鐵皮石斛中石斛多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取

徐艷飛,夏 謙,李康銀,李小麗,谷 紅

(1.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南 玉溪 653106；2.云南和瑾科技有限公司,云南 昆明 675400)

鐵皮石斛(Dendrobium officinale KimuraetMigo)是蘭科石斛屬，為蘭科第二大屬，包括1500多種植物[1]。我國的石斛種類有74種，2個(gè)變種，大多分布在云南、貴州、廣東、廣西、浙江等地[2]。石斛是一種多年生草本植物，采收2～3年生為好，11月至翌年3月釆收,藥用部位為新鮮品或干燥的根莖。鐵皮石斛化學(xué)成分及藥理活性是目前石斛領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)[3]。近年來，從具有藥理活性的40多種石斛中分離出將近100種活性化合物，包括：石斛多糖、石斛堿、石斛酚、氨基酸、黃銅、萜類、甾體、微量元素等[4-6]。大量藥理活性研究表明，鐵皮石斛具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗突變、降血壓、降血脂、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗輻射、抗?jié)儭⒖顾ダ系裙π7]。除藥用外，石斛作為保健食品已有幾千年的歷史。因此這些活性成分在提高免疫力、抗衰老、抗疲勞等方面進(jìn)行中成藥制劑成品與保健品的開發(fā)極具前景[8]。鐵皮石斛中的活性成分石斛多糖、生物堿、聯(lián)芐酚等均為重要的功能化合物，這些活性物質(zhì)的提取純化已成為近年來的一個(gè)研究熱點(diǎn)，但以往的研究多為單一活性成分分離提取及藥理活性研究，對(duì)他們的聯(lián)合提取和對(duì)石斛中石斛酚的提取及含量測(cè)定方面的研究較少，造成鐵皮石斛原材料的極大浪費(fèi)。因此，對(duì)鐵皮石斛中多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取對(duì)于鐵皮石斛這種珍貴中藥材的綜合利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[9]。本研究利用冷浸-超聲、乙醇回流提取、醇沉返溶等方法，對(duì)鐵皮石斛中石斛多糖、石斛堿、石斛酚進(jìn)行了聯(lián)合提取，并進(jìn)行含量、純度測(cè)定，具有流程簡單、工藝可靠、純度高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料和試劑

鐵皮石斛(購自云南省昆明市呈貢區(qū)云南端端生物科技有限公司)，鑒定為3年生最佳采收期采收的石斛鮮條(2 kg)，經(jīng) 110 ℃ 殺青 30 min，60 ℃ 烘干至恒重，粉碎，過三號(hào)篩(0.355 mm)；無水葡萄糖對(duì)照品(用前 105 ℃ 烘 2 h)、石斛堿對(duì)照品、石斛酚對(duì)照品(購于中國食品藥品檢定研究所)；苯酚試劑(分析純，200 mL 苯酚，加入 0.2 g 鋁片和 0.1 g 碳酸氫鈉蒸餾，收集182餾分。稱取 17 g，加水 150 mL 混勻，溶解即得，置棕色瓶中，放入冰箱備用)；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、其他試劑(分析純)、屈臣氏蒸餾水、實(shí)驗(yàn)室自制去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜分析儀(島津LC-10AT/SPD10A)；色譜工作站(LabSolutions LCsolution)，紫外可見分光光度計(jì)(UV-2550)；氣相色譜分析儀(島津GC2010 Pro)；超聲波清洗器(KQ5200E)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-5286A)；電子天平(BT2202S，北京賽多利斯儀器有限公司)；離心機(jī)(LD5-2A)；凍干機(jī)(SJIA-10N-60D)；超微濾膜(津騰50×0.22 μm)；家用多功能料理機(jī)(CX-301，中山市九陽小家電有限公司)。超純水系統(tǒng)(上海葉拓YTUP-30)，電熱恒溫干燥箱(IKA HB10)、電熱套、酸度計(jì)(PHS-25)

2 方法與結(jié)果

2.1 石斛多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取

取 110 ℃ 殺青 30 min，60 ℃ 烘干至恒重，粉碎，過三號(hào)篩(0.355 mm)的鐵皮石斛粉 20 g，加入 80 ℃ 超純水浸泡 8 h 以上，超聲 20 min，離心過濾得濾液(A部分)和濾渣(B部分)兩部分。或用新鮮鐵皮石斛加10倍無水乙醇打漿，加 60 ℃ 水?dāng)嚢杼崛?1 h，過濾得濾液和濾渣兩部分。

2.1.1 石斛多糖的提取與精制

取A部分濾液，加入無水乙醇至無沉淀產(chǎn)生，離心過濾。所得濾液可蒸餾回收乙醇。所得沉淀加5倍的水返溶，將所得溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮至體積為原來的1/10，加入乙醇達(dá)80%質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在冰箱中靜置醇沉，過夜。離心過濾，棄上層清液。將沉淀用乙醚、無水乙醇依次洗滌，過濾，所得濾液經(jīng)凍干機(jī)預(yù)凍 10 h，再進(jìn)行真空凍干即得石斛多糖精品 4.2631 g。流程如圖1所示。

