急性髓系白血病患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系

王曉萍，李啟欣，林 靜

佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000

急性髓系白血病(AML)為人類常見(jiàn)造血系統(tǒng)惡性腫瘤，骨髓中集聚血細(xì)胞的髓性癌，且快速生長(zhǎng)的異常白細(xì)胞會(huì)干擾正常血細(xì)胞的生成，可致髓性癌從骨髓進(jìn)入血液并取代正常血細(xì)胞所引起的高度異質(zhì)性疾病，呈現(xiàn)慢性進(jìn)展的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人體健康[1]。近年來(lái)，盡管移植預(yù)處理方案不斷優(yōu)化，抗排斥技術(shù)不斷進(jìn)步，臨床新藥不斷發(fā)展，但大多數(shù)AML患者的預(yù)后仍欠佳，患者復(fù)發(fā)率較高，其根本原因在于微小殘留的存在，故最大限度地清除微小殘留對(duì)于延長(zhǎng)AML患者緩解期、提高治愈率至關(guān)重要[2]。隨著腫瘤免疫治療的不斷進(jìn)展，國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)與血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，其中，T淋巴細(xì)胞為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，經(jīng)抗原刺激后能形成特異性的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞而產(chǎn)生抑制抗腫瘤免疫的作用[3-5]，但AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平及其臨床意義尚未完全明確。本研究以85例AML患者和85例體檢健康者為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，旨在進(jìn)一步探討AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系，進(jìn)而為AML的臨床診治提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選取2019年3月至2021年3月于本院就診的85例AML患者作為AML組，另選取85例同期體檢健康者作為體檢健康組。AML組：年齡25～78歲，平均(60.17±2.21)歲；男46例，女39例。體檢健康組：年齡25～79歲，平均(60.25±2.36)歲；男45例，女40例。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。其中，AML患者根據(jù)染色體檢查情況可分為高危組(染色體高危核型，25例)和非高危組(非染色體高危核型，60例)。高危組：年齡26～77歲，平均(60.08±2.17)歲；男16例，女9例。非高危組：年齡25～78歲，平均(60.21±2.26)歲；男30例，女30例。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)AML及高危AML診斷符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國(guó)診療指南(2017年版)》[6]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)免疫學(xué)、形態(tài)學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)分型明確診斷者；(2)入組前未接受任何醫(yī)學(xué)治療，在本院全程接受治療，且臨床資料完整者；(3)無(wú)其他腫瘤、免疫性疾病等病史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)急性早幼粒細(xì)胞白血病者；(2)伴其他嚴(yán)重感染性、傳染性疾病者；(3)慢性骨髓增殖性疾病史者；(4)治療相關(guān)性AML者；(5)伴嚴(yán)重糖尿病、高血壓等內(nèi)分泌疾病及心、脾、肺、腎等器質(zhì)性疾病或器官病變者。

1.3方法

1.3.1治療方案 所有AML患者入組后均接受標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案治療，主要包括IA方案(去甲氧柔紅霉素+阿糖胞苷)、DA方案(柔紅霉素+阿糖胞苷)、MA方案(米托蒽醌+阿糖胞苷)、HA方案(高三尖杉酯堿+阿糖胞苷)，根據(jù)患者病情及自身耐受情況選擇合適的方法進(jìn)行治療，并于化療后骨髓抑制期接受輸注懸浮紅細(xì)胞、血小板及常規(guī)抗菌藥物等對(duì)癥支持治療。

1.3.2外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采集AML患者規(guī)律治療前及體檢健康者的清晨空腹靜脈血3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝處理后，取100 μL標(biāo)本置于流式檢測(cè)管，加入相應(yīng)熒光單克隆抗體(20 μL)充分混勻，避光孵育15 min(室溫)，加入紅細(xì)胞裂解液(2 mL)充分混勻，避光孵育10 min(室溫)，1 200×g離心5 min(4 ℃)，除去上清液，加入磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)振蕩混勻，洗滌2次，然后加入PBS(500 μL)混勻，采用FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)AML患者與體檢健康者、高危組與非高危組AML患者外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞比例，并計(jì)算CD4+/CD8+，所有試劑盒、溶液及儀器均由美國(guó)Becton Dickinson公司提供。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 通過(guò)本院電子病歷系統(tǒng)收集所有AML患者的基因陽(yáng)性突變情況,包括FMS樣酪氨酸激酶3-內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)基因(FLT3-ITD)、核仁磷酸蛋白基因1(NPM1)、分型[AML非特指型(AML-NOS)、AML伴重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常(AML-RGA)、AML伴髓系發(fā)育異常相關(guān)改變(AML-MRC)]等，并比較不同臨床病理特征下的外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平，標(biāo)本處理與外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)同1.3.2。

1.4.2不同療效組AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平檢測(cè) 根據(jù)《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細(xì)胞白血病)中國(guó)診療指南(2017年版)》[6]可將所有AML患者分為完全緩解(CR)組(55例)和未CR組(30例)，比較兩組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平，經(jīng)誘導(dǎo)化學(xué)治療后，于AML患者骨髓恢復(fù)期(化學(xué)治療28 d后)采集其血液標(biāo)本，標(biāo)本處理與外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)同1.3.2。

2 結(jié) 果

2.1AML組與體檢健康組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較 AML組外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均低于體檢健康組(P<0.05)，而兩組外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 AML組與體檢健康組外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

2.2高危組與非高危組AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較 高危組外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均低于非高危組(P<0.05)，而兩組外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 高危組與非高危組AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平表達(dá)水平比較

