基于UPLC-Q-TOF/MS的大鼠體內茵芋苷代謝特征分析

肖起明，余茜茜，俞鑫偉，葉曉霞

溫州醫科大學藥學院，浙江 溫州 325035

茵芋苷（skimmin），別名香豆素-7-O-β-D-葡萄糖苷，分子式為C15H16O8，是從虎耳草科植物圓錐繡球莖部中提取的主要化學成分[1]。研究表明茵芋苷具有廣泛的藥理活性，包括腎臟保護[2-3]、鎮痛[4]、抗炎[5]和抗阿米巴痢疾[6]等作用。然而，茵芋苷也可能對機體產生不良反應，ESKANDANI等[7]報道了茵芋苷的細胞毒性。同時，已有相關研究分析了茵芋苷的藥代動力學特征，揭示了茵芋苷在體內的吸收分布和消除過程[8]，但至今鮮有研究報道茵芋苷在體內的代謝特征。超高效液相色譜-四級桿串聯飛行時間質譜法（ultraperformanceliquidchromatography-quadrupole-timeofflight/massspectrometry, UPLC-Q-TOF/MS）是近年來較為常用的運用于代謝研究的技術[9-10]，本研究旨在采用UPLC-Q-TOF/MS法，分析大鼠灌胃及舌下靜脈注射茵芋苷后的代謝產物，探究茵芋苷藥效物質及其在體內的代謝特征，并為其進一步藥理學研究和安全性評價提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 動物：健康Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠24只，體質量（220±20）g，購自溫州醫科大學實驗動物中心，飼養于溫州醫科大學動物實驗中心，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2009-0129。

1.1.2 儀器：AcquityUltra超高效液相色譜系統及SynaptQ-TOF質譜儀購自美國Waters公司，配有電噴霧電離源（ESI）。MasslynxV4.1（數據處理軟件）、MetaboLynx及MassFragmentTM數據處理系統（數據分析軟件）。移液槍購自德國Eppendorf公司；SartoriusBS224S電子天平購自北京賽多利斯科學儀器有限公司；Allegra64R離心機購自美國BeckmanCoulter公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器購自昆山超聲儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器購自海門其林貝爾儀器制造有限公司。

1.1.3 試劑：茵芋苷（C15H16O，純度≥98%，批號：MUST-18050905）購自成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇為HPLC純試劑，購自美國Merck公司；甲酸為HPLC純試劑，購自美國ACS公司；乙腈為HPLC純試劑，購自美國Merck公司；超純水取自Milli-Q超純水儀（美國Merck公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集：取雄性SD大鼠24只，隨機分成8組，分別為灌胃給藥方式的血漿、尿液、膽汁、糞便組以及靜脈給藥方式的血漿、尿液、膽汁、糞便組。灌胃給藥組大鼠以50mg·kg-1劑量灌胃給予茵芋苷溶液（以0.1%CMC-Na為溶媒），靜脈注射給藥組大鼠以5mg·kg-1劑量舌下靜脈注射給予茵芋苷溶液（以含5%DMSO的0.9%氯化鈉溶液為溶媒）[8]。給藥前分別收集血漿、尿液、膽汁、糞便的空白樣品，給藥后分別收集0～4h、4～8h、8～12h、12～24h、24～36h、36～48h時間段的膽汁樣品，0～12h、12～24h、24～36h、36～48h時間段的尿液和糞便樣品，5min、15min、30min、45min、1h、3h、5h、8h、12h、24h、36h、48h時間點的血漿樣品，所有血樣采集后均以4500r/min離心10min，所有樣品分析前置于-80℃保存[11]。

1.2.2 樣品制備：采用蛋白質沉淀法預處理樣品。在2mL血漿、1mL尿液和1mL膽汁中分別加入10mL甲醇，渦旋混合5min，4500r/min離心10min。稱取100mg糞便樣品，用100μL0.9%氯化鈉溶液和900μL甲醇提取，渦旋混合5min并4500r/min離心10min后，再超聲處理10min。將上清液置于30℃的氮氣流下蒸發至干燥。將殘余物復溶于100μL甲醇中，再次渦旋5min，13000r/min離心10min。將5μL上清液注入UPLC-Q-TOF/MS系統進行分析[8，11-12]。

