山豆根抗鼻咽癌活性成分的篩選

南俊伶 王超眾 閆廣利 吳芳芳 宋志軍 王碩 周小雷 繆劍華 王喜軍

關(guān)鍵詞山豆根;鼻咽癌;活性成分;越南槐醇;山豆根素;高麗槐素

山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep.的干燥根和根莖，又名廣豆根，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，可用于治療火毒蘊(yùn)結(jié)、乳蛾喉痹、咽喉腫痛、齒齦腫痛、口舌生瘡[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山豆根具有抗腫瘤、抗病毒及增強(qiáng)免疫等藥理作用[2-3]。鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽黏膜被覆上皮及小涎腺的惡性腫瘤，是我國(guó)南方地區(qū)的高發(fā)性疾病[4]。目前臨床治療鼻咽癌的常用方法是放療、化療等，但均具有副作用，因此，亟待開發(fā)治療鼻咽癌的有效新藥。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，山豆根氯仿提取物對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用[5]。基于此，本研究以山豆根為研究對(duì)象，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對(duì)接技術(shù)及細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)，篩選山豆根抗鼻咽癌的活性成分，以期為抗鼻咽癌新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有MCV-170AICL-PC 型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Panasonic 公司）、BSC-1100-L ⅡA2 型生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）、Ⅸ71 型顯微鏡（日本Olympus 公司）、XSE105 型分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）、FlexA-200 型酶標(biāo)儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

槲皮素對(duì)照品（批號(hào)201008，純度>98%）購(gòu)于四川省維克奇生物科技有限公司;高麗槐素、染料木素對(duì)照品（批號(hào)分別為RFS-M03003005008、RFS-R00111812016，純度均大于98%）購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司;山豆根素對(duì)照品（批號(hào)21S059-A2，純度95.8%）購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司;越南槐醇單體（純度>98%）為實(shí)驗(yàn)室自制;注射用順鉑（批號(hào)H20023460）購(gòu)于齊魯制藥有限公司;RPMI-1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司;青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人鼻咽癌細(xì)胞株CNE-1 購(gòu)于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司（批號(hào)20210426）。

2 方法與結(jié)果

2.1 山豆根抗鼻咽癌潛在活性成分的篩選

檢索文獻(xiàn)[6-12]，選擇山豆根的主要化學(xué)成分（見表1），然后在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到上述主要化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的SMILES號(hào)，再將SMILES 號(hào)導(dǎo)入Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中進(jìn)行靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)。借助GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以“nasopharynx carcinoma（鼻咽癌）”為關(guān)鍵詞獲取與鼻咽癌相關(guān)的靶點(diǎn)。將上述化學(xué)成分的靶點(diǎn)與鼻咽癌相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到山豆根抗鼻咽癌的作用靶點(diǎn)及化學(xué)成分，再將兩者導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件中，構(gòu)建山豆根抗鼻咽癌化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。將山豆根抗鼻咽癌的作用靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）中構(gòu)建蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，再借助Cytoscape 3.6.1 軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析[13]。結(jié)果顯示，從山豆根主要化學(xué)成分中共篩選到189 個(gè)靶點(diǎn)，鼻咽癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)共1 028 個(gè);兩者取交集后發(fā)現(xiàn)，山豆根抗鼻咽癌的靶點(diǎn)共65 個(gè)。構(gòu)建的山豆根抗鼻咽癌化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖1，山豆根抗鼻咽癌的PPI 網(wǎng)絡(luò)見圖2。

對(duì)山豆根抗鼻咽癌化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的平均Degree 值為3.5，網(wǎng)絡(luò)中大于平均Degree值的化學(xué)成分分別為越南槐醇、槲皮素、山豆根素、苦參酮、染料木素、山豆根色烯素、高麗槐素。由此推測(cè)，這幾種成分可能是山豆根抗鼻咽癌的潛在活性成分。

由圖2 可知，圖中Degree 值排名前10 位的靶點(diǎn)分別是SRC、PIK3CA、MAPK1、MAPK3、AKT1、MAPK8、MAP2K1、PTK2、EGFR、JAK3。由此推測(cè)，這些靶點(diǎn)可能是山豆根抗鼻咽癌的核心靶點(diǎn)。

2.2 山豆根抗鼻咽癌核心靶點(diǎn)與潛在活性成分的分子對(duì)接測(cè)試

采用半柔性對(duì)接方式，將“2.1”項(xiàng)下篩選的山豆根抗鼻咽癌核心靶點(diǎn)與潛在活性成分進(jìn)行分子對(duì)接測(cè)試，并計(jì)算活性成分與核心靶點(diǎn)間的結(jié)合能，評(píng)估其結(jié)合活性，結(jié)果見表2（表中，1 kcal=4.184 kJ）。在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載山豆根活性成分的3D結(jié)構(gòu)，在PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，并對(duì)活性成分進(jìn)行去除水分子以及加氫處理，借助Dockthor 平臺(tái)（https：//dockthor.lncc.br/v2/）進(jìn)行在線分子對(duì)接，采用Pymol 軟件將結(jié)合能力較好的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖3。

