如皋黃雞不同產蛋時期卵巢卵泡變化規律分析

丁悅 張金璧 周欣怡 梁多敏 陳寬鳳 張艷婧 謝永鋒 邱家寶 徐世永

摘要：為探索不同產蛋時期如皋黃雞卵巢卵泡變化規律，選取預產期（16周齡）、產蛋初期（20周齡）、產蛋高峰期（27周齡）、產蛋末期（64周齡）如皋黃雞蛋雞，對輸卵管、卵巢重量、等級前卵泡數進行統計，同時卵巢進行組織切片HE染色后對原始、初級、次級卵泡進行了觀察和測量統計，對不同階段卵泡的數量變化進行了比較分析。結果表明：隨產蛋時期的推進，卵巢、輸卵管重呈上升趨勢，4種等級前卵泡數量在產蛋高峰期達最高值;次級卵泡數量在預產期最高，不同直徑的次級卵泡數量在產蛋期進程中變化規律有所不同;此外，初級卵泡平均直徑在不同產蛋時期亦有差異。

關鍵詞：卵巢;等級前卵泡;次級卵泡;如皋黃雞;產蛋時期

中圖分類號：S 831文獻標志碼：A文章編號：0253-2301（2022）04-0028-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2022.04.005

Analysis on the Change Rules of Ovarian Follicles in Rugao Yellow Chickensat Different Laying Periods

DING Yue， ZHANG Jin-bi*， ZHOU Xin-yi， LIANG Duo-min， CHEN Kuan-feng，ZHANG Yan-jing， XIE Yong-feng， QIU Jia-bao， XU Shi-yong

（College of Animal Science and Food Engineering， Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210000， China）

Abstract： In order to explore the change rules of ovarian follicles in Rugao yellow chickens at different laying periods， by selecting the Rugao yellow chickens at the prelaying period （16 wk of age）， the early laying period （20 wk of age）， peak egg-laying period （27 wk of age）， and the telophase of laying （64 wk of age）， the statistics of the weight of oviduct， the ovarian weight， and the number of pre-hierarchical follicles were carried out. At the same time， theoriginal， primary and secondary follicles were observed and measured after the tissue section and HE staining of ovary， and the number changes of follicles at different stages were compared and analyzed. The results showed that the weight of ovary and fallopian tube showed an increasing trend with the development of laying period， and the number of four kinds of pre-hierarchical follicles reached the highest value at the peak egg-laying period. The number of the secondary follicles was the highest in the prelaying period， and the number of the secondary follicles with different diameters varied in the course of laying period. In addition， the average diameter of the primary follicle was also different at different laying periods.

Key words： Ovary; Pre-hierarchical follicles; Secondary follicle; Rugao yellow chicken; Laying period

如皋黃雞俗稱三黃雞，具有黃喙、黃羽、黃腳特征，是江蘇特色蛋肉兼用型雞種，以江蘇省如皋市及其周邊城市為主要產區，2013年進入全國農產品地理標志登記保護名錄。如皋黃雞不僅是我國重要的家禽種質資源，其產蛋量較高且體重小，具有作為優良蛋雞雜交親本的潛力[1]。家禽沒有發情周期和妊娠期，在一定的時間內連續排卵，產蛋期可分為預產期、產蛋前期、產蛋中期（即蛋高峰期）和產蛋后期。蛋雞的產蛋期長短直接關系到整個養殖場的經濟效益[2-3]，如皋黃雞與現代蛋雞品種類似，一般在20～21周齡開始產蛋;27～29周齡進入產蛋高峰期，大致可持續20周;54周齡后逐漸進入產蛋末期。