1.2.3 色譜條件：使用ACQUITYUPLCHSST3柱（1.8μm，2.1×100mm）進行分離；流動相為含0.1%甲酸的超純水（溶劑A）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（溶劑B），梯度洗脫，0～2min，95%A；2～10min，95%～80%A；10～13min，80%～70%A；13～22min，70%～15%A；22～25min，15%A；25～25.5min，15%～95%A；25.5～30min，95%A[11]。每次進樣前以流動相初始條件預平衡6min；流速：0.2mL/min；柱溫：40℃；進樣量：5μL。

1.2.4 質譜條件：通過正模式的電噴霧離子源（electronsprayionization, ESI）進行實驗。為了確保質譜的準確性和重現性，使用亮氨酸腦啡肽（m/z554.2615）進行實時校正。質譜參數設定如下：毛細管電壓，2.5kV；離子源溫度，100℃；錐孔電壓，40V；錐孔氣流速，50L/h；去溶劑化氣流速，800L/h。掃描范圍為m/s100～1200，分辨率30000，掃描時間0.2s[8，11-12]。

1.2.5 數據處理：使用MassLynx4.1 軟件處理UPLC-Q-TOF/MS的數據。將原始數據導入MassLynx4.1版軟件中鑒定茵芋苷代謝物。代謝物的鑒定過程包括自動預測和人工驗證兩部分。首先使用實驗室內部設計的Matlab程序進行自動預測，在該程序中輸入茵芋苷及其代謝產物的化學式，并將電離設置為[M+H]+和[M-H]-，獲得高分辨率質譜數據（highresolutionmassspectrometry, HRMS）。然后，基于71種典型的代謝反應預測茵芋苷的代謝物。人工驗證是通過提取離子色譜圖來篩選質量偏差＜5ppm的預測代謝物。此外，提取MS2片段離子數據進行預測代謝物的結構確認。鑒于茵芋苷在體內的主要代謝產物是7-羥基香豆素[13]，同時以7-羥基香豆素為模板，預測7-羥基香豆素的可能代謝物。

2 結果

2.1 茵芋苷的代謝產物 使用UPLC-Q-TOF/MS方法對血漿、膽汁、尿液和糞便樣品進行分析，共發現了10種代謝產物，見表1。m/z為P（325.0922）、M1（297.0979）、M2（323.0765）、M3（307.0816）、M4（163.0395）、M5（165.0552）、M6（339.0716）、M7（177.0552）、M8（242.9963）、M9（193.0501）、M10（147.0446），其中，M1、M2、M3、M4為原型直接代謝，M5、M6、M7、M8、M9、M10為7-羥基香豆素的代謝產物，代謝產物見圖1。

2.2 茵芋苷及其代謝產物的結構鑒定 茵芋苷的原型在保留時間為8.84min時檢測到色譜峰，在正離子模式下準分子離子為m/z325.0922（C15H16O8）。高碰撞能量下主要產生m/z289、237、163、118，其中，m/z289是從m/z325中丟失兩分子OH，m/z273是從m/z325中丟失C3H8O3，m/z163是從m/z325中丟失糖基（C6H12O5），m/z118是從m/z163中丟失一分子OH與一分子CO。原型產生碎片離子的機制見圖2A。

M1：M1 在正離子模式下準分子離子為m/z297.0970（C14H16O7），在保留時間為13.12min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原型低28，其分子式組成比原型少了CO，推測是茵芋苷分子失去羰基的結果，高碰撞能量下主要產生m/z279、232、164的特征碎片離子，其中m/z279是從m/z297丟失一分子H2O，m/z232是從m/z279丟失CH3O2，m/z164是m/z297丟失7-羥基香豆素（C9H6O3），M1產生碎片離子的機制見圖2B。

M2：M2 在正離子模式下準分子離子為m/z323.0748（C15H14O8），在保留時間為12.20min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原型低2，其分子式組成比原型少了2個H，推測是茵芋苷分子去飽和的結果，高碰撞能量下主要產生m/z263、194、120的特征碎片離子，其中m/z263是從m/z323丟失CO3，m/z194是從m/z263丟失C4H2O，m/z120是m/z323丟失C7H6O7，M2產生碎片離子的機制見圖2C。

