基因芯片和高分辨率熔解曲線在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用分析

龍麗娟，張冬青，趙 嬌 綜述，王海濱 審校

解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科，北京 100048

結(jié)核病是人類尚未克服的難題，近年來(lái)，越來(lái)越多耐藥菌株的出現(xiàn)更加引起了人們對(duì)結(jié)核病的重視。目前結(jié)核分枝桿菌最常用的檢測(cè)方法為抗酸染色和羅氏培養(yǎng)法，這些方法雖然成本低廉，但靈敏度低，對(duì)結(jié)核病的診斷不夠及時(shí)、靈敏，不能滿足臨床對(duì)結(jié)核病診治的需求。傳統(tǒng)的PCR技術(shù)不能對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型和耐藥性檢測(cè)，后續(xù)仍需進(jìn)行復(fù)雜的生化實(shí)驗(yàn)。而基因芯片技術(shù)和高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術(shù)從基因的角度出發(fā)，在菌種鑒定和耐藥性檢測(cè)上都更直接地反映待測(cè)標(biāo)本的菌株信息，兩者因其檢測(cè)速度快、特異度高而引起了廣泛關(guān)注，本文就二者在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行對(duì)比分析。

1 基因芯片技術(shù)

1.1基因芯片概述 基因芯片技術(shù)是利用堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將結(jié)核分枝桿菌基因組中具有特異性的片段固定于固相載體上，片段的選擇一般為保守片段。針對(duì)不同的基因，人工合成不同的寡合苷酸片段作為靶基因，標(biāo)記有熒光分子待測(cè)標(biāo)本擴(kuò)增后的產(chǎn)物與基因芯片雜交，根據(jù)目的基因標(biāo)記的熒光數(shù)量不同，熒光掃描儀檢測(cè)到的熒光信號(hào)強(qiáng)度不同，即可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。基因芯片技術(shù)具有高特異度、高通量、高效率等特點(diǎn)[1]。

1.2基因芯片在結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定上的應(yīng)用 目前臨床常用的結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定的方法為分離培養(yǎng)后進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，該方法耗時(shí)長(zhǎng)、步驟繁瑣，不利于陽(yáng)性標(biāo)本的及時(shí)檢出以及及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥。而基因芯片技術(shù)因其高通量、高特異度的特點(diǎn)，能及時(shí)對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定、分型以及耐藥性檢測(cè)，對(duì)治療有著重要的指導(dǎo)作用。有研究表明，目前的基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)可以檢測(cè)17種結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)時(shí)間一般為6～8 h，可檢測(cè)的標(biāo)本類型包括痰液、膿液、引流液、尿液、胸腔積液、穿刺物等，這些標(biāo)本均不需要進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)[2]，可直接進(jìn)行檢測(cè)，但不同標(biāo)本的陽(yáng)性率有差異，其中以手術(shù)過(guò)程中的洗肉水檢出率最高，其次依次為穿刺液、膿液、組織、引流液、痰液等[3]，這就要求臨床需根據(jù)結(jié)核分枝桿菌不同的感染部位進(jìn)行標(biāo)本的取樣，如對(duì)無(wú)菌體液標(biāo)本的量有一定要求，一般為5～10 mL。有研究表明，目前基因芯片技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定成功率可以達(dá)到100%，對(duì)非結(jié)核分枝桿菌的鑒定成功率達(dá)95%，對(duì)結(jié)核分枝桿菌的快速鑒定有重要意義[4]。

