連多糖，并對提取工藝進行正交優化，同時就黃連多糖對α-葡萄糖苷酶活性的作用進行研究，以期為黃連的研究與開發提供理論基礎。

1 儀器與試藥

黃連購買于河南省輝縣藥材市場，經范勝蓮副主任中藥師鑒定為毛茛科植物黃連的根莖；α-葡萄糖苷酶(北京索萊寶科技有限公司)；4-硝基苯-α-D葡萄糖苷(PNPG，美國Sigma公司)；濃硫酸、苯酚等其它試劑為分析純。WF-萬能粉碎機(江陰市康和機械制造有限公司)；CHG型超聲提取器 (德陽四創科技有限公司)；紫外分光光度計UV7(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)。

2 方法

2.1 提取工藝流程采用超聲輔助提取法進行黃連多糖的提取，并利用Sevage法除去蛋白質，得到黃連多糖提取物，具體流程為：黃連→粉碎→過篩→石油醚回流脫脂脫色 3 次(1.5 h /次) →烘干→超聲輔助提取→抽濾→濾液減壓濃縮→5 倍體積 95% 乙醇沉淀12 h→6000 r/min 離心20 min→沉淀物→無水乙醇洗滌→水溶→Sevage法脫蛋白5次→冷凍干燥→多糖粗品[8]。

2.2 多糖含量測定稱取葡萄糖對照品 50 mg，加水溶解定容至100 ml容量瓶中，備用。精密移取 0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml對照品溶液，定容于 50 ml容量瓶中。分別精密移取2 ml于試管中，分別加入1.0 ml 6%苯酚和5.0 ml濃硫酸混勻，靜置 10 min，冷卻至室溫，于 490 nm 處測定吸光度。以多糖含量(mg)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線[9]。通過線性回歸得出方程為Y=12.312X-0.0351，線性范圍為0.005 ～0.05 mg/ml，相關系數為r=0.9998。

2.3 正交優化超聲輔助提取工藝稱取2.0 g黃連干粉若干份，分別選取液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 ml/g)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、提取功率(60、70、80、90、100 W)進行單因素實驗。在單因素試驗基礎上，采用正交試驗優化黃連多糖提取工藝。見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.4 黃連多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制機制反應在96孔板上進行，每組設3個復孔，阿卡波糖為陽性對照藥物[10]。測定組：112 μl磷酸緩沖液(pH=6.8)，加入0.2 U/ml的α-葡萄糖苷酶20 μl，二甲基亞砜8 μl，加入50μl的待測提取物，37 ℃恒溫孵育20 min后加入2 mmol/L PNPG 20 μl，37 ℃恒溫反應15 min。再加入1 mol/L 碳酸鈉溶液100 μl終止反應，于405 nm波長下測定吸光度。同時做相同體系下，空白組：不加抑制劑和α-葡萄糖苷酶，其它條件與測定組相同；未加抑制劑測試組：不加抑制劑，其它條件與測定組相同；未加酶空白組：不加α-葡萄糖苷酶，其它條件與測定組相同。均用蒸餾水作空白，于405 nm波長處分別測定吸光度值。樣品對α-葡萄糖苷酶活性抑制率公式如下：抑制率(%)=(A對照-A樣品)/(A對照-A空白)×100%。式中：A空白為空白對照組的吸光度值；A對照為未加樣品的吸光度值；A樣品為樣品組的吸光度值。并用SPSS 19.0軟件求出相對應半數抑制濃度IC50。

2.5 黃連多糖對α-葡萄糖苷酶抑制類型測定參照2.4項下方法，底物PNPG濃度依次為0.067，0.1，0.2，0.5和1.0 mmol/L。在多糖濃度分別為1 mg/ml和2 mg/ml時，記錄每分鐘PNP吸光度值，測定酶促反應速度V。采用Lineweave-Burk作圖法，1/C為橫坐標，1/V為縱坐標，確定抑制類型，式中C為底物PNPG濃度，V為酶促反應速度，根據米氏方程計算動力學常數[11]。

