先天性腎上腺發(fā)育不良癥基因-1對垂體瘤細胞自噬和增殖的調(diào)控作用

陳賢斌，胡瓊霜，呂芳芳，盧江龍，李群

1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童呼吸科，浙江 溫州 325027

垂體腺瘤是顱內(nèi)常見的腫瘤[1]，主要包括泌乳素腺瘤、生長激素細胞腺瘤和無功能腺瘤等[2]，其中泌乳素腺瘤是最常見的亞型[3]。目前泌乳素腺瘤首選藥物治療，常用治療藥物有溴隱亭（bromocriptine, BRC）和卡麥角林（cabergoline, CAB），這兩種藥物能夠使80%～90%的患者獲益[4]。但仍有10%～20%的患者對藥物治療不敏感、甚至無效，此類患者往往手術(shù)治療后仍然難以恢復正常的泌乳素水平[5]。因此探尋泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展機制和解決垂體瘤耐藥問題至關(guān)重要。先天性腎上腺發(fā)育不良癥基因-1（dosage-sensitivesexreversaladrenalhypoplasiacongenitaregionontheXchromosome1, DAX-1）基因?qū)儆诤耸荏w（nuclearreceptors, NRs）家族。最近發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系[6]，如乳腺癌[7]、宮頸癌[8]等，但未見其與垂體瘤增殖和自噬的相關(guān)研究。本研究主要討論DAX-1 對垂體泌乳素腺瘤的增殖和藥物敏感性的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料 大鼠垂體瘤（MMQ）細胞系細胞購買于北京中原聚合生物科技有限公司。細胞培養(yǎng)所需的胎牛血清、馬血清，以及F12K細胞培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗購于美國Life公司；TRIzol和RNA抽提試劑購于美國Sigma公司，SYBRGreen、realtimePCRMasterMix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；CCK-8檢測試劑盒和BCA試劑盒購買于北京碧云天生物有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-timequantitativepolymerasechainreaction, RT-qPCR）所需引物由上海生工生物工程有限公司代為設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：MMQ細胞培養(yǎng)于Ham’sF-12K（Kaighn’s）培養(yǎng)基中添加12.5%的馬血清、2.5%的胎牛血清和1%的青霉素/鏈霉素，MMQ細胞培養(yǎng)傳代于上述培養(yǎng)基，并在37℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞生長至密度約70%時進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染：將MMQ細胞轉(zhuǎn)至6孔板，每孔約3×105個細胞，24h后用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA（由上海吉瑪生物技術(shù)公司合成，序列5’-GCACGUGGCUCCUUAGCGAU-3’）轉(zhuǎn)染至MMQ細胞敲低DAX-1的表達（DAX-1KD組）；DAX-1過表達質(zhì)粒（上海吉瑪公司合成）轉(zhuǎn)染至MMQ細胞提高DAX-1的表達（DAX-1OE組），6h換液，48h后收獲細胞繼續(xù)培養(yǎng)；并設正常對照組（NC組）。

1.2.2 細胞增殖實驗：將預處理后的MMQ細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板（5×103個細胞/孔），分別培養(yǎng)24、48、72、96h后，根據(jù)CCK-8使用說明，每個孔加入10μLCCK-8溶液后，37℃孵育1～2h，用酶標儀在450nm處讀取吸光度，并依據(jù)（A450樣品-A450背景/A450對照-A450背景）計算細胞相對活性，每個樣本設3個復孔；其中為了探究DAX-1對CAB和BRC的藥物治療有無促進作用，用CAB和BRC與DAX-1過表達共同作用于MMQ細胞。克隆實驗：預處理的MMQ細胞（1×103細胞/孔）被接種到6孔板上培養(yǎng)14d，在肉眼可見克隆形成后去除培養(yǎng)基，并用4%多聚甲醛室溫固定15min，然后用1%結(jié)晶紫染色液染色10min，0.9%NaCl溶液反復沖洗干凈、拍照。

1.2.3 RT-qPCR實驗：使用TRIzol試劑分別提取經(jīng)過預處理的MMQ細胞中的總RNA，然后進行濃度測定和純度判斷，按照分光光度計讀數(shù)2.0＞A260/A280＞1.8判斷純度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模版，每個樣本RNA總量為1000ng，然后按照SYBRGreen、RealtimePCRMasterMix試劑盒的操作要求行RT-qPCR，每個樣本設3個復孔。獲取數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)處理，計算實驗組相對于對照組的自噬相關(guān)基因表達倍數(shù)的變化，引物序列見表1。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）檢測：細胞和組織樣本用無菌管收集，并用冷PBS洗滌兩次去除雜質(zhì)，然后利用超聲破碎儀破碎細胞和組織，加入適量的RIPA細胞蛋白裂解液裂解樣本獲取總蛋白；然后用BCA方法標定蛋白濃度，每個樣本上樣40μg蛋白總量，SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜蛋白樣本并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉1～2h后用相應的蛋白一抗在4℃孵育過夜。然后在室溫下，將膜與HRP標記的二抗孵育1h，TBST洗膜3次后顯影，具體抗體見表2。