1.3基因芯片在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用 目前臨床最常用的抗結(jié)核病藥物為利福平和異煙肼，基因芯片技術(shù)針對(duì)結(jié)核分枝桿菌對(duì)這兩種藥的耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，主要是利福平的耐藥基因rpoB和異煙肼的耐藥基因KatG和inhA[5-7]。以待測(cè)標(biāo)本分離出來(lái)的結(jié)核分枝桿菌為模板，以耐藥基因的保守序列設(shè)計(jì)引物及寡合苷酸探針，在引物的末端標(biāo)記有熒光分子，帶有熒光探針的擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的探針根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交，根據(jù)熒光信號(hào)的不同即可推斷檢測(cè)標(biāo)本的耐藥信息。有研究表明，絕大部分利福平的耐藥基因rpoB存在不同部位的突變，傳統(tǒng)檢測(cè)方法不能確定其突變位置，因此限制了其在臨床中的應(yīng)用[8]。而異煙肼的耐藥基因KatG均為特定位點(diǎn)的突變，因此從分子水平上更容易檢出，從而獲得耐藥株的耐藥信息，目前實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出的最常見(jiàn)的異煙肼耐藥基因?yàn)閗atG315和inhA-15[9]。但也有研究證實(shí)，由于異質(zhì)性耐藥菌的存在，基因芯片技術(shù)無(wú)法確定其是否存在katG突變，需要借助測(cè)序技術(shù)[10]。實(shí)驗(yàn)表明，目前的基因芯片技術(shù)可檢測(cè)出rpoB 6個(gè)位點(diǎn)的野生型和13個(gè)突變型，katG 1個(gè)位點(diǎn)的野生型以及inhA基因啟動(dòng)子區(qū)的野生型和突變型[9，11]。因此可以看出，基因芯片技術(shù)并不能檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌全部的耐藥基因型，所以它并不能完全替代傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)，但因其靈敏度和效率高，可作為傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)的一種補(bǔ)充手段，尤其是對(duì)利福平和異煙肼耐藥的菌株的檢測(cè)[12]。

1.4基因芯片在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的缺陷 實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)表明，基因芯片檢測(cè)出的耐藥信息與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)出的耐藥信息有一定的差異，部分菌株表現(xiàn)為藥敏試驗(yàn)?zāi)退幎蛐酒舾衃13]，導(dǎo)致這種差異的原因分析如下：(1)基因芯片技術(shù)檢測(cè)的位點(diǎn)有限，它主要針對(duì)的是保守片段，因此對(duì)于部分耐藥基因片段，因其缺少相應(yīng)的檢測(cè)位點(diǎn)而表現(xiàn)為敏感[14]。(2)因?yàn)閮煞N檢測(cè)方法檢測(cè)的菌株來(lái)源不同而造成差異，一般藥敏試驗(yàn)的對(duì)象為臨床分離培養(yǎng)后的純菌落，而基因芯片技術(shù)直接檢測(cè)標(biāo)本中的耐藥菌，因二者耐藥菌的濃度有差異而表現(xiàn)出不同的耐藥結(jié)果[15]。研究顯示，以藥敏試驗(yàn)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)于不同等級(jí)的涂片陽(yáng)性痰液來(lái)說(shuō)，基因芯片對(duì)≥2級(jí)抗酸桿菌(+)痰液標(biāo)本的敏感性優(yōu)于其他痰液標(biāo)本[11]，由此可推測(cè)，相較于直接檢測(cè)核酸擴(kuò)增陽(yáng)性的標(biāo)本，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌分離株的DNA更符合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果。但因其不需要經(jīng)過(guò)培養(yǎng)而直接進(jìn)行檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，由此可見(jiàn)基因芯片技術(shù)在臨床上有巨大的應(yīng)用價(jià)值。(3)部分基因位點(diǎn)的突變只是使其編碼的產(chǎn)物活性減低，而非完全喪失，如katG315發(fā)生突變后，仍然可以將異煙肼轉(zhuǎn)化為活性異煙酸，只是其編碼的過(guò)氧化氫或過(guò)氧化物酶的活性降低，因此部分轉(zhuǎn)化率降低不是很明顯的菌株在基因芯片檢測(cè)耐藥性中表現(xiàn)為敏感[16]。(4)一些無(wú)菌體液標(biāo)本或者含菌量較少的標(biāo)本在檢測(cè)中有可能會(huì)出現(xiàn)假性敏感的情況。

2 HRM

2.1HRM概述 HRM是近年來(lái)興起的研究單核苷酸多態(tài)性的一種手段，因其檢測(cè)原理不受檢測(cè)位點(diǎn)的局限以及其可實(shí)現(xiàn)閉管操作從而避免交叉污染而引起廣泛關(guān)注[17]。近年來(lái)因結(jié)核分枝桿菌分型基因和耐藥基因的不斷檢出，科學(xué)家們開(kāi)展了一系列利用HRM來(lái)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的研究。因每個(gè)核酸分子的CG含量、分布、核酸長(zhǎng)度均不相同，在升溫過(guò)程中，通過(guò)對(duì)飽和染料與PCR產(chǎn)物的結(jié)合程度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，而形成各自的溶解曲線[18]。如果發(fā)生了基因突變，那么對(duì)應(yīng)堿基會(huì)不匹配，結(jié)合力減弱，升溫時(shí)先裂解，溶解溫度變低，熒光染料從DNA分子上釋放，根據(jù)熒光強(qiáng)度和溫度曲線判斷是否存在突變，并且不同的峰型反映了不同的突變位點(diǎn)和突變形式。