一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)，發(fā)生作用的可能性越大;并且當(dāng)結(jié)合能<-7.0 kcal/mol 時(shí)，兩者具有較好的結(jié)合活性，且結(jié)合能越低，對(duì)接效果越好[14]。由表1 可知，山豆根核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的潛在活性成分的結(jié)合能均低于-7.0 kcal/mol，表明這些成分均具有一定的抗鼻咽癌活性。

2.3 山豆根潛在活性成分對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖活性的影響

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將人鼻咽癌CNE-1 細(xì)胞復(fù)蘇，接種于培養(yǎng)瓶中，使用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔夜換液，并觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[15]方法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成密度為2×104 mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中，每孔接種100 μL。實(shí)驗(yàn)分為順鉑組（陽(yáng)性對(duì)照）、高麗槐素組、越南槐醇組、槲皮素組、山豆根素組，各組給藥濃度均為100 μmol/L（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）。另設(shè)不加藥物只加細(xì)胞的空白組、不加細(xì)胞和藥物的調(diào)零組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁后，加入相應(yīng)藥物，每孔100 μL;繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，分別向每孔加入5mg/mL MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h 后，棄去上清液;每孔加入150 μL 二甲基亞砜，采用酶標(biāo)儀于510 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值（A），并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=[1-（A 實(shí)驗(yàn)組-A 調(diào)零組）/（A 空白組-A 調(diào)零組）]×100%。

結(jié)果顯示，給藥24 h 時(shí)，順鉑、越南槐醇及山豆根素對(duì)人鼻咽癌CNE-1 細(xì)胞的抑制效果較好，細(xì)胞增殖抑制率均大于80%，而高麗槐素、槲皮素的抑制作用相對(duì)較弱。給藥48、72 h 時(shí)，山豆根各活性成分的抑制作用均有所提高，且抑制作用由大到小依次為越南槐醇>山豆根素>高麗槐素>槲皮素。結(jié)果見表3。

3 討論

鼻咽癌的新發(fā)病例大部分來(lái)自東亞和東南亞地區(qū)，其中我國(guó)新發(fā)鼻咽癌病例占全世界的47.7%，主要分布在廣東、廣西、湖南、福建等省份[16]。山豆根主產(chǎn)于廣西、廣東、四川、貴州等地[17]，對(duì)鼻咽癌具有一定的抑制作用，因此，篩選山豆根抗鼻咽癌的活性成分具有重要意義。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法、分子對(duì)接技術(shù)，篩選出山豆根抗鼻咽癌的活性成分有越南槐醇、槲皮素、山豆根素、苦參酮、山豆根色烯素、染料木素、高麗槐素等;進(jìn)一步考察其中結(jié)合能較低的越南槐醇、山豆根素、槲皮素、高麗槐素對(duì)人鼻咽癌CNE-1 細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示，越南槐醇、山豆根素的體外抑制作用較強(qiáng)，接近陽(yáng)性對(duì)照藥順鉑。

黃樂等[6]采用一測(cè)多評(píng)法對(duì)廣西7 個(gè)產(chǎn)地的山豆根成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山豆根中越南槐醇含量為0.08%～0.29%;韓國(guó)研究者制備了山豆根提取物，并測(cè)得其中三葉豆紫檀苷含量為4.76%、山豆根素含量為3.17%、高麗槐素含量為1.84%[7];He等[8]對(duì)來(lái)自廣西、廣東、貴州、湖南、四川的17 批山豆根的黃酮類成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果顯示，山豆根中槲皮素含量為0.02%～0.06%。由此可知，本研究預(yù)測(cè)的幾種潛在活性成分除槲皮素外，均在山豆根中含量較高。越南槐醇、山豆根素、高麗槐素在山豆根抗鼻咽癌化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中的Degree 值均大于3.5，且與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能較低;進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，這3 種成分對(duì)人鼻咽癌CNE-1 細(xì)胞具有較好的抑制作用。由此推測(cè)，越南槐醇、山豆根素、高麗槐素可能是山豆根抗鼻咽癌的主要活性成分。槲皮素在山豆根中含量較低，且對(duì)人鼻咽癌CNE-1 細(xì)胞的抑制較弱，可能不是山豆根抗鼻咽癌的主要活性成分。2-（2，4-二羥基苯基）-5，6-亞甲二氧基苯并呋喃在山豆根抗鼻咽癌化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中僅關(guān)聯(lián)4 個(gè)靶點(diǎn)，而且與核心靶點(diǎn)無(wú)關(guān)聯(lián)，也可能不是山豆根抗鼻咽癌的主要活性成分。三葉豆紫檀苷在山豆根中含量較高，且有研究報(bào)道，三葉豆紫檀苷可在大鼠體內(nèi)代謝為高麗槐素[18]，由此推測(cè)，三葉豆紫檀苷可能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為高麗槐素，進(jìn)而發(fā)揮抗鼻咽癌作用。

綜上所述，本研究初步確定越南槐醇、山豆根素、高麗槐素為山豆根抗鼻咽癌的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可為治療鼻咽癌的新藥開發(fā)提供參考。