表1 RT-qPCR所用引物序列

表2 Westernblot實驗所用抗體信息

1.2.5 免疫熒光實驗：預處理的細胞爬片用PBS緩沖液輕輕洗3次，每次5min，用4%多聚甲醛浸沒爬片，室溫固定15min。然后用0.1%的TrionX-100破膜15min，PBS緩沖液洗3次。接下來用3%的BSA室溫封閉30min后，加入LC3抗體（稀釋比例1:100），浸沒爬片，然后4℃冰箱平放過夜。過夜后獲取爬片，PBS緩沖液洗3次后加入熒光二抗（invitrogen，A-11008），室溫下避光孵育1h，PBS洗3次后用抗熒光淬滅劑封片處理后于倒置熒光顯微鏡下拍片。

1.2.6 裸鼠移植瘤實驗：動物實驗經(jīng)溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批[實驗動物許可證號：SYXK（浙）2021-0007）]，5周齡的雌性BALB/c無胸腺裸鼠購自上海實驗動物研究中心，將不帶有血清的NC組MMQ細胞株和DAX-1KD組MMQ細胞株（5×106）用基質(zhì)凝膠和PBS緩沖液（美國BD生物公司，#356234）混勻后，皮下注射到每只裸鼠的左背部。當肉眼可見皮下腫瘤生成時，每4d用游標卡尺記錄下腫瘤的長徑（a）和短徑（b），a×b2/2計算腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。24h后麻醉處死小鼠，獲取腫瘤，拍照并提取腫瘤蛋白標本。

1.2.7 轉(zhuǎn)錄組基因芯片及分析方法：本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準（編號：2016-082）。將垂體瘤和正常垂體標本利用TRIzol提取總RNA，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄后移交上?；菅猩锟萍加邢薰?，采用IlluminaHiseq2000測序平臺的單端50bp測序模式對核酸樣本進行高通量測序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過引物與adaptor序列去除并經(jīng)過對測序片段3’端的質(zhì)量檢驗，并選擇質(zhì)量可靠的測序片段而將低質(zhì)量堿基動態(tài)從3’末端刪除以最終保留高測序質(zhì)量的堿基片斷。保留的測序序列（remainedreads）片斷用于后續(xù)RNA-Seq項目分析模塊的分析。然后將獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化分析，以差異倍數(shù)（Log2FC）＞2，P＜0.05為準，進行篩選繪制熱圖和火山圖；本研究另一項侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體瘤差異表達數(shù)據(jù)來源于GEODataSets數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/，GSE51618），利用內(nèi)置GEO2R軟件分析獲得DAX-1差異表達數(shù)據(jù)，然后進行統(tǒng)計學分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用GraphpadPrism8.0軟件和SPSS20.0軟件進行作圖和數(shù)據(jù)分析。計量資料用±s 表示，兩組間比較用獨立樣本t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DAX-1在垂體瘤和侵襲性垂體瘤中的表達水平 利用高通量測序技術(shù)，篩選4例正常垂體和12例垂體瘤標本中的轉(zhuǎn)錄組水平差異，按照差異倍數(shù)2倍以上、P＜0.05 的要求篩選差異基因，見圖1A；分析火山圖發(fā)現(xiàn)DAX-1 在垂體瘤組織中表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1B和圖1C；與非侵襲性垂體瘤比，用GEO基因數(shù)據(jù)集篩選出GSE51618數(shù)據(jù)集中侵襲性垂體瘤中DAX-1的表達水平也降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1D。

2.2 DAX-1對MMQ細胞生長增殖的調(diào)控 與NC組比，DAX-1OE組細胞活性在72h和96h明顯低于NC組，而DAX-1KD組細胞活性明顯高于NC組（P＜0.05），見圖2A；平板克隆實驗顯示，與NC比，DAX-1OE組克隆形成數(shù)目減少，而DAX-1KD組與NC組比較細胞克隆形成數(shù)目增加，見圖2B。與NC組比，DAX-1OE組CAB和BRC對MMQ細胞活性的抑制能力更強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2C和2D，提示DAX-1可能能夠促進CAB和BRC對MMQ細胞的藥物殺傷作用。

圖1 DAX-1 基因在垂體瘤中表達情況比較

圖2 DAX-1 對MMQ細胞增殖的調(diào)控

2.3 敲低DAX-1 對MMQ細胞內(nèi)自噬的影響 檢測MMQ細胞內(nèi)自噬相關(guān)基因mRNA表達水平，與NC組比，DAX-1KD組中自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7和ATG12的mRNA表達水平顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3A；Westernblot實驗顯示與NC組比，DAX-1KD組細胞內(nèi)自噬標記蛋白LC3-II和P62的表達也降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3B；免疫熒光實驗證明LC3蛋白在DAX-1 敲低后顯著下降，見圖3C。