2.3AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 FLT3-ITD突變陽(yáng)性者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平高于FLT3-ITD突變陰性者(P<0.05)；NPM1突變陽(yáng)性者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平高于NPM1突變陰性者(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.4不同療效組AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較 CR組外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均高于未CR組(P<0.05)，而兩組外周血CD8+T淋巴細(xì)胞比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 不同療效組AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平比較

3 討 論

AML為起源于髓系造血干細(xì)胞的惡性疾病，近年來(lái)國(guó)內(nèi)AML發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，大多學(xué)者認(rèn)為其發(fā)生、發(fā)展可能與藥物、遺傳因素、化學(xué)毒物、放射、機(jī)體免疫功能異常等密切相關(guān)[7-9]，其中，機(jī)體免疫功能異常所致骨髓微環(huán)境改變對(duì)于AML的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用這一理論得到了廣泛認(rèn)可。隨著腫瘤免疫治療相關(guān)研究的不斷深入，越來(lái)越多的研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在抗腫瘤免疫效應(yīng)中，相較于體液免疫，細(xì)胞免疫發(fā)揮著更為重要的作用，T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中發(fā)揮著中心調(diào)控作用，對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的免疫異常實(shí)質(zhì)及臨床治療意義重大[10-11]。本研究通過(guò)分析AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系取得了較好的研究結(jié)果。

T淋巴細(xì)胞亞群屬于人胸腺中輸出細(xì)胞，可執(zhí)行細(xì)胞免疫功能及免疫調(diào)節(jié)功能，在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中，CD3+T淋巴細(xì)胞代表T淋巴細(xì)胞總數(shù)，其活性、數(shù)量與機(jī)體免疫應(yīng)答活性、免疫活性細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)；CD4+T淋巴細(xì)胞為反應(yīng)細(xì)胞，可增強(qiáng)或擴(kuò)大其他免疫細(xì)胞功能，一旦外周血CD4+T淋巴細(xì)胞減少，提示患者機(jī)體細(xì)胞免疫功能較低；CD8+T淋巴細(xì)胞則為T殺傷細(xì)胞，可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，同時(shí)調(diào)節(jié)性免疫抑制CD4+T淋巴細(xì)胞；CD4+/CD8+的穩(wěn)定比例是維持細(xì)胞免疫反應(yīng)平衡、抗腫瘤作用有效發(fā)揮的關(guān)鍵[12-13]。本研究結(jié)果顯示，AML組外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均低于體檢健康組，高危組外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均低于非高危組，進(jìn)一步說(shuō)明AML患者的機(jī)體免疫力呈抑制性優(yōu)勢(shì)，可見(jiàn)T淋巴細(xì)胞減少、功能不全及CD4+/CD8+比例失調(diào)，容易引起T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)體細(xì)胞免疫功能缺陷，且隨著病情進(jìn)展，高危AML患者免疫紊亂狀態(tài)更為嚴(yán)重。分析原因可能為：AML患者體內(nèi)白血病細(xì)胞可直接抑制T淋巴細(xì)胞分化抗原的表達(dá)，還可能產(chǎn)生許多免疫抑制因子，如白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1等，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞亞群分布，進(jìn)一步產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤發(fā)生免疫逃逸、抑制機(jī)體抗腫瘤免疫的作用，形成惡性循環(huán)，嚴(yán)重影響AML患者治療效果及預(yù)后[14]。黃方等[15]研究亦指出，AML患者機(jī)體存在免疫功能紊亂，可致外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平下降。

本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)LT3-ITD突變陽(yáng)性者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平高于FLT3-ITD突變陰性者，NPM1突變陽(yáng)性者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平高于NPM1突變陰性者，與李珊等[16]研究結(jié)果相一致。分析原因可能為FLT3-ITD突變可致非配體依賴性的FLT3受體自身磷酸化，使得酪氨酸激酶受體途徑異常活躍，容易引起細(xì)胞增殖、活化異常而影響免疫活性細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖及分化，使得CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平升高；NPM1蛋白在正常生理狀態(tài)下可參與脫氧核糖核酸聚合酶活性的調(diào)節(jié)、核糖體的轉(zhuǎn)運(yùn)、中心體的生物合成等，還可發(fā)揮腫瘤抑制作用，一旦出現(xiàn)NPM1突變則可能破壞正常血細(xì)胞的增殖、分化與凋亡，進(jìn)一步引起機(jī)體微環(huán)境的代謝紊亂，進(jìn)而影響T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，使得外周血CD4+T淋巴細(xì)胞水平升高，具體影響機(jī)制有待進(jìn)一步探討[17-19]。本研究還發(fā)現(xiàn)，CR組患者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+/CD8+均高于未CR組，提示臨床療效較好的AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平可見(jiàn)明顯升高，分析原因可能為：AML患者經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)方案進(jìn)行化學(xué)治療誘導(dǎo)緩解后，其體內(nèi)白血病細(xì)胞負(fù)荷明顯下降，有助于促進(jìn)T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平獲得部分恢復(fù)[20-23]。

綜上所述，AML患者隨著病情進(jìn)展，可致外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平降低而引起機(jī)體免疫功能失衡；而FLT3-ITD突變陽(yáng)性可致外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平升高，NPM1突變陽(yáng)性可致外周血CD4+T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平升高，且臨床療效較好的AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平可見(jiàn)明顯升高。臨床可通過(guò)密切監(jiān)測(cè)AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平以對(duì)其病情進(jìn)行評(píng)估，并為臨床治療方案、用藥強(qiáng)度等提供參考。本研究亦存在一定的不足，如樣本量較小、為單中心研究等，容易導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)一定的偏倚，臨床需進(jìn)一步進(jìn)行大樣本量、多中心的研究以明確AML患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平及其與臨床病理特征的關(guān)系。