3 結果與討論

3.1 單因素試驗結果

3.1.1 液料比對多糖提取率的影響液料比對于多糖的提取具有十分關鍵的影響，液料比過大，可能造成多糖的提取率降低且其余雜質也容易一起提取出來，從而影響多糖純度，加大后續純化的難度。若液料比過小，容易出現多糖提取不充分的情況。因此此實驗在超聲功率90 W、提取時間30 min的條件下，考察液料比對黃連多糖提取率的影響。在料液比為15∶1～25∶1 ml/g時，黃連多糖提取率隨提取溶劑體積的增加而增大，當液料比為25∶1 ml/g時，黃連多糖的提取率達到最大為5.31%；隨著溶劑體積繼續增加，多糖提取率降低。出現這種趨勢的原因可能是提取溶劑體積增大，多糖質量濃度降低，傳質推動動力變大，提取速度增加，提取率增大；當溶劑體積繼續增加達到一定數值時，提取率緩慢降低，可能是因為有大量的雜質溶出，影響多糖浸出率[12]。見圖1。

圖1 液料比對多糖提取率的影響

3.1.2 提取時間對多糖提取率的影響提取時間是影響多糖提取率的重要因素之一。若提取時間過短，容易出現多糖提取不充分的情況，造成資源的浪費。若提取時間過長，可能會導致多糖的結構發生改變，影響多糖的提取率和穩定性。因此，在超聲功率90 W、液料比30∶1 ml/g的條件下，觀察提取時間對黃連多糖提取率的影響。在20～40 min內，多糖提取率隨提取時間增加而增大，在提取時間為40 min時，提取率最大為5.56%。當提取時間超過40 min后，多糖提取率逐漸下降，這可能是因為超聲輔助時間過長導致黃連多糖的結構受到破壞，進而導致多糖提取率降低。見圖2。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響

3.1.3 提取功率對提取率的影響超聲輔助功率在多糖提取過程中起到十分關鍵的作用，超聲輔助提取通過空穴效應、熱效應和機械效應提高多糖的提取效率。若超聲功率過高，容易破壞多糖的結構和性質。若超聲功率過低，則起不到輔助提取的作用，進而導致多糖提取率偏低的情況出現。因此，在液料比30∶1 ml/g、提取時間30 min的條件下，觀察提取功率對黃連多糖提取率的影響。在60～90 W內，多糖提取率逐漸增加。當功率大于90 W后由于超聲功率過高，多糖結構受到破壞，不利于黃連多糖的提取[13]。見圖3。

圖3 提取功率對多糖提取率的影響

3.2 正交試驗結果選取的3個單因素對于黃連多糖提取率的影響順序為：B(提取時間)>C(提取功率)>A(料液比)。黃連多糖提取最優工藝參數為A2B3C3，即液料比40 ml/g，提取功率100 W，提取時間 30 min。采用優化提取條件進行工藝驗證試驗，測得多糖平均提取率為8.06%(n=3，相對標準偏差為0.89%，8.06%的提取率是根據最優工藝參數為A2B3C3，即液料比為40 ml/g，100 W提取功率，30 min提取時間，進行3次實驗得到的平均值)，高于正交試驗各組，說明該工藝重復性較好。見表2。

表2 正交試驗方案與結果

3.3 抗氧化活性研究

3.3.1 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用阿卡波糖是目前已上市的α-葡萄糖苷酶特異性抑制劑[14]。在不同濃度阿卡波糖作用下，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈良好量效關系，說明此實驗α-葡萄糖苷酶體外抑制模型符合實驗需要。見圖4。

圖4 阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

3.3.2 黃連多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制機制黃連多糖對α-葡萄糖苷酶有抑制作用，且在一定范圍內隨著濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶抑制作用也逐漸增強，黃連多糖的IC50為3.884 mg/ml。黃連多糖呈典型的競爭性抑制曲線，即隨抑制劑濃度增加，反應速度保持不變，說明黃連多糖與α-葡萄糖苷酶底物在該酶上的結合部位是相同的[15]。見表3，圖5、圖6。

圖5 黃連多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

圖6 黃連多糖對α-葡萄糖苷酶抑制動力學

表3 黃連多糖對α-葡萄糖苷酶抑制擬合方程和動力學參數

4 結論

此實驗在單因素實驗基礎上，合并正交試驗優化黃連多糖的提取工藝，結果表明黃連多糖提取的最佳工藝條件為液料比40 ml/g，提取功率100 W，提取時間30 min。采用優化提取條件進行工藝驗證試驗，測得多糖平均提取率為8.06%。提取的黃連多糖對α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用，且其抑制類型呈典型的競爭性抑制。此實驗優化得出的黃連多糖提取工藝及其對α-葡萄糖苷酶的作用，具有開發為降糖藥巨大的市場前景，可為黃連的開發與利用提供基礎。