一般來說，家禽卵巢中卵泡的數量及發育狀況是其產蛋性能的主要決定因素，出雛時雞卵巢中的卵母細胞經過發育、選擇和閉鎖等機制建立起嚴格的等級體系[4]，分為原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和成熟卵泡，成熟卵泡又分為等級前卵泡與等級卵泡[5-6]。等級前卵泡可根據體積大小和卵泡內卵黃物質沉積情況分為小白卵泡（SWF）、大白卵泡（LWF）、小黃卵泡（SYF）和大黃卵泡（LYF），而大黃卵泡會通過選擇與優勢化形成等級卵泡，進入等級發育時期，按順序發育直至排卵[7]。理論上說，卵巢中卵泡的數量和質量是蛋雞產蛋的物質基礎，原始卵泡庫的庫存、初級卵泡和次級卵泡的儲備以及各級卵泡的閉鎖消耗的速率決定了家禽的生育年限[8]。因此，了解和完善各產蛋期的卵巢卵泡變化規律，有助于完善家禽產蛋生理機制，從而進一步開發家禽產蛋潛力[9]。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318

然而由于等級前卵泡肉眼難以直接觀察，針對等級前卵泡的觀察和統計較為少見[10]，且如皋黃雞產蛋各時期的卵巢卵泡變化未有報道。本研究針對預產期、產蛋初期、產蛋高峰期和產蛋末期的如皋黃雞，通過采樣統計和組織切片、HE染色法及顯微鏡觀察統計的方法，從大體和顯微角度比較了不同產蛋時期母雞生殖器官的大體變化和不同階段卵泡的數量變化，探討了不同產蛋時期的卵泡數變動規律，為蛋雞的生殖調控提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物如皋黃雞購自南京竹順生物公司，分批選取同等條件下飼養的預產期（16周齡）、產蛋初期（20周齡）、產蛋高峰期（27周齡）、產蛋末期（64周齡）如皋黃雞蛋雞各12只。

1.1.2主要試劑與儀器生物顯微鏡（CHC，OLYMPUS），輪轉式石蠟切片機（RM2128，Leica），4%多聚甲醛固定液、HE染色、PBS液等購自上海生工公司。

1.2試驗方法

1.2.1樣本采集頸部放血處死后采集輸卵管并稱重，測量輸卵管長度。取包括各級卵泡在內的整個卵巢組織，去等級卵泡后稱重，測量并記錄直徑≥1 mm的卵泡數。各級前卵泡按直徑大小依次劃分為大黃卵泡（直徑8～10 mm）、小黃卵泡（直徑5～7 mm）、大白卵泡（直徑2～5 mm）、小白卵泡（直徑1～2 mm）。卵巢去掉≥1 mm卵泡后，將剩余組織放入4%多聚甲醇固定液進行保存用于制作石蠟切片。

1.2.2卵巢組織切片的制作及觀察固定好的卵巢組織經過脫水、透明、浸蠟、包埋、按5 μm厚度進行蠟塊切片，切片方向采取與卵巢系膜平行方向，取最大切片進行HE染色以獲得更準確的卵泡計數[11]。

1.2.3卵巢組織切片的制作、觀察及卵泡計數將固定后的卵巢組織送至生物科技公司脫水，石蠟包埋組織，制作石蠟切片，HE染色。顯微鏡觀察每張玻片中不同階段的卵泡，評定標準為：原始卵泡卵母細胞周圍緊貼單層扁平狀顆粒細胞，排列不規則;初級卵泡卵母細胞周圍緊貼單層柱狀顆粒細胞，排列整齊;次級卵泡卵母細胞周圍的顆粒細胞變為多層且內有大量卵泡液[3]。同時對各級卵泡直徑進行測量，對初級和次級卵泡進行計數。

1.2.4統計分析使用GraphPad Prism 7（GraphPad Software Inc，San Diego，CA）進行統計分析。三組間差異采用one-way ANOVA，二組間比較采用非配對T檢驗。所有結果表示為平均值±標準誤（mean±SEM）。P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著。