圖1 石斛多糖的提取純化

2.1.2 石斛堿、石斛酚的提取與精制

取B部分濾渣，用無水乙醇回流提取 1 h。所得濾液旋蒸回收乙醇，離心過濾；所得固體于恒溫干燥箱中 70 ℃ 烘干，即得石斛堿和石斛酚。向該固體中加入10%稀鹽酸，4000 r/min 離心 20 min,過濾得固體為石斛堿，純度為12%；液體為石斛酚，經(jīng) 70 ℃ 烘干的純度為27%石斛酚。流程如圖2所示。

圖2 石斛堿、石斛酚的提取純化

2.2 石斛多糖含量測(cè)定

石斛多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[10]。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1)多糖對(duì)照品溶液的制備。精密稱取無水葡萄糖對(duì)照品 10 mg，加水溶解并定容至 100 mL，即得 100 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置 10 mL 具塞試管中；分別往里補(bǔ)水至 1 mL，得質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別精密加入5%苯酚溶液 1 mL，震蕩搖勻，再精密加入濃硫酸 5 mL，置沸水浴中加熱 20 min，取出置冷水浴中冷卻至室溫；以 1 mL 水，同法操作，作為空白對(duì)照。按照紫外-可見分光光度法，在 490 nm 波長處測(cè)吸光度，得回歸方程為y=0.008x-0.0067，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。

圖3 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 石斛多糖樣品的測(cè)定

精密稱取2.1.1項(xiàng)下制得的石斛多糖精品 20 mg，加水溶解定容至 100 mL，取 1.0 mL 置于具塞試管中，按“2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)方法進(jìn)行測(cè)定。

2.3 石斛堿的測(cè)定

石斛堿的測(cè)定采用酸性染料比色法。

2.3.1 石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取石斛堿對(duì)照品 1 mg，用氯仿溶解并定容至 100 mL，得 10 μg/mL 石斛堿對(duì)照品溶液。精密量取對(duì)照品溶液1、2、3、4、5 mL，用氯仿稀釋至 10 mL；加入 5 mL pH4.5的HAc-NaAc緩沖液和 2 mL 0.04%溴甲酚綠溶液，劇烈振搖 3 min，室溫靜置 30 min;將氯仿層用經(jīng)氯仿浸泡干燥后的藥棉濾過。取續(xù)濾液 5 mL，加 1 mL 0.01 mol·L-1氫氧化鈉無水乙醇溶液。以氯仿 10 mL，同法操作，作為空白對(duì)照。按照紫外-可見風(fēng)光光度法，在 620 nm 處測(cè)吸光度。得回歸方程為：y=0.1667x-0.0075，R2=0.9994。

圖4 石斛堿對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 石斛堿樣品的測(cè)定

精密稱取本實(shí)驗(yàn)2.1.2項(xiàng)下制得的石斛堿樣品 50 mg，置于 100 mL 容量瓶中，用氯仿溶解并定容至 100 mL。其余同2.3.1“石斛堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下操作方法，測(cè)定石斛堿的含量。

2.4 石斛酚的測(cè)定

超高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法(UPLC-EDC)測(cè)定所得產(chǎn)品中的石斛酚[11]。

2.4.1 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取 20 mg 石斛酚對(duì)照品，加入甲醇溶解并定容至 100 mL，得 20 mg/L 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃ 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ∈訕?biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 mL，分別加入甲醇稀釋至 100 mL，得質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和 10.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照以下色譜條件測(cè)定：色譜柱C18柱ODS柱(4.6 mm×150 mm，粒徑 5 μm)；柱溫 30 ℃；流動(dòng)相為 20 mmol/L 乙酸銨溶液(pH3.6)-乙腈[60%∶40%(體積比)]；流速 1 mL/min；進(jìn)樣量 10 μL；ECD檢測(cè)電壓 520 mV，檢測(cè)波長 230 nm[11]。以峰面積y作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)系列溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。石斛酚的回歸方程為y=13.045x+0.5187,R2=0.9997。

圖5 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.2 石斛酚樣品的測(cè)定

精密稱取本實(shí)驗(yàn)2.1.2項(xiàng)下制得的石斛酚樣品 50 mg，置于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 100 mL。其余同2.4.1“石斛酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)下操作方法，測(cè)定石斛酚的含量。

3 結(jié)論

利用冷浸-超聲、乙醇回流提取、醇沉返溶等方法對(duì)鐵皮石斛中石斛多糖、石斛堿、石斛酚進(jìn)行了聯(lián)合提取，所得石斛多糖、石斛堿、石斛酚的純度分別為89%、12%、27%。對(duì)鐵皮石斛的主要活性成分石斛多糖、石斛堿、石斛酚的聯(lián)合提取，流程簡單，工藝可靠，能耗低，生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。為鐵皮石斛有效成分的綜合利用提供一定的參考依據(jù)。