2.4 敲低DAX-1對MMQ細胞體內(nèi)生長和自噬的影響 每4d一次記錄腫瘤生長曲線，MMQ細胞裸鼠移植瘤模型實驗結(jié)果顯示，DAX-1KD組MMQ細胞移植瘤

3 討論

垂體腺瘤尤其是垂體泌乳素腺瘤屬于臨床常見內(nèi)分泌腫瘤，以中青年女性患者多見，成人患者男女比例約1:10，據(jù)統(tǒng)計我國每年新增泌乳素腺瘤患者人數(shù)約有10萬人[3]，其臨床癥狀重、治療難度大、復發(fā)率高[9]，主要臨床表現(xiàn)為由高泌乳素血癥引起的異常乳汁分泌、性功能減退、不孕不育、體質(zhì)量增加等，同時由于巨大腫瘤的壓迫效應，引起局部顱內(nèi)壓力增高而導致頭痛、視力下降甚至失明等，藥物甚至手術(shù)均無法完全解決泌乳素腺瘤引起的各種臨床癥狀[10]。以往的研究表明，神經(jīng)生長因子受體異常表達和PRDM2、PRB3等表達減少是垂體瘤發(fā)生發(fā)展或耐藥的重要原因，但許多關(guān)鍵機制目前仍然不清楚。本研究通過探索DAX-1 基因與泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展和藥物治療敏感性的相關(guān)性，旨在發(fā)現(xiàn)泌乳素腺瘤臨床治療的新靶標。

DAX-1 家族是一類配體激活轉(zhuǎn)錄因子家族，在個體的發(fā)育、代謝、分化以及其他各種疾病的發(fā)生發(fā)展中充當重要的角色[11]。1994年最初發(fā)現(xiàn)DAX-1位于X染色體的短臂（Xp21）上，其與腎上腺發(fā)育不良相關(guān)[12]。作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，DAX-1 等異常表達或突變往往與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)：例如DAX-1 的過度表達往往能夠與SF-1 協(xié)同發(fā)揮作用從而引起小兒腎上腺皮質(zhì)癌的發(fā)生[13]；與正常的肝細胞組織比，在肝細胞癌中DAX-1 的表達下降，而分子機制研究表明DAX-1能夠結(jié)合β-catenin蛋白，從而抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，抑制肝癌細胞的增殖能力[14]；在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)雄激素能夠誘導DAX-1的表達上升，而DAX-1能夠通過轉(zhuǎn)錄抑制作用抑制乳腺癌MCF-7細胞株中芳香酶的產(chǎn)生，從而抑制乳腺癌細胞的生長[15]。但目前為止鮮見DAX-1調(diào)控垂體瘤發(fā)生發(fā)展或藥物治療的相關(guān)研究。本研究發(fā)現(xiàn)DAX-1在垂體瘤中表達降低，并且過表達DAX-1能夠抑制大鼠泌乳素瘤MMQ細胞增殖，而敲低DAX-1能夠促進MMQ細胞的體內(nèi)外增殖速度，因此DAX-1可能是和垂體泌乳素腺瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要基因。

自噬是廣泛存在于哺乳動物細胞內(nèi)的降解-再循環(huán)系統(tǒng)，自噬對細胞中蛋白質(zhì)降解、細胞器更新、細胞穩(wěn)態(tài)維持起到重要的作用[16]，自噬在泌乳素腺瘤的藥物治療機制中發(fā)揮極其重要的作用。多巴胺5型受體（dopaminetype5receptor, DRD5）激動劑SKF83959能夠通過誘導ROS的積聚促進自噬的發(fā)生，引起MMQ細胞的自噬性死亡，并且DRD5激動劑能夠有效抑制AKT/mTOR信號通路，該通路是自噬發(fā)生的重要通路[17]；研究還發(fā)現(xiàn)臨床一線抗瘧藥物氯喹能夠有效增加CAB對MMQ細胞的殺傷作用，敲除自噬相關(guān)基因ATG7能顯著逆轉(zhuǎn)CAB誘導的細胞死亡[18]。長鏈非編碼RNAH19和miR-93a能夠通過調(diào)控ATG7 基因調(diào)控泌乳素瘤細胞的增殖速度和藥物敏感性[19-21]。而本研究發(fā)現(xiàn)敲低DAX-1能夠促進MMQ細胞的生長并且抑制自噬，而過表達DAX-1 又能夠促進CAB和BRC的藥物作用強度，體內(nèi)實驗結(jié)果也提示敲低DAX-1能夠抑制自噬相關(guān)蛋白的表達。因此，DAX-1 介導的自噬可能和垂體泌乳素腺瘤的增殖以及藥物治療敏感性具有一定的相關(guān)性。但本研究未深入探索DAX-1 調(diào)整細胞內(nèi)自噬水平的具體分子機制，有待后續(xù)研究。

圖4 敲低DAX-1 對垂體瘤細胞體內(nèi)生長和自噬的影響