2結果與分析

2.1不同產蛋時期卵巢及輸卵管的大體變化分析

由圖1可知，不同產蛋時期，如皋黃雞卵巢均重變化明顯，預產期、產蛋初期、產蛋高峰期和產蛋末期均重分別為（0.8±0.13）、（3.8±0.70）、（42.2±2.90）和（53.2±3.85）g，4個時期卵巢均重間差異顯著（P<0.05）。在輸卵管重方面，預產期、產蛋初期、產蛋高峰期和產蛋末期均重分別為（1.7±1.11）、（34.1±6.68）、（34.6±2.39）和（1.8±2.85）g，產蛋初期與高峰期差異不顯著（P>0.05），預產期和產蛋末期輸卵管均重顯著低于產蛋初期和顯著高于產蛋高峰期（P<0.05）。預產期、產蛋初期、產蛋高峰期和產蛋末期的輸卵管平均長度分別為（12.6±1.38）、（49.7±6.76）、（45.6±2.73）、（59.1±1.20）cm，其變化趨勢規律與輸卵管重量一致，預產期和產蛋末期輸卵管長度顯著低于產蛋初期和顯著高于和產蛋高峰期（P<0.05）。

2.2不同產蛋時期卵巢等級前卵泡數量變化分析

由圖2可知，大黃卵泡（BYF）在產蛋初期、產蛋高峰期、產蛋末期平均個數分別為（4.6±0.78）、（7.4±1.43）、（6.2±0.94）個，但差異未達到顯著水平（圖2A）。小黃卵泡（SYF）在這3個時期平均個數分別為（5.1±1.06）、（12.4±1.04）、（5.3±0.97）個，產蛋高峰期數量顯著高于其他2個時期（圖2B）。大白卵泡（BWF）在產蛋初期、產蛋高峰期、產蛋末期平均個數分別為（10.1±1.92）、（14.7±1.96）、（13.3±3.42）個（圖2C）。小白卵泡（SWF）在產蛋初期、產蛋末期平均個數分別為（27.6±3.42）、（42.1±6.88），產蛋高峰期數量過多難以準確統計（圖2D）。總之，產蛋高峰期4種等級前卵泡的數量均呈現最高值，其中大黃卵泡和小白卵泡的平均個數差異顯著，大黃卵泡和大白卵泡的平均個數在產蛋期未達到顯著水平。

2.3原始和初級卵泡的組織學特征分析

對卵泡組織進行切片和HE染色，對如皋黃雞卵巢中直徑小于1 mm的卵泡，即原始、初級和次級卵泡的形態和大小進行了顯微鏡觀察和統計。由圖3可知，原始卵泡中，卵母細胞外圍繞一層不規則、松散排列的扁平狀顆粒細胞（圖3A）;初級卵泡中，卵母細胞外圍繞一層規則、緊密排列的立方狀顆粒細胞（圖3B）;次級卵泡中，卵母細胞外圍繞兩層以上規則、緊密排列的扁平顆粒細胞（圖3C）。對不同產蛋時期初級卵泡的直徑統計顯示，初級卵泡平均直徑為（42.3±1.4）μm，而在不同產蛋時期，卵巢中可見的初級卵泡大小略有不同，預產期、產蛋初期、產蛋高峰期和產蛋末期分別為（45.27±2.39）、（50.46±1.05）、（30.03±1.53）和（40.30±1.35）μm，其中產蛋初期卵巢中的初級卵泡平均直徑最大，產蛋高峰期平均直徑最小，均與另外兩個時期差異顯著（圖4）。

2.4不同產蛋時期卵巢次級卵泡數量變化分析

為了解次級卵泡在不同產蛋時期的數量變化，選取每個卵巢與卵系膜平行的組織切片，對直徑在1 mm以下的次級卵泡進行了相對數量的統計。將次級卵泡直徑（圖5A～D）由大到小分為400～1000、200～400、100～200和50～100 μm 4個小組分別進行統計。由圖5可知，次級卵泡數量均在預產期較高，產蛋初期4個尺寸的次級卵泡數量均顯著下降。隨著產蛋期的推進，直徑400～1 000 μm的次級卵泡在產蛋高峰期數量最少，在產蛋末期有所上升;直徑200～400 μm的次級卵泡在整個產蛋周期變化不顯著;直徑100～200 μm組的次級卵泡在產蛋周期中逐漸增多，在產蛋末期數量最多;而直徑50～100 μm組的次級卵泡數量在產蛋周期中逐漸減少，在產蛋末期數量最低。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318