2.2HRM在結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定中的應(yīng)用 相比于傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和化學(xué)反應(yīng)，HRM技術(shù)可以更快速地對(duì)結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定，同時(shí)受標(biāo)本中細(xì)菌量的多少和細(xì)菌的純度影響較小[19-21]，也避免了較為繁瑣的一系列菌種鑒定手段。理論上來(lái)說(shuō)，通過(guò)選取不同的靶基因合成不同的引物，可對(duì)臨床常見(jiàn)的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分型，并成功得到相應(yīng)的特征曲線，HRM和傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法的結(jié)果相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3HRM在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用 目前的HRM技術(shù)主要針對(duì)臨床上最常見(jiàn)的利福平[22]和異煙肼[23]進(jìn)行耐藥性檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，目前的HRM技術(shù)對(duì)于利福平的耐藥可檢測(cè)出12種突變形式，涉及7個(gè)基因位點(diǎn)；對(duì)于異煙肼的耐藥檢測(cè)出了katG基因的6種突變形式，inhA基因的啟動(dòng)子區(qū)域5種突變形式，ahpC基因的6種突變形式[23]。綜合目前的研究來(lái)看，HRM技術(shù)在耐藥性的檢測(cè)中特異度較高，接近100%，而靈敏度在85%以上，有待于進(jìn)一步提高。

2.4HRM技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)中的不足 目前開(kāi)展HRM技術(shù)的醫(yī)院較少，HRM技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)上缺少臨床數(shù)據(jù)的支持。HRM技術(shù)的靈敏度需要進(jìn)一步提高，一方面的原因是目前已知的耐藥基因還不夠全面，可能會(huì)造成耐藥基因的漏檢[24]；另一方面，目前的技術(shù)并不能確定具體是哪個(gè)非單核苷酸多態(tài)性引起的耐藥性[25]，這就要繼續(xù)探索相應(yīng)的突變基因和位點(diǎn)；同時(shí)目前的研究大多針對(duì)臨床常用的一些抗結(jié)核病藥物進(jìn)行檢測(cè)，如利福平和異煙肼，而對(duì)其他藥物的研究甚少，今后可以擴(kuò)大藥物的種類和檢測(cè)范圍。有研究顯示，86%的利福平耐藥株同時(shí)對(duì)異煙肼耐藥[26]，那么就存在ropB的同義突變，而HRM技術(shù)無(wú)法鑒別這種同義突變，數(shù)據(jù)分析時(shí)會(huì)出現(xiàn)多種曲線，具體結(jié)果還要進(jìn)一步進(jìn)行基因測(cè)序才能得出[27]。另外有研究證明，由于存在雜合耐藥菌株和不引起氨基酸改變的基因突變，會(huì)造成HRM檢測(cè)結(jié)果與藥敏試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不一致的情況[24]。

3 小 結(jié)

作為目前新興的兩項(xiàng)技術(shù)，基因芯片和HRM都具有高速、高特異度、高通量的特點(diǎn)，隨著研究的不斷深入，兩者在臨床中的應(yīng)用一定會(huì)越來(lái)越多，對(duì)臨床治療的指導(dǎo)作用也會(huì)越來(lái)越大。兩者的不足也有共通之處，即因目前研究水平的問(wèn)題，兩者都不能檢測(cè)出全部的突變類型，這也是因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，目前未能完全掌握其突變規(guī)律。相對(duì)于HRM技術(shù)來(lái)說(shuō)，基因芯片臨床上應(yīng)用更多，技術(shù)更加成熟，結(jié)果也更容易判讀，但因其需要專門的檢測(cè)設(shè)備，成本相對(duì)更高[28]。而目前HRM技術(shù)由于更多地應(yīng)用于科學(xué)研究，臨床數(shù)據(jù)相對(duì)缺乏，其靈敏度和特異度還有待于進(jìn)一步研究，但是它真正實(shí)現(xiàn)了閉管操作，很大程度上減少了污染。綜上所述，基因芯片技術(shù)和HRM技術(shù)雖然都有一些不足，但它們作為新型的檢測(cè)手段，在結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方面的發(fā)展前景較可觀，未來(lái)可以與實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)相結(jié)合，對(duì)標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行分型和定量分析，節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，將會(huì)對(duì)結(jié)核病的診治提供巨大的幫助。