表1 茵芋苷（P）及其代謝物（M1-M10）的質譜數據

圖1 茵芋苷在大鼠體內的代謝途徑

M3：M3 在正離子模式下準分子離子為m/z307.0816（C15H14O7），在保留時間為12.92min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原型低18，其分子式組成比原型少了H2O，推測是茵芋苷分子脫水的結果，高碰撞能量下主要產生m/z276、248、163的特征碎片離子，其中m/z276是從m/z307丟失C2H2O2，m/z232是從m/z307丟失C2H2O3，m/z163是m/z307丟失7-羥基香豆素（C9H6O3），M3產生碎片離子的機制見圖2D。

M4：M4 在正離子模式下準分子離子為m/z163.0395（C9H6O3），在保留時間為20.27min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原型低162，其分子式組成比原型少了C6H10O5，推測是茵芋苷分子水解為苷元的結果，高碰撞能量下主要產生m/z147、135、118的特征碎片離子，其中m/z147是從m/z163丟失一個O，m/z135是從m/z163丟失CO，m/z118是m/z135丟失一分子OH，M4產生碎片離子的機制見圖2E。

M5：M5 在正離子模式下準分子離子為m/z165.0552（C9H8O3），在保留時間為20.56min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比7-羥基香豆素分子高2，其分子式組成比7-羥基香豆素分子多了H2，推測是7-羥基香豆素分子還原的結果，高碰撞能量下主要產生m/z149、137、120的特征碎片離子，其中m/z149是從m/z163丟失一個O，m/z137是從m/z163丟失CO，m/z120是m/z137丟失一分子OH，M5產生碎片離子的機制見圖3A。

M6：M6 在正離子模式下準分子離子為m/z339.0716（C15H14O9），在保留時間為9.41min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原7-羥基香豆素分子高176，其分子式組成比原型多了C6H8O6，推測是7-羥基香豆素分子與葡萄糖苷酸結合的結果，高碰撞能量下主要產生m/z180、163、118的特征碎片離子，其中m/z180是從m/z339丟失C9H6O3，m/z163是從m/z339丟失C6H8O6，m/z118是m/z163丟失一分子CHO2，M6產生碎片離子的機制見圖3B。

M7：M7 在正離子模式下準分子離子為m/z177.5522（C10H8O3），在保留時間為10.28min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原7-羥基香豆素分子高14，其分子式組成比原型多了CH2，推測是7-羥基香豆素分子甲基化的結果，高碰撞能量下主要產生m/z163、161、118的特征碎片離子，其中m/z163是從m/z177丟失CH2，m/z161是從m/z177 丟失一個O，m/z118 是m/z163 丟失一分子CHO2，M7產生碎片離子的機制見圖3C。

M8：M8 在正離子模式下準分子離子為m/z242.9963（C9H6O6S），在保留時間為10.16min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原7-羥基香豆素分子高79，其分子式組成比原型多了SO3，推測是7-羥基香豆素分子磺化的結果，高碰撞能量下主要產生m/z198、182、118的特征碎片離子，其中m/z198是從m/z242丟失CO2，m/z198是從m/z182丟失一個O，m/z118是m/z182丟失一分子SO2，M8產生碎片離子的機制見圖3D。

M9：M9 在正離子模式下準分子離子為m/z193.0501（C10H8O4），在保留時間為15.65min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原7-羥基香豆素分子高30，其分子式組成比原型多了CH2O，推測是7-羥基香豆素分子甲基化和羥基化的結果，高碰撞能量下主要產生m/z179、162、133、118的特征碎片離子，其中m/z179是從m/z193丟失CH2，m/z162是從m/z179丟失一個O，m/z133是m/z182丟失一分子CO3，m/z118是m/z113丟失一分子CH3，M9產生碎片離子的機制見圖3E。

M10：M10在正離子模式下準分子離子為m/z147（C9H6O2），在保留時間為3.47min時檢測到色譜峰，根據精確相對分子質量，比原7-羥基香豆素分子低16，其分子式組成比原型少了一個O，推測是7-羥基香豆素分子脫羥基的結果，高碰撞能量下主要產生m/z131、120、108的特征碎片離子，其中m/z131是從m/z147丟失一個O，m/z120是從m/z147丟CO，m/z108是m/z120丟失一個C，M10產生碎片離子的機制見圖3F。

2.3 茵芋苷在大鼠體內的代謝分析 經過UPLC-QTOF/MS分析，茵芋苷在體內進行了廣泛代謝，如表1、圖1所示，在血漿、尿液、膽汁及糞便中，除原形藥物外共檢測到10種代謝物。在鑒定出的10種化合物中，M6、M7和M10僅在灌胃給藥方式中檢測到；M9僅在靜脈給藥方式中檢測到；M4、M5和M7在血漿、尿液、膽汁及糞便樣品中均可以檢測到。