3討論與結論

雞輸卵管發生一般被分為3個階段，第1階段是1～8周齡的發育停滯期，第2階段是9～17周齡的緩慢發育期，第3階段是18～21周的快速發育期[12]，劉龍等[13]根據輸卵管黏膜上皮細胞的發育情況將第13周齡、16周齡、17周齡和20周齡進一步定義為細胞增殖前期、細胞增殖后期、細胞分化前期和產蛋期，并證明了幾個時期間具有差異性的基因表達譜。本研究進一步從大體水平探索了產蛋期的輸卵管變化，從外觀上看，輸卵管在產蛋周期內持續發育，其長度在產蛋初期到末期見變化顯著而增幅較小，但重量有較大幅度大增加，可見其發育主要體現在厚度，即輸卵管黏膜上皮的柱狀纖毛細胞和分泌細胞的增多上[14]。

不同產蛋時期的卵巢總重量（不含等級卵泡）隨產蛋時期明顯增加，從外觀上看卵泡系帶、卵巢間質結締組織均隨著產蛋期進展而增粗或增厚，對卵巢重量產生了一定影響[15]。此外，等級前卵泡的分離和統計顯示，小黃卵泡、小白卵泡數量在產蛋高峰期呈現出最高值（由于產蛋高峰期小白卵泡數量過多，難以進行準確統計，因此未提供數值），大黃、大白卵泡在初期和高峰期間有上升趨勢，但由于組內個體差異較大，沒有達到顯著差異。從趨勢上看，各時期等級前卵泡均在高峰期呈現最高值，可見等級前卵泡的數量與個體產蛋能力有直接的對應關系。

根據切片觀察顯示，原始、初級、次級卵泡組織學差異顯著，且原始、初級卵泡數量極多。本研究首次測量統計了不同產蛋期初級卵泡的直徑大小，并發現卵巢中的初級卵泡直徑隨產蛋時期略有變化，產蛋初期最高而高峰期最低，這一變化提示產蛋初期初級卵泡的儲備豐富，而高峰期大量初級卵泡進入次級階段發育或經歷了閉鎖[16-17]。此外，次級卵泡的總數量在預產期（16周、112日齡）最高，進入產蛋周期后顯著下降，這與海蘭褐雞生長發育過程（63、100、281、481日齡）中卵泡數量的研究中提出的，次級卵泡數在100日齡時達最高點一致[18]。值得注意的是，觀察測量顯示次級卵泡直徑變化跨度較大（50～1000 μm），因此首次對次級卵泡進行了分段統計。而結果提示不同大小的次級卵泡變化有所差異，尤其直徑100～200 μm的次級卵泡，在不同產蛋時期變化規律與其他直徑的次級卵泡截然不同。

綜上，本研究從大體和組織學角度比較了預產期、產蛋初期、產蛋高峰期和產蛋末期如皋黃雞卵巢及卵泡數量變化，尤其對次級卵泡變化規律進行了探討，為卵泡發育規律和機制研究及產蛋性能改善研究提供了參考。

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收稿日期：2022-03-20

作者簡介：丁悅，女，2001年生，本科在讀，主要從事畜牧學方面研究。

*通信作者：張金璧，女，1985年生，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究（E-mail：zhangjinbi@jit.edu.cn）。

基金項目：江蘇省高等學校大學生創新創業訓練計劃（202113573016Z）;金陵科技學院“科教融合項目”（2021KJRH33）。D765F16B-4BFE-414D-9135-AE9A51FC7318