基于SG2快速分離膠搭建法醫遺傳分析快檢平臺

李英 俞麗娟 豐華 李澤倫 公安部第一研究所

引言

DNA 檢測技術有“新一代證據之王”的美譽。在刑偵案件偵破中，該技術有著廣泛的運用。隨著DNA檢測技術的不斷發展和革新，提高DNA檢測準確率的同時，也不斷推出了快速DNA檢測方案，如國外推出的RapidHIT 200和ANDE 6C DNA快速檢測平臺，兩款平臺都是基于微流控芯片和毛細管電泳檢測技術，集DNA 提取、擴增、電泳和分析四大功能于一體，實現樣品快速自動化檢測，降低污染風險且大幅縮短了檢驗時間，可應用于重大案件現場的快速排查[1]。但上述兩款快檢平臺雖然能夠大幅度縮短DNA檢測時間，但在檢測通量、檢測精度、試劑的適用性、數據的可靠性、耗材的昂貴性等方面仍與傳統的毛細管電泳遺傳分析儀存在很大差距，限制了在國內法醫DNA領域的廣泛應用。

國外的DNA快檢設備或傳統的毛細管電泳遺傳分析儀，都是基于凝膠的分子篩效應，在高壓電場作用下將長度不同的DNA片段得到有效的分離。如果為了縮短電泳時間，可以施加更高的電壓，但會帶來電泳通道溫度過高等不利影響。因此，本文通過自主研制的SG2快速分離膠和GA118-24B遺傳分析儀、SureID S6人類DNA身份鑒定試劑盒搭建法醫DNA快檢平臺，可大幅度縮短傳統毛細管電泳遺傳分析儀的檢測時間，為DNA實驗室實現快速檢測提供了解決方案。

一、基于SG2快速分離膠搭建法醫DNA快檢平臺

（一）系統組成

法醫DNA快檢平臺由GA118-24B遺傳分析儀，SG2快速分離膠、SureID S6人類DNA身份鑒定試劑盒構成，其余緩沖液、甲酰胺、毛細管等均為GA118-24B遺傳分析儀的配套試劑耗材。

凝膠作為毛細管電泳分離基質，電泳過程中動態涂覆于毛細管內壁上，有效控制電滲流的同時，其分子篩效應可對DNA片段進行有效分離。SG2快速分離膠由N-二甲基丙烯酰胺（PDMA）和緩沖液（尿素、TAPS緩沖液等）組成，高分子聚合物PDMA作為篩分介質，其分子量大小影響毛細管電泳的分離效率和片段讀長，分子量越高分離效果越好，有利于大片段DNA的分離，反之則有利于小片段DNA的分離[2]。SG2快速分離膠通過合理控制PDMA分子量大小，在保證大片段高分辨率的同時盡可能的提升DNA片段的遷移速度[3]，大幅度提高了DNA電泳檢測速度、縮短DNA電泳時間。

SureID S6是國內第一款固體擴增試劑，采用六色熒光技術，復合擴增23個基因座，包含21個常染色體基因座，1個性別標記基因座Amelogenin及1個Y染色體基因座DYS391，最大片段不超過400bp，滿足法庭科學現場檢材檢驗需求，操作簡單，性能強大，鑒于其含有15個小于250bp的基因座，可提高降解DNA模板中數據信息的獲取，擴增時間不超過90分鐘，在實際案件中應用效果良好，本文搭建的DNA快檢平臺選用該試劑盒作為擴增試劑。

GA118-24B遺傳分析儀是一所自主研制的新一代全自動多通道基因操作平臺。在傳統毛細管電泳儀基礎上，實現了業內首創八色以上熒光檢測技術，國內首臺可同時檢測24個樣品的高通量平臺，設備所有零部件全部實現國產化，極大地降低了設備的使用成本。

（二）電泳參數

毛細管電泳遺傳分析儀的檢測時間主要分為三部分：恒溫箱升溫時間、電泳數據采集時間和其他部件運行時間，恒溫箱需要從室溫升至60℃以保證凝膠的最佳分辨率和數據重現性，數據采集時間用來采集電泳時所有DNA片段經過檢測窗口的熒光信息。GA118-24B的整個電泳過程需要約40分鐘，其中數據采集時間為1500s，占整個檢測時間的60%以上，DNA快檢平臺由于采用了SG2快速分離膠和SureID S6擴增試劑盒，利用SG2能夠大幅度提升DNA片段電泳速度和SureID S6最大片段不超過400bp的優勢，能夠大幅度縮短電泳時間，數據采集時間可以減少到800s，保證所有小于500bp的DNA片段熒光信息在這個時間內都能夠被采集到[4]，DNA快檢平臺在GA118-24B上建立的運行模型參數如圖1所示。

二、實驗測試結果

（一）電泳時間

按DNA快檢平臺電泳參數設置，將96個樣本（含ladder、內標及9948陽性對照）在GA118-24B上進行連續電泳，采用GeneMapperTMID-X分析軟件對數據進行分析，每個樣本中的最大長度內標500bp片段出峰時間在600-700s內，如圖2所示為一組24個樣本的500bp片段出峰時間，數據采集時間減少到800s完全可以滿足SureID S6試劑盒的檢測要求。

（二）分型準確性

對上述測試的96個樣本中的5個基因分型對照物ladder 和10個9948陽性對照樣本進行分析，5個Ladder中的23個基因座、10個9948陽性對照樣本均分型準確，結果與試劑盒說明書中的給定結果完全一致，如圖3、圖4所示。

（三）分辨率

對5個Ladder中D1S1656基因座的4個等位基因15.3、16、16.3、17兩組相差1bp的DNA片段進行分析，均能夠被正確分辨識別，如圖5所示，兩個相差1bp的等位基因峰高3000rfu，分離點峰高為1600rfu，能夠被軟件正確識別。

（四）重復性

隨機選取5個9948陽性對照樣本，對D8S1179的等位基因12、13進行分析，如圖6所示，5個樣本的片段長度誤差均小于0.5bp，分型準確，峰形尖銳，峰高均衡，具有高度的重復性和一致性。

三、討論

（一）基于SG2快速分離膠的法醫遺傳分析快檢平臺的適應性

在SG2快速分離膠DNA快檢平臺通過SureID S6試劑盒的驗證后，利用該平臺對目前國內外主流擴增試劑進行了初步測試，測試試劑盒包括：公安部物證鑒定中心的Typer19，閱微基因的M28A，華大基因的炎黃34、YDB，AB公司的ID Plus、VFP，Promega公司的PP21等7個試劑盒，均順利通過平臺測試，大幅度減少電泳時間10分鐘以上，測試結果見圖7～13。

（二）大幅度縮短DNA檢測時間、提高DNA檢測效率

采用上述DNA快檢平臺，第一次電泳時需要的時間包括恒溫箱升溫時間15分鐘，數據采集時間13分鐘，其他部件運行時間2分鐘，合計檢測時間30分鐘，連續檢測時恒溫箱已處于60℃不需要升溫，每次電泳檢測時間僅需15分鐘，檢測通量可達到72個樣本/小時，日檢測2304個樣本，可大幅度提高DNA實驗室的檢測能力。

（三）儀器、試劑、耗材的全面配套

SG2快速分離膠與GA118-24B遺傳分析儀和SureID X S6試劑盒搭建的法醫DNA快檢平臺，在數據采集時間上比傳統凝膠電泳節約10分鐘以上。SG2快速分離膠也可用于GA118系列其他檢測平臺，對國內外其他主流擴增試劑進行檢測，同時電泳檢測所采用的毛細管陣列、緩沖液、甲酰胺等試劑耗材也實現了全面配套。