用MS相應的百分比表示相對豐度，茵芋苷在血漿、膽汁、尿液和糞便中的各代謝物的相對豐度見圖4。其中，給藥后血漿中主要為7-羥基香豆素和7-羥基香豆素的還原及甲基化代謝產物；膽汁中主要為茵芋苷、茵芋苷脫羰基的代謝產物、7-羥基香豆素和7-羥基香豆素的甲基化及葡萄糖苷酸結合的代謝產物；糞便中主要為7-羥基香豆素和7-羥基香豆素脫羥基的代謝產物；尿液中檢測到的代謝產物最多，主要包括茵芋苷、茵芋苷去飽和及脫水的代謝產物、7-羥基香豆素和7-羥基香豆素的甲基化及羥基化的代謝產物。

圖2 茵芋苷及其代謝產物（M1-M4）的二級質譜圖及可能的裂解碎片和機制

圖3 茵芋苷代謝產物（M5-M10）的二級質譜圖及其可能的裂解碎片和機制

圖4 大鼠血漿（A）、尿液（B）、糞便（C）、膽汁（D）中的代謝物相對豐度

3 討論

茵芋苷屬于香豆素家族，存在于許多藥用植物中，包括：麗風毛菊、杭白芷、木橘等。近年來研究報道，茵芋苷對糖尿病腎病引起的腎臟損傷具有保護作用[3]。目前，糖尿病腎病尚無有效的治療方法，在許多患者中，盡管高血糖得到了嚴格控制，但病情仍在繼續惡化，最終由于腎功能衰竭而需要進行透析治療。茵芋苷可能通過調節TGF-β1信號通路，降低血糖水平，在一定程度上可抑制糖尿病腎病，并延緩腎纖維化[3]。因此，茵芋苷被認為是一種具有廣闊前景的預防或減緩糖尿病腎病臨床和病理生理進展的候選藥物。此外，茵芋苷對免疫復合物定位于腎小球上皮下區域所引起的膜性腎病具有保護作用，高劑量的茵芋苷給藥后可顯著減輕腎小管間質損傷[1]。IQBAL等[6]研究表明，茵芋苷對溶組織內阿米巴HM1:IMMS菌株具有良好的抗阿米巴活性。茵芋苷還具有抗腫瘤、抗瘧原蟲和神經保護等活性[14-16]。從廣泛的藥理活性來看，茵芋苷可能是一種潛在的治療藥物。因此，探究茵芋苷藥效物質及其在體內的代謝特征，能為進一步藥理學研究和安全性評價提供依據。

本研究通過UPLC-Q-TOF/MS方法分析了茵芋苷在大鼠體內以灌胃和靜脈注射方式給藥后血漿、膽汁、尿液和糞便中的10種主要的代謝產物，并根據質譜結果對代謝物的結構進行了初步鑒定。結果表明，茵芋苷的主要代謝物不僅在4種生物樣品中存在差異，而且在灌胃和靜脈2種給藥方式中也存在差異。在茵芋苷灌胃給藥后，血漿中檢測到M4、M5、M7，尿液中檢測到M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8，糞便中檢測到M1、M5、M7，膽汁中檢測到P、M6、M7。而在茵芋苷靜脈給藥后，血漿中檢測到P、M4、M5、M8，尿液中檢測到P、M2、M3、M4、M5、M6、M8、M9，糞便中檢測到M4、M5、M8、M10，膽汁中檢測到M1、M3、M4。經分析發現，茵芋苷的代謝途徑包括脫羰、去飽和、脫水和水解，并生成7-羥基香豆素。7-羥基香豆素的代謝途徑包括還原、與葡萄糖苷酸結合、甲基化、磺化、羥基化以及脫羥基。其中尿液中的代謝產物最豐富，這說明大鼠給予茵芋苷后可能主要通過腎臟進行代謝。綜上所述，本研究基于UPLC-Q-TOF/MS分析方法，證明了茵芋苷在大鼠體內進行廣泛代謝，如水解、葡萄糖苷酸結合、氧化、羥基化等，同時為茵芋苷微量代謝物的鑒定提供了實用策略以及為其后續藥理學研究提供了有效信息。